BIOMARCADORES DE GENOTOXICIDAD.

ALCANCES Y LIMITACIONES

DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA CLINICA-INFIBIOC.Facultad de Farmacia y Bioqumica.

Universidad de Buenos Aires

CIGETOX- CITOGENETICA HUMANA Y GENETICA TOXICOLOGICA

Prof. Dra. Marta Ana CarballoProf. Dra. Marta Ana Carballo

ENTORNO / AMBIENTE

EVENTOS BIOLGICOS TEMPRANOS

EVENTOS BIOLGICOS TARDOS

ENFERMEDAD CLNICA

La Gentica Toxicolgica es la unin de dos grandes reas del conocimiento como son la Toxicologa y la Gentica.

Identifica y analiza la accin de los agentes con toxicidad dirigida hacia los componentes hereditarios de los

organismos vivos.

1927 - Muller - radiaciones 1947 - Auerbach - agentes qumicos 1953 - Watson y Crick - ADN 1969 - Alexander Hollaender - EMS

Determina el impacto que los distintos agentes Determina el impacto que los distintos agentes (f(fsicos, qusicos, qumicos, biolmicos, biolgicos) pueden tener sobre gicos) pueden tener sobre

el material genel material genticotico

Trata de establecer la relaciTrata de establecer la relacin entre mutagenesis n entre mutagenesis e iniciacie iniciacin del proceso neopln del proceso neoplsicosico

Componentes celulares proclives a los Componentes celulares proclives a los procesos mutagprocesos mutagnicosnicos

Dao severo del ADN

Errores en la reparacin del ADN

Arresto del ciclo celular

Si hay una lesin en el ADN

Reparacin del ADN

Proliferacin normal

Proliferacin anormal Apoptosis Necrosis

MicromutacionesMacromutaciones

Tipos y frecuencias de dao en el ADN

Tipo de dao en ADN(SSB) Ruptura de simple cadena

Metilacin de la Guanina N7

Depurinacin

Metilacin de la Guanina O6

Oxidacin del ADN

Depirimidacin

Deaminacin de la Citosina

(DSB) Rupturas de doble cadena

Tipo de dao en ADN(SSB) Ruptura de simple cadena

Metilacin de la Guanina N7

Depurinacin

Metilacin de la Guanina O6

Oxidacin del ADN

Depirimidacin

Deaminacin de la Citosina

(DSB) Rupturas de doble cadena

Eventos/da/clula120.000

84.000

24.000

3.120

2.880

1.320

360

9

Eventos/da/clula120.000

84.000

24.000

3.120

2.880

1.320

360

9

% de dao total diario50,9

35,6

10,2

1,3

1,2

0,5

0,2

0,01

% de dao total diario50,9

35,6

10,2

1,3

1,2

0,5

0,2

0,01

AGENTE GENOTOXICOAGENTE GENOTOXICO

Rayos X ROS

Agentes alquilantes

Rayos X ROS

Agentes alquilantes

LESIONESLESIONES

Luz UV Hidrocarburos

policclicosaromticos

Luz UV Hidrocarburos

policclicosaromticos

RILuz UVAgentes

antitumorales

RILuz UVAgentes

antitumorales

Errores de replicacin Errores de replicacin

PROCESOS DE REPARACIONPROCESOS DE REPARACION

8-oxidGRupturas de

simple cadena

8-oxidGRupturas de

simple cadena

FotoproductosAductos

Dmeros de pirimdinas

FotoproductosAductos

Dmeros de pirimdinas

Enlaces cruzados

Rupturas de doble cadena

Enlaces cruzados

Rupturas de doble cadena

Reparacin por escisin de

bases(BER)

Reparacin por escisin de

bases(BER)

Reparacin por escisin de nucletidos

(NER)

Reparacin por escisin de nucletidos

(NER)

Recombinacin Homloga (HR)

Reunin de extremos no

homlogos (NHEJ)

Recombinacin Homloga (HR)

Reunin de extremos no

homlogos (NHEJ)

Reparacin deMal

apareamiento (MMR)

Reparacin deMal

apareamiento (MMR)

A-GT-C

Inserciones Deleciones

A-GT-C

Inserciones Deleciones

B

I

O

M

A

R

C

A

D

O

R

E

S

DE EXPOSICIN: Seala presencia de sustancia exgena o metabolitos, o producto de interaccin entre agente y molcula blanco.

DE SUSCEPTIBILIDAD: Indicador de limitacin adquirida o inherente de un organismo para responder a la exposicin a un xenobitico.

DE RESPUESTA BIOLOGICA: representa representa estadestadosos del proceso de dadel proceso de dao. Representan o. Representan alteraciones genalteraciones genticasticas

DE ENFERMEDAD: manifestaciones preclnicas o tempranas de la enfermedad.

DE DAO BIOLOGICO EFECTIVO: Indica que el txico ha producido algn tipo de dao en el organismo.

INTERNO DE DOSIS : Indica que el txico ha entrado al orgsnimo..

DE EFECTO: Indicador de una alteraciIndicador de una alteracin n bioqubioqumica, fisiolmica, fisiolgica o gengica o gentica, resultado de la tica, resultado de la exposiciexposicin a un xenobin a un xenobiticotico.

EVALUACION NIVELES DE COMPLEJIDAD

CRECIENTE

PRIMARIO (Bacteriano, Viral) (I)

SECUNDARIO (Cultivo de clulas) (II)

TERCIARIO (Organismo entero) (III)

CUATERNARIO (Epidemiolgico) (IV)

Niveles de EvaluaciNiveles de Evaluacinn

PRIMER NIVEL (I)PRIMER NIVEL (I) SEGUNDO NIVEL (II)SEGUNDO NIVEL (II)

CUARTO NIVEL (IV)CUARTO NIVEL (IV)TERCER NIVEL (III)TERCER NIVEL (III)

Nivel Molecular o bacterianoNivel Molecular o bacteriano

Ensayos en procariotes o Ensayos en procariotes o eucariotes inferioreseucariotes inferiores

Ejemplo: Test de Ames ; Ejemplo: Test de Ames ; Bacillus subtiliusBacillus subtilius

Nivel Nivel In vitroIn vitroEnsayos en cultivos de cEnsayos en cultivos de clulas lulas

eucariotaseucariotasEjemplo: LEjemplo: Lneas celulares CHO, neas celulares CHO,

V79, Hela , Linfocitos de Sangre V79, Hela , Linfocitos de Sangre PerifPerifricarica

Nivel Nivel In vivoIn vivo

Ensayos organismo enteroEnsayos organismo entero

Ejemplos: Plantas, animales Ejemplos: Plantas, animales (invertebrados o vertebrados) y (invertebrados o vertebrados) y humanos expuestoshumanos expuestos

Nivel EpidemiolNivel Epidemiolgicogico

Ensayos en poblaciones Ensayos en poblaciones expuestasexpuestas

Ejemplo: exposiciEjemplo: exposicin n accidental, terapaccidental, teraputica o laboral utica o laboral de individuos expuestosde individuos expuestos

Principales Ensayos Utilizados en Gentica Toxicolgica

Mutaciones GnicasTest de AmesEnsayo de reversin a triptofano en E.coliMutaciones gnicas en cultivo de clulas de mamfero (HPRT o TK)Mutaciones recesivas ligadas al sexo en Drosophila

Evaluaciones citogenticas en clulas de mamferoEnsayo de aberraciones cromosmicasEnsayo de intercambio de cromtides hermanasEnsayo del microncleoEvaluacin de Aneuploidas

Otros ensayosDao y reparacin en clulas de mamferoEstudios de recombinacin mittica en levaduras y/o Drosophila

Ensayo del locus especfico en ratnEnsayo del letal dominanteAnlisis citogentico y Ensayo de traslocaciones heredablesEnsayo de alteraciones esquelticas en ratn

ALCANCES

DISEDISEO DE PROTOCOLOS PARA EVALUACION DE O DE PROTOCOLOS PARA EVALUACION DE DROGAS, ADITIVOS, MEDICAMENTOS, Y DROGAS, ADITIVOS, MEDICAMENTOS, Y COMPUESTOS QUIMICOS EN GENERALCOMPUESTOS QUIMICOS EN GENERAL

METODOLOGIAS DIAGNOSTICAS PARA LA METODOLOGIAS DIAGNOSTICAS PARA LA CARACTERIZACION DE DACARACTERIZACION DE DAO EN SINDROMES DE O EN SINDROMES DE

INESTABILIDAD CROMOSOMICAINESTABILIDAD CROMOSOMICA

MONITOREO DE INDIVIDUO / S EXPUESTOS EN MONITOREO DE INDIVIDUO / S EXPUESTOS EN FORMA LABORAL, ACCIDENTAL O TERAPEUTICAFORMA LABORAL, ACCIDENTAL O TERAPEUTICA

Las agencias internacionales de regulacin han seleccionado grupos de biomarcadores de efecto con el

objeto de lograr la mejor y ms segura caracterizacin del dao,

evaluando tanto in vitro como in vivo la genotoxicidad potencial.

OPPTS: OFFICE OF PREVENTION, PESTICIDES AND TOXIC SUBSTANCES (EPA)

OECD: ORGANIZATION FOR ECONOMIC COOPERATION AND DEVELOPMENT (FDA)

Guidelines Guidelines

S2A: Aspectos especficos de regulacin de Ensayos de genotoxicidad

S2B: Genotoxicidad: Una batera standard para el ensayo de genotoxicidad de productos farmacuticos

Los Comit Internacionales de Armonizacin (ICH) sugieren la realizacin de bateras de ensayos constituidas por:

un ensayo de reversin en bacterias un estudio citogentico para detectar dao cromosmico (test de

aberraciones cromosmicas) o un estudio in vitro para mutaciones gnicas)

un test in vivo para genotoxicidad que detecte dao cromosmico (aberraciones cromosmicas o test de microncleo en ratn)

Desarrollo de cepas de S.typhimurium auxtrofas para histidina que permiten evaluar la retromutacin de este organismo a histidina (+ ).

Es decir que una especie que ha perdido una caracterstica, vuelve a adquirirla en base a otra mutacin.

TA100, TA98, TA1535, TA1537, TA102, TA104

rfa, uvr B, plsmido pKM101, plsmido pAQ1

Test de Salmonella o Test de Ames

UN ESTUDIO CITOGENETICO PARAUN ESTUDIO CITOGENETICO PARADETECTAR DADETECTAR DAO CROMOSOMICOO CROMOSOMICO

(TEST DE ABERRACIONES (TEST DE ABERRACIONES CROMOSOMICAS )CROMOSOMICAS )

O O UN ENSAYO IN VITRO PARA DETECTAR UN ENSAYO IN VITRO PARA DETECTAR

MUTACIONES GENICASMUTACIONES GENICAS(MOUSE LYMPHOMA ASSAY)(MOUSE LYMPHOMA ASSAY)

ABERRACIONES CROMOSMICAS

Detecta alteraciones numrica y estructurales.

Se basa en evidenciar cambios en la morfologa de los cromosomas o en su nmero pudiendo detectar modificaciones de ploida.

Se utiliza para determinar el efecto clastognico y/o aneungeno de las drogas en estudio.

Es el test ms utilizado histricamente para evaluacin de drogas.

Metafase Parcial de Linfocitos de Sangre Perifrica con Aberraciones Cromosmicas

Metafase Parcial de lnea celular CHO con Aberraciones Cromosmicas

IM =IM =NNcelcel en en estadestadosos de mitosis/de mitosis/NN total total celcel interfaseinterfase

Tcnica de coloracin diferencial de cromtideo FPG- fluorescencia plus giemsa

IR= N cl. M1+2 N cl. M2 + 3 N cl. M3/100

Se puede realizar en distintas lneas celulares

L5178Y linfoma de ratn (TK)TK6 lnea linfoblastoide humana (HGPRT)

Ambos ensayos se basan en la adquisicin de resistencia a un producto. Lnea normalno crece en presencia del producto.Lnea mutada crece en presencia del producto.

Para TK se seleccionan por resistencia a Trifluorotimidina.Las clulas deficientes en HPRT son seleccionadas por resistencia a la 6-tioguanina u 8 azaguanina.

Ensayo de Mutaciones Gnicas en Clulas de Mamfero

UN TEST IN VIVO PARA UN TEST IN VIVO PARA GENOTOXICIDAD QUE DETECTE GENOTOXICIDAD QUE DETECTE

DADAO CROMOSOMICOO CROMOSOMICO

(ABERRACIONES CROMOSOMICAS (ABERRACIONES CROMOSOMICAS O TEST DE MICRONUCLEO EN O TEST DE MICRONUCLEO EN

RATON)RATON)

Evento Genotxico

MN MN

Mala segregacin Dao al ADN

Defectos en: Huso mittico Centrmero Mala condensacin cromosmica

Roturas de ADN Errores de reparacin

GuidelinesGuidelines

S2 R1: Ensayos de genotoxicidad e Interpretacin de datos para Productos farmacuticos de uso Humano

un ensayo de reversin en bacterias un estudio citogentico para detectar dao cromosmico (test de aberraciones cromosmicas o , o TEST DEL MICRONCLEO in vitro o ensayo de mutaciones gnicas)un test in vivo para genotoxicidad que detecte dao cromosmico (aberraciones cromosmicas, test de microncleo en ratn, TEST DEL COMETA)

un ensayo de reversin en bacterias un test in vivo para genotoxicidad UTILIZANDO DOS TEJIDOS , uno que detecte dao cromosmico (aberraciones cromosmicas, test de microncleo en ratn) Y OTRO ENSAYO IN VIVO COMO TEST DEL COMETA, UDS, TRANSGENIC MOUSE MUTATION ASSAY)

Clula Binucleada con MN

BLOQUEODE LA

CITOCINESIS

AGENTES GENOTXICOS

CITOCALASINA B

Inhibe la polimerizacin

de actina

No se forma el anillo

contrctil

Ensayo de MNCB

MICRONCLEOS

CARACTERSTICAS

Redondo u oval

Borde liso y uniforme

Igual plano focal que ncleo

No ser refringente

1/16 y 1/3 del dimetro del ncleo

Igual coloracin y textura que ncleo

No superpuesto ni conectado

Se analizan 1000 clulas BN

Expresin de resultados: N MN/1000 clulas BN

Frec. clulas BN con MN en 1000 BN

DETECTA

Roturas de ADN simple cadena.

Roturas de ADN doble cadena.

Sitios Alcali lbiles.

ADN-ADN y ADN-prot cross linking.

Roturas simples asociadas con

mecanismos de reparacin

incompletos

ANALISIS DE RESULTADOSCONTEO VISUAL

Se deben contar 50 cometas/vidrio. 2 vidrios/muestra. Total: 100 clulas por

muestra.

Estableciendo Categorias de Dao:1:< 20 micras2: 20-40 micras3: 40-80 micras4: > 80 micras

ID= n1+2 n2+ 3 n3+4 n4, siendo n la cantidad de clulas daadas que se

registraron para cada una de las cuatro categoras.

SINDROMES DE SINDROMES DE INESTABILIDAD INESTABILIDAD CROMOSOMICACROMOSOMICA

Inestabilidad cromosInestabilidad cromosmica:mica:Rearreglos, comportamiento citogenticoanormal. Causas:

Mutaciones de protenas involucradas en la replicacin y reparacin del ADN.

Fallos en puntos de control del ciclo celular. Anomalas centrosmicas. Defectos en la segregacin. Mal funcionamiento de los telmeros. Recombinacin homloga vinculada a la reparacin de

roturas de ADN de doble hebra.

ClasificaciClasificacinnSndromes clsicos

Anemia de Fanconi Sndrome de Bloom Ataxia Telangiectasia

Sndromes menos frecuentes Nijmegen breakage ICF Cockayne Xeroderma Pigmentosa

Otros Riyadh Rothmund-Thompson Radial-renal Craniostenosis-Microcefalia Dubowitz

factores intrnsecos hereditariosCarcinognesis Ambiental

exposicin a agentes carcinognicos

Defectos en la replicacin o Incremento en el riesgo Reparacin del ADN de cncer

Dependiendo del sndrome, el comportamiento anormal tomar la forma de:

Frecuencia elevada de aberraciones espontneas Niveles elevados de intercambio de cromtides hermanas Hipersensibilidad cromosmica a Xenobiticos Rearreglos cromosmicos estables o recurrentes

Predisposicin a tumoresCaractersticas en comn Inmunodeficiencia

Retardo en el crecimiento

SINDROMES DE INESTABILIDAD SINDROMES DE INESTABILIDAD CROMOSOMICACROMOSOMICA

Es autosmica recesiva.Mayor frecuencia en judos Askenaziy japoneses. Presentacin: microcefalia, alteraciones de piel y deficiencia inmunolgicas. Poseen inteligencia normal.Riesgo: desarrollan distintos tipos de cncer y leucemias agudas.Pronstico de vida: la edad promedio de vida son los 24 aos (14 a 49).

Caractersticas citogenticas::rupturas de cormosomas dando figuras de cuadriradiales e intercambio de cromtides hermanas.El diagnstico citogentico se hace mediante ICH espontneo, (90 o ms) .El gen afectado es el BLM que se encuentra en 15q26.1

SINDROME DE BLOOMSINDROME DE BLOOM

Autosmica recesiva.Presentacin.: retardo mental, malformaciones esquelticas, anomalas en piel, anemia severa. Riesgo: desarrollan sindromesmielodisplsicos y LMAPronstico de vida: La edad de sobrevida es hasta los 16 aos y la causa de muerte es hemorragia y sepsis asociado a sindromes mielodisplsicos.Tipos: 7 grupos . Los genes involucrados se describen como FANC y se adicionan las letras que van desde A hasta G. Por ahora los de peor pronstico son los del grupo G.

ANEMIA DE FANCONIANEMIA DE FANCONI

Caractersticas citogenticas: alteraciones estructurales espontneas que se ven incrementadas cuando se exponen los cultivos a agentes inductores de cross-linking. Para el diagnstico se utiliza DEB.

Autosmica recesiva, Ataxia cerebelar y telangiectasiaocular, nariz y orejasNo reconocen mecanismos de reparacin de DSBPresentacin: segundo ao de vida con ataxia cerebelar progresiva, disartria y distona. Riesgo: de leucemia y linfomas y tumores de piel, ovario, mama y estmago.Pronstico de vida: hasta la 4dcada con medicacin permanante.

Caractersticas citogenticas:Incremento de alteraciones tipo cromtide, roturas cromosmicas, triradiales y cuadriradialesGen ATM 11q22-q23.1Diagnstico citogentico mediante exposicin a rayos X o radiomimticos (BLM)

ATAXIA TELANGIECTASIAATAXIA TELANGIECTASIA

BIOMONITOREO BIOMONITOREO DE INDIVIDUOS DE INDIVIDUOS

EXPUESTOSEXPUESTOS

MONITOREO DE INDIVIDUOS EXPUESTOS A MONITOREO DE INDIVIDUOS EXPUESTOS A CITOSTATICOSCITOSTATICOS

EdadEdad Tiempo de Tiempo de trabajotrabajo

SexoSexo Manifestaciones clManifestaciones clnicasnicas

AA 2828 2 a2 aosos FF Lagrimeo/ Lagrimeo/ rinorrearinorrea y descamaciy descamacin en pieln en piel

BB 3232 3 a3 aosos MM Lagrimeo/ fotofobiaLagrimeo/ fotofobia

CC 3232 9 a9 aosos MM IrritaciIrritacin visual/sequedad n visual/sequedad nasal/nasal/oligoazoospermiaoligoazoospermia

DD 3333 2 a2 aosos FF IrritaciIrritacin visual/sequedad en pien visual/sequedad en pie

EE 5454 9 a9 aosos FF Sin sSin sntomas ntomas

FF 4646 25 a25 aosos FF Sequedad conjuntivalSequedad conjuntival

GG 3636 2 a2 aosos FF DescamaciDescamacin/blefaritis/sequedad conjuntivaln/blefaritis/sequedad conjuntival

MONITOREO DE INDIVIDUOS EXPUESTOS A MONITOREO DE INDIVIDUOS EXPUESTOS A CITOSTATICOSCITOSTATICOS

IMIM IRIR ICHICH MNMN

AA 2.52.5 1.61.6 7.37.3 0.480.48 3.923.92

BB 2.22.2 1.51.5 5.945.94 1.281.28 2.882.88

CC 2.32.3 1.481.48 7.467.46 0.650.65 12.6612.66

DD 3.63.6 1.651.65 6.96.9 0.980.98 11.9911.99

EE 3.23.2 1.611.61 6.186.18 0.640.64 15.2915.29

FF 2.52.5 1.451.45 7.937.93 1.131.13 32.5032.50

GG 2.72.7 1.381.38 8.428.42 020020 16.2016.20

CONTROL: IM:1.5 CONTROL: IM:1.5 --6.8 IR: 1.36.8 IR: 1.3--2.4 ICH : 22.4 ICH : 2--7.8 MN: 37.8 MN: 3--2323

ESTRATEGIASESTRATEGIAS 5 de los individuos presentan valores en el rango de 5 de los individuos presentan valores en el rango de

los controles histlos controles histricos y de la literaturaricos y de la literatura

En tres casos alguno o varios de los biomarcadores En tres casos alguno o varios de los biomarcadores se encuentran modificados con respecto a los se encuentran modificados con respecto a los valores controlvalores control

Se sugiere la repeticiSe sugiere la repeticin luego de pasado un mn luego de pasado un mnimo nimo de 6 meses para analizar comportamiento celular de 6 meses para analizar comportamiento celular con el mismo biomarcador alterado y/o la con el mismo biomarcador alterado y/o la introducciintroduccin de una nueva metodologn de una nueva metodologa que aporte a que aporte mayor sensibilidad.mayor sensibilidad.

LIMITACIONES

MOTIVO DE APLICACIMOTIVO DE APLICACIN DEL ESTUDION DEL ESTUDIO

ELECCION DEL/LOS BIOMARCADORESELECCION DEL/LOS BIOMARCADORESANAMNESISANAMNESIS

INTERPRETACION DEL RESULTADOINTERPRETACION DEL RESULTADOFACTORES CONFUNDENTESFACTORES CONFUNDENTES

Muchas Gracias por su atencin !!!

CIGETOX

Prof. Dra. Marta Ana Carballo

Dra. Marcela Lpez Nigro- Bioq. Victoria ArroyoLic. y Ms. Susana Bartolotta

Becarios Doctorado: Bioq. Catalina Cortada; Bioq. Fernanda Simoniello; Bioq. Natalia CasanovaBecarios Iniciacin: Med. Gabriel Angeleri- Lic. Erika Portmann

Tesistas de Licenciatura: Estud. Silvana Curieses- Estud. Natalia Balarino