DNA recombinante

El DNA contiene la informacin

biolgica de los seres vivos

Clula procariota Clula eucariota

access.mmhs.ca

Productos biotecnolgicos

Productos de ADN recombinante

Ejemplos. Enzimas recombinantes (Insulina, activador tisular de plasmingeno)

Anticuerpos monoclonales o recombinantes (Antivenenos)

Hormonas recombinantes (Hormona de crecimiento)

Citoquinas recombinantes (Interferon alfa, IL-11)

Receptores solubles recombinantes (Receptor de TNF)

Vacunas recombinantes (Anti hepatitis B)

Factores de coagulacin recombinantes (Factor VIII)

Requerimientos para Producir

Protenas Recombinantes

1) Gen de inters

2) Vector

3) Clula para clonacin del gen de inters

4) Clula para expresin de la protena codificada por el gen de inters

Vector

DNA pequeo (proveniente de virus, bacterias, levaduras) que puede ser

introducido y mantenido en una clula

(procariota o eucariota) y en el que se

puede injertar un fragmento de DNA con

el fin de ser clonado.

Clulas anfitrionas:

Eucariotas, procariotas

Tipos de Vectores

Plsmidos

http://products.invitrogen.com/ivgn/product/K30001

Plsmidos Recombinantes

http://www.freepatentsonline.com/6803225-0-large.jpg

Tipos de Vectores

Virus, bacterifagos

Csmidos Sitios cos + plsmido

Cromosomas artificiales de levaduras (YACs)

Cromosomas artificiales de bacterias BAC

Plsmido F

PAC Plsmido P1

Produccin de Vector

Recombinante

2. Secuenciamiento 1. Aislamiento gen de inters

3. Recombinacin

Clonacin

1) Aislamiento y purificacin del DNA de inters

2) Escogencia de la clula hospedera y del vector de clonacin.

3) Obtencin del vector recombinante

4) Trasformacin, transfeccin del vector recombinante en clula hospedera

5) Seleccin de clulas que contienen DNA recombinante

6) Deteccin de los clones que contienen el DNA de inters

4.Transformacin/transfeccin

6. Seleccin del clon 5. Crecimiento celular, expancin clonal

Algunas figuras tomadas de Lodish, 5th Ed

Clonacin

Purificacin plsmidos recombinantes

Clulas Anfitrionas

Bacterias Escherichia coli (E. coli)

Eucariotas Levaduras

Saccharomyces cerevisiae(S. cerevisiae), Pichia pastoris (P. pastoris)

Clulas de insectos

Lneas celulares mamferas Clulas derivadas de ovario de hmster chino

(CHO)

Traduccin Introduccin de

secuencias que permitan

el reconocimiento del

mRNA por los ribosomas

Optimizacin de la

traduccin

(Utilizacin preferencial

de codones)

Introduccin de seales

que garanticen

estabilidad de la

protena

Introduccin de seales

que garanticen la

secrecin de la protena

http://palaeos.info/bacteria/glossary/glossary1.html

Sistemas de Expresin

Procariotes E. coli

Cuerpos de inclusin

Eucariotes Levaduras

S. cerevisiae

P. pastoris

Clulas de insectos

Secretan

17

Expresin de P.R. en E. coli

Glargina

Adaptado de Vajo Z et al. Endocr Rev 2001 22: 706-717

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

24 25 28 26 29 27 30

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly

Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala

Gly

Arg Arg

By-product profile influenced by folding and cleavage Insulin biosimilars

S S

SS S

S

E.coli cell

Inclusion body

Fusion protein

Preproinsulin

Insulin

Folding

conditions

influence

by-product

pattern

Cleavage

enzyme:

specificity &

selectivity

Typical

operations for

inclusion body

processes

5. Isolation of cells

6. Cell disruption via

homogeniser

7. Isolation and purification

of fusion protein

8. Folding

9. Enzymatic cleavage

10. Prepurification and

concentration via adsorption

S S

SS S

S

S S

SS S

S

Cortesa sanofi

Insulin biosimilars

Purity is determined by chromatography steps

Insulin

Chromatography

defines purity

Fibrillation

tendency

11. Ion-exchange

chromatography

12. Reversed-phase

chromatography

13. Crystallisation

and lyophilisation

14. Blending / filling

S S

SS S

S

S S

SS S

S

Cortesa sanofi

Traduccin en Eucariotes

Sntesis de Insulina en Clula Eucariota

Pichia pastoris (P. pastoris)

Atractivos

1) Rpido crecimiento

2) Altas densidades

3) Puede crecer en medios simples

4) Crece en metanol

5) Tiene promotores inducibles activados por metanol y reprimidos por glucosa

6) Modifica protenas

Puentes disulfuro, proteolisis

1) Secreta protenas

2) Altos rendimientos