Productos biotecnológicos

of 24 /24
DNA recombinante El DNA contiene la información biológica de los seres vivos

Embed Size (px)

description

Biotecnologia

Transcript of Productos biotecnológicos

  • DNA recombinante

    El DNA contiene la informacin

    biolgica de los seres vivos

  • Clula procariota Clula eucariota

  • access.mmhs.ca

  • Productos biotecnolgicos

    Productos de ADN recombinante

    Ejemplos. Enzimas recombinantes (Insulina, activador tisular de plasmingeno)

    Anticuerpos monoclonales o recombinantes (Antivenenos)

    Hormonas recombinantes (Hormona de crecimiento)

    Citoquinas recombinantes (Interferon alfa, IL-11)

    Receptores solubles recombinantes (Receptor de TNF)

    Vacunas recombinantes (Anti hepatitis B)

    Factores de coagulacin recombinantes (Factor VIII)

  • Requerimientos para Producir

    Protenas Recombinantes

    1) Gen de inters

    2) Vector

    3) Clula para clonacin del gen de inters

    4) Clula para expresin de la protena codificada por el gen de inters

  • Vector

    DNA pequeo (proveniente de virus, bacterias, levaduras) que puede ser

    introducido y mantenido en una clula

    (procariota o eucariota) y en el que se

    puede injertar un fragmento de DNA con

    el fin de ser clonado.

    Clulas anfitrionas:

    Eucariotas, procariotas

  • Tipos de Vectores

    Plsmidos

    http://products.invitrogen.com/ivgn/product/K30001

  • Plsmidos Recombinantes

    http://www.freepatentsonline.com/6803225-0-large.jpg

  • Tipos de Vectores

    Virus, bacterifagos

    Csmidos Sitios cos + plsmido

    Cromosomas artificiales de levaduras (YACs)

    Cromosomas artificiales de bacterias BAC

    Plsmido F

    PAC Plsmido P1

  • Produccin de Vector

    Recombinante

    2. Secuenciamiento 1. Aislamiento gen de inters

    3. Recombinacin

  • Clonacin

    1) Aislamiento y purificacin del DNA de inters

    2) Escogencia de la clula hospedera y del vector de clonacin.

    3) Obtencin del vector recombinante

    4) Trasformacin, transfeccin del vector recombinante en clula hospedera

    5) Seleccin de clulas que contienen DNA recombinante

    6) Deteccin de los clones que contienen el DNA de inters

  • 4.Transformacin/transfeccin

    6. Seleccin del clon 5. Crecimiento celular, expancin clonal

    Algunas figuras tomadas de Lodish, 5th Ed

    Clonacin

    Purificacin plsmidos recombinantes

  • Clulas Anfitrionas

    Bacterias Escherichia coli (E. coli)

    Eucariotas Levaduras

    Saccharomyces cerevisiae(S. cerevisiae), Pichia pastoris (P. pastoris)

    Clulas de insectos

    Lneas celulares mamferas Clulas derivadas de ovario de hmster chino

    (CHO)

  • Traduccin Introduccin de

    secuencias que permitan

    el reconocimiento del

    mRNA por los ribosomas

    Optimizacin de la

    traduccin

    (Utilizacin preferencial

    de codones)

    Introduccin de seales

    que garanticen

    estabilidad de la

    protena

    Introduccin de seales

    que garanticen la

    secrecin de la protena

    http://palaeos.info/bacteria/glossary/glossary1.html

  • Sistemas de Expresin

    Procariotes E. coli

    Cuerpos de inclusin

    Eucariotes Levaduras

    S. cerevisiae

    P. pastoris

    Clulas de insectos

    Secretan

  • 17

    Expresin de P.R. en E. coli

  • Glargina

    Adaptado de Vajo Z et al. Endocr Rev 2001 22: 706-717

    1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

    24 25 28 26 29 27 30

    1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

    Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

    Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly

    Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala

    Gly

    Arg Arg

  • By-product profile influenced by folding and cleavage Insulin biosimilars

    S S

    SS S

    S

    E.coli cell

    Inclusion body

    Fusion protein

    Preproinsulin

    Insulin

    Folding

    conditions

    influence

    by-product

    pattern

    Cleavage

    enzyme:

    specificity &

    selectivity

    Typical

    operations for

    inclusion body

    processes

    5. Isolation of cells

    6. Cell disruption via

    homogeniser

    7. Isolation and purification

    of fusion protein

    8. Folding

    9. Enzymatic cleavage

    10. Prepurification and

    concentration via adsorption

    S S

    SS S

    S

    S S

    SS S

    S

    Cortesa sanofi

  • Insulin biosimilars

    Purity is determined by chromatography steps

    Insulin

    Chromatography

    defines purity

    Fibrillation

    tendency

    11. Ion-exchange

    chromatography

    12. Reversed-phase

    chromatography

    13. Crystallisation

    and lyophilisation

    14. Blending / filling

    S S

    SS S

    S

    S S

    SS S

    S

    Cortesa sanofi

  • Traduccin en Eucariotes

  • Sntesis de Insulina en Clula Eucariota

  • Pichia pastoris (P. pastoris)

  • Atractivos

    1) Rpido crecimiento

    2) Altas densidades

    3) Puede crecer en medios simples

    4) Crece en metanol

    5) Tiene promotores inducibles activados por metanol y reprimidos por glucosa

    6) Modifica protenas

    Puentes disulfuro, proteolisis

    1) Secreta protenas

    2) Altos rendimientos