FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

QUÍMICA DE ALIMENTOS

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

2009

Autores:

Andrade María José

Correa Carina

Cueva Patricia

Jácome Rafael

Simba Saskia

Tufiño Carolina

En la Universidad Javeriana se realizó unainvestigación sobre el aislamiento de bacteriasfijadoras de nitrógeno para emplearlas en unprograma de fertilización bajo un esquema deagricultura orgánica. El aislamiento se realizó a partirdel suelo de un cultivo de Stevia Reubaudiana. Labacteria encontrada fue Azotobacter y su rendimientose determinó con base en la producción de biomasa yconcentración de glucósidos en la planta presentandomejor estabilidad, pigmentación, mayor velocidad decrecimiento 0,1405 h-1 fase exponencial de 18 horas yuna producción de A/A promedio de 38,4 mg/ml a las150 horas. [1]

En la India se realizaron estudios para compararun fertilizante químico y un biofertilizante en unaplantación de Stevia, mediante mediciones defósforo soluble con bacterias de Azospirillum, y losresultados demuestran una eficienciaincrementando la producción de biomasa en un53,20%. La química inorgánica del biofertilizantecambio favoreciendo el crecimiento mas no sedemostró el aumento de glucósidos en la planta.[2]

El Azotobacter es el género que ha demostrado tener elrendimiento de absorción más alto (72.64%) a nivel dela rizosfera comparado con microorganismos comoAzospirillum brasilense y Rhizobium analizadostambién para la elaboración de biofertilizantes, fijanaproximadamente 20 mg N/g de azúcar en uncultivo de Stevia en medio libre de nitrógeno, siendouna gran fuente para obtener un biofertilizante naturalreduciendo el uso de los fertilizantes químicosnitrogenados, tienen mayor velocidad de crecimientoque otras cepas aisladas de cultivos diferentesofreciendo una mayor productividad.

El Azotobacter produce fitohormonas (ácidoindolacético y citoquininas) capaces de acelerar ypotenciar el crecimiento de las plantas; promueve laformación de sideróforos, sustancias antifúngicas ygenera enzimas que favorecen a la solubilización defosfatos y oligoelementos facilitando la asimilación deestos compuestos.

El uso de fertilizantes químicos constituye un dañobiológico a los suelos deteriorando la calidad de losmismos: inducen el aumento de acidez y salinidadeliminando el humus y suavizando los tejidos de laplanta provocando que ésta sea menos resistente ysaludable, eliminan el ecosistema natural de suelodesarrollando plantas más vulnerables.

La tierra se hace dependiente a los químicosincrementando los daños al suelo y los costos defertilización. Actualmente un fertilizante químiconitrogenado se comercializa en $380 por sacos de19Kg, este costo es alto por la energía que se utilizapara su elaboración. a

El objetivo de la presente investigación es realizar elaislamiento de una cepa fijadora de nitrógeno,Azotobacter, que pueda ser empleada para laproducción de un biofertilizante en el cultivo deStevia rebaudiana, mediante fermentacióndiscontinua.

a) 1.33.5 MBtu 1 T amoniaco anhidro.

Costo de 1MBtu = 2.20 a 5.00 USD

Costo de 1 T amoniaco anhidro = 200 USD

2.1. GeneralProducir un biofertilizante con cepas Azotobacter spp aisladas de cultivos de SteviaRebaudianamediante fermentación discontinua.

2.2. Específico Aislar, seleccionar y preservar la bacteria Azotobacter spp de muestras de

cultivos de Stevia Rebaudiana proveniente de la agrícola El Edén, en el agarashby.

Evaluar el crecimiento de Azotobacter spp en caldo pikovskaya modificado ycaldo alternativo con melaza y establecer el más adecuado para unaproducción a nivel industrial.

Producir biomasa de la cepa escogida de Azotobacter spp ofreciéndoles lascondiciones óptimas para su crecimiento.

Elaborar un bioreactor para la producción del biofertilizante utilizandofermentación discontinua.

Controlar el desarrollo del bioproceso mediante los parámetros: pH,temperatura y concentración de oxígeno.

3.1. Stevia Rebaudiana

Es un género de plantas fanerógamasperteneciente a la familia de las asteráceas.]

Son hierbas y arbustos de la familia del girasol(Asteraceae), nativa de regiones subtropicales ytropicales de América del Sur y América Central.

La especie Stevia rebaudiana Bertoni, conocidacomúnmente como dulce hoja, o, simplemente,stevia, es ampliamente cultivada por sus hojasdulces. Como un sustituto del azúcar.

3.2. Biofertilizante

Los biofertilizantes se caracterizan por la presencia demicroorganismos vivos que no causan daño o enfermedad alhombre, a los animales ni a las plantas. Pueden emplearse bacteriasu hongos microscópicos, llamados micorrízicos, que se asocian enforma natural con las raíces de las plantas, beneficiando sucrecimiento y el rendimiento de los cultivos.

Los microorganismos contribuyen con el crecimiento de las plantasy el rendimiento de los cultivos, pero para que éstos seanbeneficiados es indispensable que las bacterias u hongos seencuentren vivos. El biofertilizante debe contener varios millonesde bacterias por gramo de soporte sólido o por mililitro, en caso deser acuoso. Una vez que la semilla germina y las raíces empiezan adesarrollarse, las bacterias se multiplicarán y colonizarán lasuperficie de las raíces y promoverán el crecimiento de las plantas.

3.3. Fermentación discontinua

Una fermentación discontinua (en batch) puede ser consideradacomo un "sistema cerrado". Al inicio de la operación se añade lasolución esterilizada de nutrientes y se inocula con elmicroorganismo, permitiendo que se lleve a cabo la incubación encondiciones óptimas de fermentación. A lo largo de toda lafermentación no se añade nada, excepto oxígeno (en forma de aire),un agente antiespumante y ácidos o bases para controlar el pH. Lacomposición del medio de cultivo, la concentración de la biomasa yla concentración de metabolitos cambia generalmente comoresultado del metabolismo de las células observándose las cuatrofases típicas de crecimiento: fase de latencia, fase logarítmica, faseestacionaria y fase de muerte.

En los procesos comerciales la fermentación frecuentemente seinterrumpe al final de la fase logarítmica (metabolitos primarios) oantes de que comience la fase de muerte (metabolitos secundarios).

3.4. Factores de crecimiento

3.4.1.Oxígeno

El oxígeno es el sustrato gaseoso más importante para elmetabolismo microbiano y el anhídrido carbónico es elproducto metabólico más importante. El oxígeno no es ungas muy soluble ya que una solución saturada de oxígenocontiene aproximadamente 9 mg / L de este gas en agua.Debido a la influencia de los ingredientes del cultivo, elcontenido máximo de oxígeno realmente es más bajo de loque debería ser en agua pura. El suministro se lograpulverizando aire en el fermentador durante el proceso.Una vez disuelto el O2 éste tiene que transferirse desde laburbuja de gas a cada célula individual.

3.4.2. Temperatura

Los microorganismos que crecen a una temperatura inferior a la óptimatienen retardado su crecimiento y por lo tanto reducida la produccióncelular, es decir su productividad. Por otro lado, si la temperatura esdemasiado alta, pero no letal, se puede inducir una respuesta de estrés alchoque térmico con la consiguiente producción de proteasas celulares queocasionan una disminución en el rendimiento de los productos proteicos.

3.4.3. pH

La mayor parte de los microorganismos crecen óptimamente entre pH 5,5y 8,5. Pero durante el crecimiento en un fermentador, los metabolitoscelulares son liberados al medio, lo que puede originar un cambio del pHdel medio de cultivo. Por lo tanto se debe controlar el pH del medio decultivo y añadir un ácido o una base cuando se necesite para mantenerconstante el pH. Por supuesto que esta adición del ácido o base debe sermezclada rápidamente de tal manera que el pH del medio de cultivo sea elmismo en todo el fermentador.

3.5 Bacterias fijadoras de nitrógeno

Las bacterias fijadoras de nitrógeno son componentes muy importantesdel suelo. Para desarrollar la fertilidad del suelo, debe aumentar elcontenido de nitrógeno. En las condiciones medioambientales adecuadas,las bacterias fijadoras de nitrógeno producen enzimas que toman elnitrógeno en su forma gaseosa de la atmósfera, y, con los azúcares queobtienen de la planta, fijan el nitrógeno dentro de la biomasa bacteriana. Silas bacterias satisfacen sus necesidades de nitrógeno, entonces, elnitrógeno pasa a la planta, y pueden observarse niveles elevados deproteína en la planta. Este nitrógeno elevado no se libera al suelo hastaque muere parte de la planta, o se exuda al suelo en la rizósfera

Se dividen en dos grandes grupos: las simbióticas especificas de lasleguminosas como el Rhizobium y las libres que viven en el suelo y nonecesitan la planta para su reproducción como el Azotobacter y elAzospirillum, entre los más importantes en agricultura.

El Azotobacter y el Azospirillum, en concentraciones adecuadas, puedensustituir al nitrógeno químico (urea, amoníaco) sin disminuir laproducción y a menor coste.

Otras ventajas comprobadas del uso de estas bacterias comobiofertilizante son:

a) Producen fitohormonas, como el ácido indolacètico y las citoquininas,capaces de acelerar y potenciar el crecimiento de las plantas.b) Al permanecer vivas durante años y reproducirse en el suelo, no sólono lo degradan sino que contribuyen a su enriquecimiento en nitrógeno ya su regeneración de forma ecológica y gradual, incluso en terrenos de altaconcentración salina.c) Se ha comprobado que fertilizando los cultivos con estas bacterias y connitrógeno químico en un porcentaje entre el 20 y 50% del utilizadonormalmente, se consigue un aumento de producción sobre las cosechasobtenidas únicamente con fertilizante químico al 100%. Esto es debido aque, al liberarse la bacteria de su función fijadora de nitrógeno, producemás factores de crecimiento vegetal, En cereales de secano, esto puedesuponer el ahorro del abonado de cobertera.d) Crea una barrera protectora contra hongos y bacterias patógenas en laraíz de la planta, por lo que ésta crece más sana y fortalecida.

e) Producen enzimas que solubilizan los fosfatos y los hacen másaccesibles a la planta, así como factores que facilitan la absorción deoligoelementos.f) Se ha demostrado que resisten mejor las condiciones de sequía y losclimas áridos ya que se forman alginatos en las raíces de las plantas.g) Como consecuencia de todo lo anterior, es un mayor desarrollo de lasraíces de las plantas, con el consiguiente beneficio general para ésta, asícomo el peso de los frutos.h) También se ha comprobado un mayor índice de germinación desemillas comparada con otros sistemas de abonado.i) Las nuevas estirpes de Azotobacter y Azospirillum son capaces de fijarun 72,64% más de nitrógeno atmosférico, que las estirpes originales.

Hay pues un cúmulo de ventajas para el usuario, económicas, ecológicas, Acorto, medio y largo plazo en la progresiva sustitución de la fertilizaciónquímica por las bacterias naturales, totalmente inofensivas para el medioy el ser humano.La N2 + 16 ATP + 8e-+ 8H+ nitrogenasa 2NH3 + 8H2 + 16 ADP+ 16 P

4.1 MUESTREO DEL SUELO

De cada cultivo de Stevia se toman cinco muestrasde 500g a una profundidad de 10 a 15 cm, elmuestreo se realiza en forma de zig –zag a lo largodel cultivo.

Las muestras se empacan en bolsas de papel quese colocan dentro de bolsas de plásticosherméticas y posteriormente se transportan encoolers.

4.1.1. PROCESAMIENTO DEMUESTRASUna vez en el laboratorio, las muestras de suelo setamizan en un tamiz estándar de 4.75 mm, con el finde obtener gránulos uniformes, para realizar elaislamiento primario.

4.1.2. MEDICIÓN DE pH DE LAS MUESTRAS DELSUELOLa medición del pH se realizan siguiendo el protocolodescrito por Van Lierop, 1981; se coloca en un frascode vidrio limpio suelo tamizado y agua destilada enproporción 1:1 p/v. Posteriormente, la suspensión sedeja precipitar durante 5 min y se toma el valor de pHdel sobrenadante con un potenciómetro. Los valoresde pH del sobrenadante a partir de cuatro medicionesen cada cultivo.

4.2.1. AISLAMIENTO PRIMARIA

A partir de cada muestra de suelo obtenida en losdiferentes cultivos, se realiza el aislamientoprimario por triplicado, empleando la técnica degránulos de suelo; Se colocan 20 gránulos en cajasde Agar Ashby – Sacarosa (medio especifico paraAzotobacter spp) a una distancia aproximada de 1cm. Las cajas se incuban a 28°C por 7 días hastaobservar alrededor de los gránulos coloniastranslucidas y mucilaginosas.

El aislamiento secundario se realizamediante siembra por agotamiento en cajascon Agar Ashby – Sacarosa a partir de lascolonias obtenidas en el aislamientoprimario. Las cajas son incubadas por 7 díasa 28°C, posteriormente se observa elcrecimiento en el medio selectivo Ashby –Sacarosa, la morfología de la colonia y de lascélulas por medio de la coloración de Gram.

Con el fin de observar la producción depigmentos en medio solido, de cadaaislamiento se realiza una siembra en agardiferencial Ashby con 5 g/l de benzoato,remplazando la fuente de carbono (sacarosa)en cajas petri para observar la pigmentaciónen las colonias. La siembra se realiza tomandouna colonia de cada aislamiento y realizandoun estria en toda la caja, se incuba a 28°C por7 días y se observa pigmentación

A cada aislamiento se le realiza unacaracterización con base en elcomportamiento bioquímico frente a lafermentación de glucosa, maltosa, manitol yramnosa también se realiza una prueba deasimilación y crecimiento en benzoato comofuente de carbono, test de catalasa, oxidasa ydesnitrificación en caldo nitrato.

A partir de las cepas aisladas y evaluadas serealizan cultivos en erlenmeyer de 100 ml con50 ml de caldo nutritivo, el cual se incuba a28°C por 24 Horas con agitación de 150 rpm.El cultivo se deposita en 10 viales de 1.5 ml de50 % V/V de glicerol puro estéril. Luego semantiene en congelación a -80°C.

El caldo Ashby es un medio de cultivo selectivo paraAzotobacter debido a que no contiene nitrógeno. Suventaja es que al ser un medio selectivo el crecimiento eslento, es observable a partir de los 3 – 5 días de realizadala siembra lo que implica un mayor gasto de energía parala producción.El caldo Pikovskaya modificado es un medio no selectivopero permite el crecimiento rápido de las bacterias yrequiere un gasto de energía menorEn ambos casos se necesitan reactivos químicos queimplican un costo alto adecuado solo para produccionespequeñas a escala de laboratorio, por este motivo seformula un medio de cultivo alternativo a base de melazatomando al caldo Pikovskaya modificado como patrón.

Se partió de un estudio químico de la composición de lamelaza y se procedió a sustituir los componentes del medioquímicamente definido (CPM), por el medio natural, queconstituye un medio adecuado para el crecimiento demicroorganismos.

Se toma como base la fuente de carbohidratos y proteínas(carbono y nitrógeno), garantizando el contenido requeridopor la bacteria, según el caldo Pikovskaya modificado.

Una vez obtenida la concentración teórica de melazanecesaria para sustituir los componentes del medio químicose realizan pruebas de crecimiento a nivel laboratorio, paraello se siembran cepas de Azotobacter spp en CA sólidoutilizando concentraciones menores y mayores a la obtenidateóricamente. Las siembras se realizan por triplicado.

4.6.1. REACTIVACIÓN DE LAS CEPASBACTERIANAS

Para reactivar a las bacterias se utiliza el caldoPikovskaya modificado liquido, ideal para elcrecimiento de Azotobacter spp. La cepa madre seinocula en los tubos con el medio, bajo condicionesde esterilidad y se incuba a 30°C por 24 horas.

Para la preparación del pre inoculó se toman en cuenta lossiguientes requisitos:

1.- El cultivo debe estar metabólicamente activo y libre decontaminantes.

2.- El inoculo debe estar en su fase exponencial (grado máximo dedesarrollo). Para ello se evalúa el crecimiento bacterianodurante 30 horas que es el tiempo estimado que tarda enalcanzar la fase exponencial. Se procura obtener pre inóculoscon una concentración de biomasa del orden de 108-109células/ml.

3.- Se debe dispones de una cantidad de cultivo suficiente parainocular el volumen de medio liquido a utilizar en lafermentación, el cual debe estar entre el 3 – 10 % del volumentotal a fermentar. En este caso se trabaja con un volumenequivalente al 10% del volumen total a fermentar.

Con las cepas reactivadas anteriormente serealiza un pool bacteriano, 10 ml de pool seinoculan en 90 ml de caldo Pikovskayamodificado (10% de volumen total afermentar) y otros 10 ml en 90 ml de caldoalternativo, obteniéndose un volumen finalde 100 ml de cultivo por cada caldo defermentación. Posteriormente se incuban a30°C por 24 horas y 150 rpm en matracesde 250 ml.

Una vez obtenidos los preinoculos, estos seinoculan en 900 ml de CPM y 900 de CA.Luego, son incubados a una temperaturapromedio de 28°C por 72 horas. El oxigeno sesuministra utilizando un aireador para peceracon un flujo de aire aproximado de 1 m3 /h enmatraces de 2000 ml.

El esquema del proceso global de producciónde Azotobacter spp a nivel de laboratorio

Se ha realizan una serie de corridascinéticas en las que se evalúa la variación depH, la temperatura del caldo de cultivo y laconcentración de biomasa. Además seevalúa el consumo de sustrato en CPM conlo que se puede obtener las variacionescinéticas de crecimiento. Las muestras setoman casa tres horas durante las 72 horasque dura la fermentación. Esteprocedimiento se realiza tres veces

Se utiliza la técnica de determinación de biomasa pordensidad óptica para el CPM y la determinación del Pesoseco para el CA, debido a que por el color de la melaza esimposible de medir la absorbancia. Además se realizanconteos de colonias en caja para determinar lasunidades formadores de colonias por litro.Se mide la absorbancia de cada muestra a 540 nm yluego se obtiene la concentración de biomasa en gramospor litro utilizando la curva de calibración deabsorbancia en función de peso seco para Azotobacter.Se utiliza medio estéril como blanco.Para el conteo de bacterias en caja se realizan dilucionesde 10-1 a 10-9 y se siembran en CPM sólido. Cadadilución se realiza por duplicado.

Para determinar el uso de glucosa se utilizo la técnica de DNS que sebasa en el uso de 3,5 – dinitrosalicilico para provocar la oxidación delos azucares y, al mismo tiempo, se propia reducción, desarrollándosela siguiente reacción:

PROCEDIMIENTOSe centrifuga cada muestra por 10 min a 5000rpm. Posteriormente serecupera el sobrenadante en tubos limpios. Se preparan tubos deensayos forrados con aluminio para proteger de la luz y se coloca 0.25ml de sobrenadante con 0.25 ml de reactivo 3,5 DNS en cada uno.Además se prepara un blanco al que se le coloca únicamente elreactivo. Se llevaron los tubos a ebullición por 5 minutos yposteriormente se frena la reacción con hielo. Finalmente se agregan2.25ml de agua destilada en cada tubo y se lee la absorbancia a 546 nmajustando a cero con el blanco. El blanco se coloca 2.75 ml de agua paracompletar el volumen.Se utiliza la curva de calibración de absorbancia en función de glucosapara obtener concentración residual de sustrato en gramos por litro.

De cada muestra tomada se mide el pH para determinar la variación delmismo durante la fermentación, para ello se utilizo un pH metropreviamente calibrado.

La temperatura del caldo de cultivo se mide durante todo el proceso deproducción del bio fertilizante utilizando para ello un termómetroacoplado al equipo de fermentación.

Para determinar la viabilidad del producto se almaceno el productoterminado en envases plásticos cerrados y se los coloca en refrigeración(4ºC) bajo condiciones higiénicas para evitar la contaminación

Cada semana se evalúa el estado del producto mediante observacióndirecta al microscopio. Se evalúa la población microbiana, la actividad yla contaminación por un periodo establecido de tiempo. Además sedeben realizar conteos de colonias en caja con el medio Ashby comomedio de cultivo selectivo

4.9.1. TINCIÓN GRAM- Se preparan frotis del cultivo. Se secan al aire y se fijan al

calor.- Se cubre el frotis con el reactivo cristal violeta durante un

minuto.- Se lava el frotis con agua durante 5 segundos, y luego se

aplica el reactivo yodo de Lugol durante un minuto.- Se lava y se aplica el decolorante.- Se lava y se cubre con el reactivo de Safranina durante 30

segundos.- Se lava, se seca y se coloca en el microscopio.

4.9.2. PRUEBA DE QUISTE- Se coloca un asas del cultivo en un portaobjetos, emulsionadocon agua estéril- Se agrega una o dos gotas de Yodo Lugol y se fija al aire.- Se coloca al microscopio con aceite de inmersión.

4.9.3. PESO SECO CELULAR (PCS g/ml)- Se toma 5 ml de cada dilución y de elimina en el horno elsobrenadante.- Se pesa la biomasa seca y se obtiene el PCS en gr/ml.

4.10. ANÁLISIS DE DATOSPara analizar los datos obtenidos se utilizan regresiones linealescon el objetivo de determinar la tendencia del crecimientobacteriano en ambos medios de cultivo.

[1]http://www.javeriana.edu.co/universitas_scientiarum/articulos/produccion_biofertilizante.pdf

[2] http://www.nobelonline.net/UserFiles/File/7kdas.pdf

[3] http://nostoc.usal.es/sefin/MI/tema12MI.html

[4]http://www.google.com.ec/search?hl=es&rlz=1R2ADBF_es&q=bacterias+fijadoras+de+nitrogeno&meta=&aq=0&oq=bacterias+fijadoras

[5] http://jb.asm.org/cgi/reprint/77/1/86.pdf