III Congreso Internacional de Microbiología Pecuaria

IV Congreso Nacional y XIV Congreso Estudiantil de Microbiología Pecuaria

24 y 25 de Octubre de 2013

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PRODUCCIÓN DE ENZIMAS FIBROLÍTICAS DE Phanerochaete chrysosporium y Fomes sp.

CULTIVADOS EN RASTROJO DE MAÍZ

Carrillo-Díaz M.I.1, Alonso-Meneses T.L.2, Miranda-Romero L.A.3

1*Posgrado en Producción Animal, Universidad Autónoma Chapingo. 2 Ingeniería en Biotecnología,

Universidad Tecnológica de Tecamac. 3Posgrado en Producción Animal, Universidad Autónoma

Chapingo.

Isabel_2224@live.com.mx

Resumen

La lignocelulosa (celulosa, hemicelulosa y lignina) es el principal componente de la pared celular de las

plantas, representa una fuente de carbono con potencial para solucionar los problemas de energía

actuales. Dentro de los diversos métodos que mejoran la hidrólisis de la celulosa se encuentran los

hongos ligninolíticos, puesto que degradan el material lignocelulósico a través de la producción de

enzimas extracelulares. El objetivo de este trabajo fue evaluar la producción de celulasas y xilanasas

de los hongos Phanerochaete chrysosporium y Fomes sp. cultivados por fermentación en estado sólido

en rastrojo de maíz con y si mazorca, con 20% de salvado de trigo como aditivo. El extracto crudo

enzimático (ECE) se analizó para medir la actividad enzimática de celulasas y xilanasas con el reactivo

DNS. Los dos hongos y los dos sustratos se evaluaron en un diseño completamente al azar 2x2 con

arreglo factorial con una comparación de medias con la prueba de Tukey con el programa estadístico

SAS 9.0. La mayor producción de celulasas y xilanasas se obtuvo con Phanerochaete chrysosporium.

En el caso de de celulasas, el mejor sustrato fue el rastrojo de maíz sin mazorca, presentando el mayor

pico de producción en el día 12. Phanerochaete chrysosporium es un hongo con un alto potencial para

degradación de materiales fibrosos. Los sustratos con alto contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina

favorecen la producción de enzimas fúngicas que hidrolizan estos materiales.

Palabras Clave: Celulasas, Xilanasas, Hongos ligninolíticos.

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Introducción

Los residuos, desperdicios, desechos agrícolas y de la industria de alimentos constituyen una

proporción importante, ya que llegan a alcanzar más del 30% del total de la productividad agrícola

mundial (Ugwuanyi et al., 2009); estos materiales representan un gran potencial para solucionar los

problemas de nutrición animal si se implementan tecnologías adecuadas para el uso apropiado de

dichos desechos. En la actualidad existen productos comerciales obtenidos a partir de hongos que son

utilizados ampliamente para mejorar la digestibilidad de forrajes o granos (Beauchemin et al., 2004).

Entre los aditivos para aumentar la digestibilidad de los alimentos lignocelulósicos, las enzimas

exógenas fibrolíticas, al agregarse a estos materiales, pueden mejorar la utilización de los polisacáridos

de los forrajes (Pinos-Rodríguez et al., 2002). Los hongos de pudrición blanca han sido ampliamente

estudiados, ya que son capaces de producir enzimas hidrolíticas, como las celulasas, xilanasas y

lacasas; las cuales han sido probadas para su aplicación en la industria textil, del papel y en la

producción de alimentos y biocombustibles (Rodrigues et al., 2008). Se han utilizado diversas cepas de

hongos como Trichoderma reesei, Phanerochaete chrysosporium, Aspergillus humicola, Trametes

versicolor, Bjerkandera adusta, Pleurotus ostreatus y Fomes fomentarius (Pérez et al., 2002; Rodrigues

et al., 2008; Ovando y Waliszewski, 2005) para la obtención de extractos enzimáticos en la degradación

de materiales fibrosos. En diversas investigaciones realizadas con tratamientos enzimáticos sobre la

degradación de los materiales fibrosos, se ha observado un comportamiento favorable, ya que se

incrementa la digestibilidad de manera considerable (Colombatto et al., 2007). El objetivo de este trabajo

fue evaluar la actividad enzimática producida por los hongos Phanerochaete chrysosporium y Fomes

sp. cultivados en rastrojo de maíz con y sin mazorca.

Material y Métodos

Para el cultivo del hongo se utilizó caldo papa dextrosa (24 g L-1) y agar bacteriológico (15 g L-1), en

cajas Petri en las cuales se resembró el hongo para su crecimiento. Las cajas Petri con el hongo se

dejaron incubando a 35 °C por 10 días. Para la medición de la actividad enzimática de celulasas y

xilanasas, se obtuvo un cultivo por fermentación en estado sólido utilizando como sustrato rastrojo de

maíz con y sin mazorca, con 20% de salvado de trigo. La humedad de estos materiales fue ajustada al

80%. Los cultivos se prepararon en cajas Petri de vidrio conteniendo 14 g de sustrato. Estos materiales

se esterilizaron a 121°C por 40 minutos. A cada caja Petri se le añadieron 4 discos (10 mm de diámetro)

de micelio de cada hongo crecido en PDA y se incubaron a 35°C hasta su lectura. Las lecturas

enzimáticas se realizaron a los 0, 3, 6, 9, 12 y 15 días de incubación. Para obtener el extracto enzimático,

se traspasó el cultivo en estado sólido a matraces Erlenmeyer de 250 mL y se añadieron 70 mL de agua

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destilada a cada matraz, posteriormente se colocaron en un baño de hielo sobre una agitadora orbital y

se agitaron a 120 rpm por 30 minutos. El líquido fue centrifugado a 7,000 rpm en tubos cónicos de 15

mL. Posteriormente se tomaron 2 mL para colocarlos en una centrífuga refrigerada a 4°C a 10,000 rpm

por 15 minutos. El sobrenadante obtenido se utilizó para la medición de actividad enzimática,

denominado extracto crudo enzimático (ECE). Para la medición de celulasas y xilanasas se utilizó el

método descrito por Miller et al., (1960). Para celulasas se utilizó como sustrato una solución de

carboximetilcelulosa (Sigma-Aldrich) al 1%, disuelta en amortiguador de citrato de sodio (50 mM, pH

5.0). Para xilanasas, se utilizó como sustrato una solución de xilano de madera (Sigma-Aldrich) al 0.5%,

el cual fue disuelto en amortiguador de citrato de sodio (50 mM, pH 5.3). Para ambas enzimas, se midió

la absorbancia a una longitud de onda de 595 nm en un espectrofotómetro LAMBDA 35 PerkinElmer a

595 nm. El diseño experimental fue un completamente al azar con arreglo factorial 2x2x6 Se realizó un

análisis de varianza para comparar la actividad enzimática de los sustratos, utilizando la prueba de

Tukey con el procedimiento GLM para realizar la comparación de medias, con el paquete estadístico

SAS 9.

Resultados y Discusión

Para la producción de celulasas, hubo diferencias significativas respecto al hongo utilizado (p<0.01) ya

que Phanerochaete chrysosporium obtuvo los valores más altos. Además se observó que el sustrato

sin mazorca de maíz tuvo la mejor respuesta para la producción de esta enzima (p<0.01). El mejor día

para producción de enzima fue el día 12 (p<0.01) como se observa en la figura 1. Respecto a xilanasas,

también hubo diferencia para los hongos estudiados (p<0.05), ya que Phanerochaete chrysosporium

obtuvo los valores más altos. Para esta enzima no se presentaron diferencias entre los sustratos

utilizados.

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Figura 2. Producción de xilanasas de Phanerochaete chrysosporium y Fomes sp. Cultivados en rastrojo

de maíz.

Figura 1. Producción de celulasas de Phanerochaete chrysosporium y Fomes sp. Cultivados en

rastrojo de maíz.

.

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Los resultados de producción de celulasas y xilanasas concuerdan con otros autores, ya que P.

chrysosporium es uno de los más eficientes en degradar lignina de la madera, además de liberar varios

tipos de celulasas (Pérez et al., 2002), lo cual puede permitir que haya una mayor hidrólisis del complejo

lignocelulósico de los materiales fibrosos. Estudios similares realizados con este hongo cultivado en

rastrojo de maíz por fermentación en estado sólido, indican que la mayor hidrólisis de este material

fibroso se obtuvo en el día 9 (Zhang et al., 2012). Probablemente esta diferencia se deba a una mayor

cantidad de sustrato utilizada en el presente estudio.

Conclusiones

El hongo Phanerochaete chrysosporium puede ser utilizado para la producción de enzimas que

favorecen la degradación de los materiales lignocelulósicos. El rastrojo de maíz sin mazorca promueve

una producción de celulasas por los hongos ligninolíticos.

Literatura citada

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Miller, G. L., R. Blum, Glennon, W. E., Burton, A. L. 1960. Measurement of carboxymethylcellulase

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procesos extractivos. Universidad y ciencia, Universidad Juárez Autónoma de Tabasco.

(21):42;113-122.

Pinos-Rodríguez J. M., S. González., G. Mendoza., J. C. García., L. Miranda., G. A. De La Cruz., y V.

De Lerma. 2005. Efecto de enzimas fibrolíticas exógenas en la degradación in vitro de ingredientes

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fungi on chemical composition and in vitro digestibility of wheat straw. Animal Feed Science and

Technology (141): 326–338.

Ugwuanyi, J. O., B. McNeil,. and L. M. Harvey. 2009. Chapter 5 Production of Protein-Enriched Feed

Using Agro-Industrial Residues as Substrates Biotechnology for Agro-Industrial Residues

Utilization, Part II, 78-103.

Zhang J., X. Ren, W. Chen y J. Bao. 2012. Biological pretreatment of corn stover by solid state

fermentation of Phanerochaete chysosporium. Front. Chem. Sci. Eng. 6(2):146-151.