Universidad de ChileFacultad de Ciencias Fsicas y Matemticas Departamento de Ingeniera Civil Qumica y BiotecnologaBT3401-1 Biologa y Biotecnologa

Produccin de etanol en una fermentacin batch

Integrantes : Constanza GarcsJoaqun MoralesLuis Rodrguez

Profesores : Juan Asenjo, Ana Mara Ronco, Oriana SalazarProfesora Auxiliar : Daniela Vaismann

Ayudantes : Lisset Manzano

Fecha : 14 de Mayo del 2012

RESUMEN

En el presente trabajo se analiz el crecimiento y cintica de formacin de etanol por la levadura Saccharomyces ovarum en una fermentacin anaerbica a una temperatura de 25C y pH 7,0 en un cultivo tipo batch en un fermentador Biostat B-2. Utilizando un modelo matemtico y una regresin polinmica, se obtuvieron diversos parmetros de fermentacin. Se encontr que la velocidad de crecimiento especfica mxima era 0,690 [h]-1 correspondiente a t=0, mientras que la concentraciones mximas de biomasa y etanol eran 8,23 [gr/l] en t = 37,02 [h] 88,13 [gr/l] en t = 43,27 [h] respectivamente. La velocidad de produccin de etanol mxima era 2.78 [gr/lh] en t= 14,27 [h]. Por otra parte, se estudi el rendimiento de etanol en glucosa y el de biomasa en glucosa, y se observ que el primero aumente en el tiempo, mientras que el segundo disminuye.

NDICE

INTRODUCCIN ------------------------------------------------------------------------------ Pgina 41.1. OBJETIVOS GENERALES---------------------------------------------Pgina 51.2. OBJETIVOS ESPECFICOS -------------------------------------------Pgina 5MATERIALES Y MTODOS -------------------------------------------------------------------- Pgina 62.1 Organismos y medio de cultivo ----------------------------Pgina 62.2 Procedimiento experimental --------------------------------Pgina 62.3 Mtodos analticos ---------------------------------------------Pgina 6RESULTADOS ------------------------------------------------------------------------------------ Pgina 8DISCUSIN -------------------------------------------------------------------------------------- Pgina 10CONCLUSIONES -------------------------------------------------------------------------------- Pgina 11BIBLIOGRAFA ----------------------------------------------------------------------------------- Pgina 12ANEXO 1 ----------------------------------------------------------------------------------------- Pgina 13

1. INTRODUCCIN

La mayora de los organismos vivos obtienen la energa necesaria para sustentar la vida desde la oxidacin por oxigeno molecular de sustancias orgnicas, en el proceso de respiracin celular. Bajo condiciones anaerbicas, muchos organismos, incluyendo levaduras, obtienen energa mediante el proceso de fermentacin; lctica o alcohlica.Las levaduras son cuerpos unicelulares (2 a 4m)presentes de forma natural en algunos productos como lasfrutas, cereales yverduras. Se denominan organismos anaerbicos facultativos, es decir que pueden desarrollar sus funciones biolgicas sin oxgenoEn la fermentacin alcohlica, caracterstica de muchas especies de levaduras, ente ellas la Saccharomyces uvarum, la reaccin comienza con una molcula de azcar de seis carbonos (glucosa) y termina con dos molculas de alcohol de dos carbonos (etanol), dos molculas de CO2 y dos molculas deATPque consumen los propios microorganismos en sumetabolismo:

Levadura

C6H12O6+ 2 Pi+ 2ADP 2 CH3-CH2OH + 2 CO2+ 2ATP+ 25.5 kcal

La secuencia de transformaciones para degradar la molcula de glucosa hasta dos molculas de alcohol es un proceso complejo.

Cuando se siembran microorganismos en un medio de cultivo apropiado, los mismos comienzan a dividirse activamente (crecimiento exponencial) empleando los nutrientes que le aporta el medio de cultivo para aumentar su nmero. Este proceso contina hasta que algn nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato limitante) y el crecimiento se detiene. Tambin puede detenerse el crecimiento por acumulacin de alguna substancia inhibidora formada por los mismos microorganismos.[1]

Para evaluar esta transformacin se utiliza el rendimiento de etanol en glucosa y el de biomasa en glucosa.

Diversos parmetros afectan el rendimiento, como son la clase de microorganismo utilizado, la concentracin de glucosa, concentracin de etanol, temperatura, pH y la concentracin de nutrientes.

:En el presente trabajo, se estudia el crecimiento y cintica de formacin de producto en una fermentacin anaerobia llevada a cabo por Saccharomyces uvarum a una temperatura de 25C y pH 7.0 en un cultivo batch, proceso discontinuo por lotes.

1.1 OBJETIVOS GENERALES

Examinar el crecimiento y la cintica de la formacin de producto (etanol) en una fermentacin anaerobia con levaduras a 25 por 48 horas.

1.2 OBJETIVOS ESPECFICOSDeterminar los siguientes parmetros de fermentacin:(1) Velocidad de crecimiento especfica mxima. (2) Concentracin mxima de biomasa.(3) Concentracin mxima de etanol.(4) Velocidad de produccin de etanol mxima. (5) Rendimiento de etanol en glucosa.(6) Rendimiento de biomasa en glucosa.(7)

2.MATERIALES Y MTODOS

2.1 Organismos y medio de cultivoSe utiliz Saccharomyces uvarum ATCC 26602, un tipo de levadura altamente floculante [2].El crecimiento se llev a cabo en un fermentador Biostat B-2 de Braun Biotechnology, donde todas las aplicaciones necesarias para controlar la fermentacin, como bombas de dosificacin, agitador de 6 hojas, mdulos de medida y control de variables, estn combinados en una unidad bsica que puede funcionar casi de forma automtica.Las condiciones fijadas para llevar a cabo la fermentacin fueron; mantener un pH igual a 7.0 y una temperatura de 25C en ausencia de aire (sin oxgeno), es decir, en un medio anaerbico. La composicin del medio de cultivo por 1 litro fue: 250 gr glucosa, 10 gr extracto de levadura Oxoid, 6.4 gr de urea, 1.2 gr de KH2PO4, 0.18 gr de Na2HPO4, 10 ml de una solucin A y 10 ml de una solucin B. La solucin A contena las siguientes trazas de metales: 5.6 gr de CaO, 2.0 gr de ZnO, 27.0 gr de FeCl3*6H2O, 5.0 gr MnCl2*4H2O, 0.85 gr CuCl2*2H2O, 1.2 gr CoCl2*6H2O, 0.3 gr de H3BO3 y 65 ml de HCl concentrado 5:1 con agua destilada. La solucin B contena 50.5 gr de MgO, 225 ml de HCl concentrado a razn 5:1 con agua [3]. 2.2 Procedimiento experimental Colonias simples de levadura fueron tomadas de tubos de cultivo y se transfirieron a un matriz Erlenmeyer esterilizado [que contena 100 ml con 10% glucosa.] Despus de 24 horas agitando la mezcla a 25C, se transfiri al fermentador que contena 900 ml del medio de cultivo [3]. Nitrgeno gaseoso (N2) se introdujo al fermentador por 3 horas antes y despus de la inoculacin para mantener la anaerobiosis. El cultivo se mantuvo agitado suavemente para mantener un cultivo homogneo durante todo el proceso. El pH se mantuvo controlado a un valor de 7.0 con la adicin automtica (por parte del fermentador) de NaOH 4M. Para mantener la temperatura a 25C y reducir la evaporacin de etanol se recircul agua por la doble camisa del fermentador.2.3 Mtodos analticosSe tomaron muestras de 10 ml del fermentador a intervalos de tiempo durante 48 horas para determinar el peso seco de la biomasa. La cantidad de glucosa fue estimada usando el mtodo del cido dinitrosaliclico [4]. Para la estimacin del etanol, se sigui el procedimiento desarrollado por Sawyer y Dixon. Para modelar la variacin de las concentraciones de biomasa, glucosa y producto en el tiempo a partir de una tabla de datos discretos se realiz una regresin polinmica de segundo grado para el caso glucosa y de tercer grado para biomasa y etanol usando una planilla en el programa Office Excel. Luego, utilizando estas curvas se calcularon los parmetros de fermentacin pedidos en el intervalo 0-50 horas, usando las siguientes ecuaciones:

(1) Velocidad de crecimiento especfica:

(2) Concentracin mxima de biomasa:

(3) Concentracin mxima de etanol:

(4) Velocidad de produccin de etanol mxima:

(5) Rendimiento de etanol en glucosa:

(6) Rendimiento de biomasa en glucosa:

3.RESULTADOSLas regresiones polinmicas arrojaron las siguientes curvas (grfico 1):Biomasa(tercer grado):[B] = 0,00008t3 - 0,0119t2 + 0,5522t + 0,0718R = 0,9731

Glucosa(segundo grado):[G] = 0,0875t2 - 9,403t + 259,08R = 0,9876

Etanol(tercer grado):[E] = -0,0011t3 + 0,0471t2 + 2,103t - 1,9341R = 0,994

Grfico 1: Ajuste de datos discretos obtenidos mediante curvas polinmicas.

De (1) se obtuvo mx = 0,690 [h]-1 en t = 0De (2) se obtuvo que la concentracin mxima de biomasa [B]mx = 8,23 [gr/l] en t = 37,02 [h].De (3) se obtuvo que la concentracin mxima de etanol [E]mx = 88,13 [gr/l] en t = 43,27 [h].De (4) se obtuvo que la velocidad de produccin de etanol mxima d[E]/dt mx = 2,78 [gr/lh] en t= 14,27 [h].De (5) se obtuvo que el rendimiento de etanol en glucosa se comporta de la siguiente manera en el tiempo:

De (6) se obtuvo que el rendimiento de biomasa en glucosa se comporta de la siguiente manera:

Los valores obtenidos para los ltimos dos parmetros los podemos apreciar en los grficos 1 y 2:

Grfico 2: Rendimiento de biomasa en glucosa vs tiempo.

Grfico 3: Rendimiento de etanol en glucosa vs tiempo.

Se adjuntan en la planilla anexa (anexo 1) los valores obtenidos en las funciones de regresin y los distintos parmetros y su variacin en el tiempo.

4.DISCUSIN

Acerca de las valores obtenidos para la fermentacin Batch a 25C se puede observar que hay un coeficiente de regresin R2 cercano a 1. Esto muestra que el modelo matemtico utilizado tiene determinada exactitud. Los polinomios permiten diferenciar sin mayor dificultad y los clculos matemticos se limitaron a encontrar races cuadrticas y cbicas.

Los datos hacen sentido: una poblacin de levaduras en crecimiento a medida que consume glucosa, la utiliza y libera al fermentador su producto metablico (el etanol). Por otro lado, a medida que el alimento se va agotando y aumenta la concentracin del alcohol el ambiente alcanza poco a poco su capacidad de carga al estancarse el crecimiento de Saccaromyces uvarum e incluso disminuir por dos factores: la falta del azcar y la toxicidad del etanol. Existe una aproximada correlacin entre [E] y [B] en el intervalo, tal como lo seala la ecuacin diferencial vista en clases: . Es por eso que se puede afirmar que el etanol es un producto asociado al crecimiento.

Los parmetros de fermentacin muestran que existe una explosin reproductiva en la poblacin al comienzo pues el ambiente es rico en nutrientes y no es txico. Es por eso que es completamente factible que la mx = 0,690 [h]-1 se obtenga en t = 0. Por su lado, los rendimientos permiten intuir las siguientes relaciones; la eficiencia metablica de una colonia disminuye a medida que va aumentando la biomasa; se va liberando cada vez ms etanol al metabolizar la misma cantidad de glucosa. Tambin se puede inferir por la tendencia del rendimiento de biomasa en glucosa que las levaduras utilizan a esta ltima principalmente en reproducirse, pues una vez que se alcanza la capacidad de carga la colonia disminuye su consumo considerablemente. Puede atribuirse a que inteligentemente optimiza su mantenimiento ante la escasez para sobrevivir.

5.CONCLUSIONES

Los parmetros de fermentacin obtenidos son los siguientes: mx = 0,690 [h]-1 en t = 0 La concentracin mxima de biomasa [B]mx = 8,23 [gr/l] en t = 37,02 [h]. La concentracin mxima de etanol [E]mx = 88,13 [gr/l] en t = 43,27 [h]. La velocidad de produccin de etanol mxima d[E]/dt mx = 2,78 [gr/lh] en t= 14,27 [h]. El rendimiento de etanol en glucosa se comporta de la siguiente manera en el tiempo:

El rendimiento de biomasa en glucosa se comporta de la siguiente manera:

El etanol es un producto asociado al crecimiento de Saccaromyces uvarum.

5.BIBLIOGRAFA

[1]Mara de Lourdes Escamilla Hurtado, Frida malpica Snchez, Alberto Reyes Dorantes y Jos Ramn Verde Calvo. Depto. Biotecnologa. Div. Ciencias Biolgicas y de la Salud. Unidad Iztapalapa. Universidad Autnoma Metropolitana. [en lnea]

[ULTIMA VISITA 15/05/2012]

[2]ROSE, D., 1976, PROC. BIOCHEM, 11, (2), 10-12.[3]JAE HEUNG LEE, D. WILLIAMSON AND P.L. ROGERS, 1980, BIOTECHNOLOGY LETTERS, 2, 83-88.[4]SAWADA, H AND ROGERS, P.L., 1977, J. FERM. TECHNOL, 55, 297-310.

5.ANEXO 1

Tabla 1: Datos entregados por las curvas ajustadas a los valores discretos.Datos de curvas ajustadas para una fermentacin a 25C

B = 8E-05t3 - 0,0119t2 + 0,5522t + 0,0718 [G] = 0,0875t2 - 9,403t + 259,08[E] = -0,0011t3 + 0,0471t2 + 2,103t - 1,9341=1/[B]0,00024t2-0,0238t+0,5522VPE=-0,0033t2-0,0942t+2,103Ye/g= VPE/(0,175t-9,403)Yb/g=-(0,00024t2-0,0238t+0,5522)/(0,175t-9,403)

Tiempo [h]Biomasa [g/L]Glucosa [g/L]Etanol [g/L]g/hL]VPE[g/h]Ye/gYb/g

00,8259,08-20,6902,1030,2240,059

31,623250,2972,4150,2720,054

63,0206120,1412,7870,3340,050

94,1182200,0863,2180,4110,046

125,1159280,0593,7090,5080,041

155,9138360,0424,2590,6280,037

207,0106500,0255,3070,8990,029

247,684600,0166,2651,2040,023

288,064690,0097,3281,6270,016

348,241800,0029,1212,6410,006

378,331830,00010,1063,4520,000

448,11586-0,00412,6377,420-0,018

488,0983-0,00514,22814,185-0,037

2