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PROCEDIMIENTO DE SOLICITUD Y ENTREGA DE

TÉCNICAS HISTOQUIMICAS PROTOCOLO DE TÉCNICAS

Nº Resolución: 1238 26 Agosto de 2011

______________________________________________________________________ HOSPITAL SANTIAGO ORIENTE

DR. LUIS TISNE BROUSSE Avda. Las Torres Nº 5150 – Comuna Peñalolen – Fono 4725200 – www.hsoriente.cl

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ELABORADO POR REVISADO POR APROBADO POR

NOMBRE TM JANNETTE AMARO TM MAURICIO CASTRO

DRA. FANCY GAETE TM JANNETTE AMARO TM ANGIE CALFUMAN

TM RAUL JARA TM FABIOLA NUÑEZ

DR JULIO MONTT VIDAL

CARGO

JEFE LABORATORIO TECNOLOGO MEDICO

JEFE DE LA UNIDAD JEFE LABORATORIO

TECNOLOGO MEDICO TECNOLOGO MEDICO TECNOLOGO MEDICO ENCARGADA CALIDAD

DIRECTOR

FECHA 2004 2011 2011

FIRMA






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Control de Cambios

Versión Descripción Fecha 1 Creación AGOSTO 2004 2 Revisión AGOSTO 2009 3 Revisión OCTUBRE 2010 4 Revisión AGOSTO 2011






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PROCEDIMIENTO DE SOLICITUD Y ENTREGA DE TECNICAS HISTOQUIMICAS

Este protocolo tiene como objetivo asegurar la correcta realización del examen histoquímico en la biopsia diferida y complementar el diagnostico histológico por parte del médico patólogo.

PROCEDIMIENTO.

a) El médico patólogo al momento de realizar el examen macroscópico, indicara al TPM o al TM la técnica a realizar, quedando registrada en la hoja de ingreso al laboratorio.

b) Si la petición de THQ (técnica histoquímica) ocurre una vez que la biopsia diferida está en proceso de informe, el patólogo debe depositar su solicitud en buzón ubicado en el laboratorio de UAP. Además debe adjuntar la lámina H/E para la correcta identificación del molde de inclusión, cuando corresponda.

c) TM de turno, anotará la petición en el libro de “Solicitud de técnicas histoquímicas”. En este libro se indicará: N° de biopsia, N° de molde, fecha de solicitud, nombre del médico solicitante.

d) Luego de realizada la técnica, el TM anotará la fecha de entrega de la THQ en libro de “Solicitud de técnicas histoquímicas” e ingresará datos a base de datos del laboratorio

e) Entregar lámina y solicitud a patólogo responsable.

CONTROL DE CALIDAD.

a) Cada tanda de THQ deberá ir acompañada de los respectivos controles positivos externos o internos.

b) Los controles positivos son responsabilidad del TM de turno de THQ y deberá solicitar al TM, en turno de corte, que adjunte las placas control necesarias.

c) El TM de turno revisará al microscopio cada control positivo, para validar la correcta ejecución de la técnica.






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d) El TM de turno deberá garantizar el stock y correcto estado de los reactivos necesarios para todas las THQ realizadas.

e) La UAP del HSO se guiará por las técnicas histoquímicas descritas en documento de Procedimiento de técnicas histoquímicas.






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RETICULO DE GOMORI

1. Desparafinar e hidratar hasta el agua corriente. 2. Permanganato de potasio 0.5 % por 1 minuto. 3. Lavado en agua corriente. 4. Metabisulfito de sodio 5% por 1 minuto. 5. Lavar en agua corriente. 6. Mordentar en alumbre férrico 3% por 3 minutos. 7. Lavar en agua destilada. 8. Solución de plata de Gomori por 5 minutos. 9. Lavar en agua destilada. 10. Reducir en formalina al 10% por 1 minuto. 11. Lavar en agua destilada. 12. Virar en cloruro de oro 0.5% por 1 minuto. 13. Lavar en agua destilada. 14. Hiposulfito de sodio al 3% por 1 minuto. 15. Lavado en agua corriente. 16. Si se desea contrastar con safranina al 0.5% por 1 minuto. 17. Deshidratar desde alcohol de 95%, aclarar y montar.

Solución de plata de Gomori:

A 5 ml de nitrato de plata acuoso al 10%, agregar amoniaco puro gota a gota hasta la disolución del precipitado que se forma. Agregar 5ml de hidróxido de sodio al 3%. Agregar amoniaco puro gota a gota hasta la disolución del precipitado. La solución debe quedar ligeramente turbia. Completar 50ml con agua destilada.

RESULTADOS: fibras reticulares de color negro.






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GROCCOTT

1. Desparafinar e hidratar hasta el agua destilada. 2. Acido crómico 5% por una hora. 3. Lavar en agua corriente. 4. Bisulfito de sodio al 1% por 1 minuto. 5. Lavar en agua corriente. 6. Colocar en solución de trabajo en baño termo regulado a 60°C por 1 hora

hasta que los cortes tomen un color café tabaco. 7. Lavar en agua destilada. 8. Poner en cloruro de oro al 0.5% por 1 minuto hasta que los cortes tomen un

color negro. 9. Lavar en agua destilada. 10. Hiposulfito de sodio al 2% por 1 minuto. 11. Lavar en agua corriente. 12. Si se desea, contrastar con verde luz 0.2% por 30 segundos. 13. Deshidratar, aclarar y montar.

Soluciones madres: Metenamina 3%. Nitrato de plata 5%. Borato de sodio 5%.

Solución de trabajo:

A 25ml de metenamina 3%, agregar 1.25 ml de nitrato de plata al 5%, completar 50ml con agua destilada. Adicionar 2ml de borax 5%.

RESULTADOS: Micelia e hifas de Gris claro.






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WARTHIN-STARRY

1. Desparafinar e hidratar los cortes hasta el agua destilada. 2. Impregnar con solución de nitrato de plata al 1% en estufa a 60°C 3. por 20 minutos. 4. Sacar los cortes y sin lavar poner en solución reveladora, en baño

termoregulado a 60°C. Los cortes se tornan amarillo claro y/o café dorado en aproximadamente 1 a 2 minutos.

5. Parar reacción sacando portas de la mezcla y lavar en agua caliente (para sacar el exceso de gelatina)

6. Dejar secar al aire y luego montar.

Solución reveladora (mezclar al momento de usar):

10ml de nitrato de plata 2%. 25ml de gelatina 5%. 15ml de hidroquinona 0.15%.

Agua acidificada:

A 1 Lt de agua destilada agregar 0.1gr de acido cítrico. Con esta agua se prepararan todas las soluciones de la técnica.

RESULTADOS: Espiroquetas de color negras y contraste de color café-amarillento claro.






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GRAM

1. Desparafinar los cortes hasta el agua corriente. 2. Colocar en solución de cristal violeta por 1 minuto. 3. Lavar en agua corriente. 4. Lugol por 1 minuto. 5. Decolorar en alcohol isopropílico por 5 min ó en acetona al 10% en alcohol

isopropílico. 6. Lavar en agua corriente. 7. Contrastar con safranina 0.5% por 1 minuto. 8. Lavar en agua corriente. 9. Decolorar con acetona hasta que no salga mas colorante. 10. Secar al aire y montar.

Solución de cristal violeta:

Disolver 2gr de cristal violeta en 20ml de alcohol de95%. Disolver 1gr de oxalato de amonio en 100ml de agua destilada. Mezclar ambas soluciones.

RESULTADOS: Bacterias Gram (+) de color azul negro y Bacterias Gram (-) de color rojo.






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ALCIAN BLUE

1. Desparafinar e hidratar hasta el agua destilada. 2. Colocar en solución trabajo por 2 ciclos de microondas por 15 segundos o

por 30 min a Tº ambiente. 3. Dejar enfriar la solución. 4. Lavar agua corriente. 5. Contrastar con safranina 0.5% acuosa por 10 segundos. 6. Deshidratar, aclarar y montar.

Solución trabajo Alcian blue pH 2.5: Alcian blue C.I 74240 1 gr Acido acético glacial 3% 100 ml RESULTADOS: Mucinas ácidas ricas en grupos sulfónicos carboxílicos de color celeste.

PAS- ALCIAN BLUE

Realizar la técnica de Alcian Blue hasta punto 4 y luego continuar con tinción PAS desde el agua destilada que sigue al alcohol de hidratación. RESULTADOS: Mucinas ácidas ricas en grupos sulfónicos carboxílicos de color celeste y mucinas neutras de color magenta.






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AZUL TOLUIDINA

1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada. 2. Colocar azul toluidina 0.5% acuoso por 1 segundo. 3. Diferencia en alcohol 100º. 4. Secar al aire 5. Aclarar y montar.

RESULTADOS: mastocitos de color rojo y presentan metacromasia.

CRISTAL VIOLETA

1. Preparar cortes de 4 µm. 2. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada. 3. Colocar en cristal violeta por 5 min. 4. Lavar en agua corriente 5. Diferenciar en ácido acético 3% hasta que el amiloide en control se observe

violeta. 6. Secar al aire y montar.

Solución de Cristal Violeta: Cristal violeta 0.1 gr Agua destilada 97.5 ml Ac. Acético glacial 2.5 ml RESULTADOS: amiloide de color violeta






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GIEMSA

1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada. 2. Colocar en solución concentrada “Eosin Methilene blue, according Giemsa”

mínimo 30 minutos. 3. Sin lavar, sumergir cortes enérgicamente en agua acetificada (50ml H2O

dest + 3 gotas ac. Acético glacial) por no más de 2 seg. 4. Lavar en agua destilada. 5. Diferenciar en alcohol de 95º enérgicamente por 2 a 3 seg. 6. Lavar en 2 baños de isopropanol (I y II) 7. Aclarar y Montar.

RESULTADOS: bacterias de color azul oscuro

NEGRO SUDAN

1. Corte fresco en congelación sin fijar. 2. Colocar en etanol 50º y 70º dos minutos c/u. 3. Teñir en solución saturada de negro sudán preparada en alcohol de 70%

durante 3 minutos 4. Lavar en alcohol de 70%, 50% por 30 seg. c/u 5. Montar con medio hidrófilo.

RESULTADOS: Grasas neutras de color negro






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PAS (SCHIFF)

a. Se usará el reactivo Schiff marca Merck catálogo 1.09033.0500. b. En caso de emergencia se usará el preparado según AFIP. c. Se cambia el reactivo cuando la tinción se observe con fondo excesivo.

(cada 3 meses aprox.)

Tinción:

1. Desparafinar e hidratar 2. Poner 10 min en Acido peryódico 0.5% 3. Lavar en agua corriente y luego destilada 4. Poner 20 min en reactivo de Schiff 5. Lavar 6. Contrastar con Hematoxilina de Harris por 5 min 7. Diferenciar en alcochol ácido 8. Deshidratar, aclarar y montar

RESULTADOS: Membranas basales color magenta.






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PAS AMILASA

1. Desparafinar e hidratar 2. Diluir 2 ml de saliva (amilasa) en 48 ml de agua destilada. 3. Incubar por 30 min a 60ºC 4. Lavar con agua corriente. 5. Continuar con técnica PAS desde paso 2.

RESULTADOS: Membranas basales color magenta y ausencia de glicógeno en tejido.

SCHMORL (Melanina)

1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada 2. Solución de trabajo 3 cambios de 7 min cada una. 3. Lavar en agua 4. Contrastar con picro ponceau por 5 segundos. 5. Lavar en agua destilada. 6. Aclarar y montar

Solución de trabajo (mezclar al momento de usar): Cloruro Férrico al 1% 150 mls Ferricianuro de K al 0,1% 50 mls RESULTADOS: Melanina de color verde






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PERLS (hemosiderina)

1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada. 2. Colocar los cortes en solución trabajo 15 a 30 minutos. 3. Lavar cuidadosamente en agua destilada. 4. Contraste nuclear con safranina por 1 min. 5. Aclarar y montar.

Solución de trabajo: Ferrocianuro de potasio 2% (recién preparado) 1 volumen (0,5 grs. en 25 ml de agua destilada) Ácido clorhídrico 2% 1 volumen (0,5 ml en 25 ml de agua destilada) RESULTADOS: Hemosiderina de color azul.






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RETICULO

1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada. 2. Permanganato de potasio al 0,5 % acidificado por 3 minutos (a 95 mls de

permanganato de potasio al 0,5% agregar 5mls de ácido sulfúrico al 3%) 3. Lavar en agua corriente seguida de agua destilada 4. Acido oxálico hasta decolorar, más o menos 1 minuto. 5. Lavar en agua corriente seguida de agua destilada 6. Mordentar en alumbre férrico al 2,5% por 1 hora a 60°C 7. Lavar en agua destilada 8. Solución de Plata hasta que los cortes se pongan transparentes + ó – 1

minuto (si es solución recién preparada) 9. Lavar en agua destilada 10. Reducir en formalina al 10% por 30 segundos 11. Lavar en agua corriente seguida de agua destilada 12. Virar en Cloruro de oro al 0,2% por 1 minuto 13. Enjuagar en agua destilada 14. Fijación en Hiposulfito de sodio al 2,5% por 5 minutos 15. Lavado completo en agua corriente 16. Si se desea contrastar en safranina 0.5% acuosa. 17. Aclarar y montar.

Solución de plata:

A 5 mls de nitrato de plata acuoso al 10%, agregar amoniaco puro gota a gota hasta disolución del precipitado que se forma. Agregar 5 mls de hidróxido de sodio al 3%. Agregar amoniaco gota a gota hasta disolución del precipitado. La solución debe quedar ligeramente turbia. Completar 50 mls con agua destilada.

RESULTADOS: Fibras retículo de color negro






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ROJO CONGO PARA AMILOIDE

1. Preparar cortes de 10 µm 2. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada. 3. Sobre teñir con Hematoxilina de Harris por 3 min. 4. Lavar en agua 5. Sol. Trabajo 1 por 20 min. 6. PASAR DIRECTO A SOL. 2 7. Sol. Trabajo 2 por 20 min. 8. Lavar 9. Aclarar y montar.

Sol. Trabajo 1: Sol. Alcohol 80º saturada de NaCl 50 ml Sol. Acuosa al 1% NaOH 0.5 ml Utilizar menos de 15 min después de preparada.

Sol. Trabajo 2: Alcohol 80º saturada con NaCl y luego se satura con rojo congo. Al momento de usar se le debe agregar 0.5 ml de NaOH 1%. Filtrar antes de usar. RESULTADOS: Amiloide de color rojo y núcleos de color azules






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VAN GIESON PARA FIBRAS COLAGENOS

1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada. 2. Hematoxilina Verhoeff por 10 min. 3. Lavar agua corriente. 4. Picro- ponceau por 2 minutos. 5. Lavar en alcohol absoluto. 6. Aclarar y montar.

Hematoxilina Verhoeff: Hematoxilina C.I 75290 (3% alcohol absoluto) 3 partes FeCl3 2.5% 2 partes Lugol 1 parte

Picro-Ponceau: Solución acuosa 2% de Ponceau S 5 ml Solución acuosa saturada de ácido pícrico 95 ml Ácido acético glacial 2% 1 ml RESULTADOS: Fibras colágenas de color rojo y núcleos de color negro

VAN GIESON PARA FIBRAS ELÁSTICAS

1. Utilizar Técnica Van Gieson para fibras colágenas, pero la Hematoxilina

DEBE estar recién preparada. RESULTADOS: Fibras elásticas de color negro y núcleos de color negro






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ZIELH –NIELSEN

1. Desparafinar e hidratar hasta el agua destilada. 2. Colocar 1 hora a 65ºC o 30 segundos por 30 ml a potencia máxima en

microondas (portaobjetos con carga) en solución ZN. 3. Alcohol ácido 1 % hasta decolorar. 4. Agua corriente. 5. Azul metileno 0.2% acuosa por 1 segundo. 6. Eliminar exceso con alcohol 100º. 7. Lavar agua corriente. 8. Aclarar y montar.

Solución ZN: Fucsina básica C.I 42510 1gr Alcohol absoluto 10 mls Agua fenicada al 5% 90 mls Mezclar y filtrar.

RESULTADOS: microorganismos de color rojo-rosado y núcleos de color azul.






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HEMATOXILINA-EOSINA

1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada. 2. Tinción nuclear con Hematoxilina de Harris: 14 min 3. Lavar en agua corriente 4. Alcohol acido 0.5%: 1 -3 segundos. 5. Lavar en agua corriente 6. Borato de sodio: 1 min 7. Lavar en agua corriente 8. Eosina 0.5% acuosa: 3 min (0.5%) 9. Lavar en agua corriente 10. Deshidratar, aclarar y montar

Preparación hematoxilina Thermo Cat: 6765015: Disolver contenidos de frascos A Y B de Hematoxilina en polvo marco Thermos en 1200 ml de agua bidestilada. Dejar reposar por al menos 24 horas antes de su uso. Cambiar cada 15 días

Preparación eosina:

Utilizar Eosina Y comercial de marca Thermo lista para usar o en su defecto preparar eosina descrita a continuación:

• Eosina C.I 45380 0.5%: en solución 1:1 agua destilada/etanol

absoluto y agregar 10 gotas de ácido acético glacial por litro. Cambiar una vez al mes

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