Principios de Medición en los productos DiaSys Sustratos€¦ · Creatinina Jaff é • Complejo...

Septiembre 2008/BB

Principios de Medición en los productos DiaSys

–

Sustratos

Productos DiaSys

• Química Clínica– Sustratos

– Enzimas

• Inmunoturbidimetría

• Calibradores/Controles

• Instrumentos

Definición

• Las enzimas son proteínas que catalizan las reacciones químicas

• Las enzimas no cambian durante la reacción

• Algunas enzimas requieren moléculas no proteicas (cofactores/coenzimas) para tener actividad de enlace

• Son usualmente nombradas de acuerdo a la reacción que ellas catalizan, el sufijo –asa es adicionado al nombre del sustrado o el tipo de reacción

Nomenclatura para enzimas

• Clasificación de nivel superior

– EC 1: Oxidoreductasas: catalizan oxidación / reducción

– EC 2: Transferasas: transferencia de un grupo funcional

– EC 3: Hidrolasas: catalizan hidrolisis

– EC 4: Liasas: ruptura de enlaces

– EC 5: Isomerasas: catalizan cambios de isomerización en una sola molécula

– EC 6: Ligasas: unen dos moleculas con enlaces covalentes

Describe la forma en que la enzima cataliza la reacción

El sitio activo de la enzima, une una molécula de sustrato formando un complejo enzima - sustrato.

“ Modelo de llave y cerradura”

Enzimas

• ALAT(GPT) EC 2

• ASAT (GPT) EC 2

• Fosfatasa Alcalina EC 3

• α -Amilasa EC 3

• Amilasa Pancreatica EC 3

• Colinesterasa EC 3

• CK-NAC EC 2

• CK-MB EC 2

• Gamma-GT EC 2

• GLDH EC 1

• α-HBDH EC 1

• LDH EC 1

• Lipasa EC 3

Enzimas –Principios de Medición

• Deshidrogenasas como indicador de enzimas, procesando NAD/NADP

• Otras reacciones redox

• Colorantes separadoras de enzimas


Deshidrogenasas como indicador de enzimas, procesando NAD/NADP

• NAD/NADP trabaja como aceptor de hidrógeno

• NAD es una coenzima cuya presencia es requerida para la actividad de la enzima – fuertemente unida a la enzima

Enzimas –Deshidrogenasas/NAD-NADP

• ALAT(GPT)

• ASAT (GOT)

• CK-NAC

• CK-MB

• GLDH

• α-HBDH

• LDH

Enzimas –Deshidrogenasas/NAD-NADP

• Por ejemplo. ALAT(GPT) EC 2 Transferasa

L-Alanina + 2-Oxoglutarato L-Glutamato + Piruvato

Piruvato + NADH + H+ L-Lactato + NAD+

ALAT

LDH

Medición de NADH a 340 nm

Enzimas –Deshidrogenasas/NAD-NADP• Por ejemplo ALAT(GPT)/ASAT (GOT)

“Transaminasas”

• El método IFCC requiere la adición de Piridoxal-5-fosfato (Pyp, P-5-P) al reactivo 1

• Pyp es un cofactor que puede estar contenido en una insuficiente cantidad de muestras de pacientes con infarto al miocardio / enfermedades de riñón / dialisis. Éste cofactor estabiliza a las transaminasas y previene falsos valores bajos en muestras de esos pacientes.

Enzimas – otras reacciones Redox

Colinesterasa EC 3 Hidrolase

• La Colinesterasa hidroliza a la butiril tiocolina liberandoácido buririco y tiocolina.

• La tiocolina reduce al hexacianoferrato de potasio III (amarillo) a hexacianoferrato de potasio II (incoloro).

• Medición del hexacianoferrato de potasio III a 405 nm

Enzimas – colorantesseparadores

• Fosfatasa Alcalina• α-Amilasa• Amilasa Pancreatica• Lipasa• Gamma-GT

• Por ejemplo Fosfatasa Alcalina (FAlc) EC 3 Hidrolasa

p-Nitrofenilfosfato + H2O

Fosfato + p-Nitrofenol

p-Nitrofenol (amarillo) es medido a 405 nm (400 – 420 nm)

FAlc

Enzimas – colorantesseparadores

Enzimas - Métodos

• IFCC/DGKC

Gamma-GT

IFCC: International Federation of Clinical Chemistry (Federación Internacional de Química Clínica)DGKC: Deutsche Gesellschaft für Klinische Chemie (Sociedad Alemana de Química Clínica)

• Diferentes recomendaciones de IFCC y DGKC para la determinación of enzimas

• La medición de las enzimas debe ser hecho a 37 °C.

• Obligatorio para laboratorios alemanes: recomendaciones de IFCC en la medición a 37 °C para:CK, GOT (ASAT), GPT (ALAT), LDH, Gamma-GT (2003) Amilasa (2006)

• Se deben seguir las recomendaciones de IFCC a 37 °C para FAlcy Lipasa

Productos DiaSys


– Enzimas



• Instrumentos

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Productos DiaSys


– Enzimas



• Instrumentos

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Sustratos• Albúmina• ATP• Bicarbonato• Bilirrubina Auto Directa• Bilirrubina Auto Total• Calcio AS• Calcio CPC• Cloruro• Colesterol• Colesterol Libre• Creatinina• Creatinina PAP• Hierro• Etanol• Proteínas Totales• Proteínas Totales en Orina

• Glucosa GOD• Glucosa Hexoquinasa• ß-Hidroxibutirato• Ácido Úrico TBHBA• Ácido Úrico TOOS• Urea• Lactato• Homocisteina• HDL-C• LDL-C• Magnesio• Fosfato• Triglicéridos

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Sustratos –Principios de Medición

• Formación de complejos

• Reacciones Redox – Oxidasas – Trinder

• Reacciones Redox – Deshidrogenasas

• Otras

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Sustratos –Formación de complejos• Albúmina• Calcio• Cloruro• Creatinina Jaffé• Hierro• Magnesio • Fósforo• Proteínas Totales• Proteínas Totales en Orina

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Albúmina • Complejo de absorción con verde de bromocresol (BCG)• Verde-amarillo à azul-verde• Medición a 540 – 600 nm, Hg 546 nm

Creatinina Jaffé• Complejo de absorción con ácido pícrico en solución alcalina• Coloración naranja-rojo• Medición a 500 nm, Hg 492 nm

Sustratos –Formación de complejos

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Proteínas Totales – Método de Biuret• Complejo de absorción de proteína y cobre en solución alcalina• Coloración azul-púrpura• Medición a 540 nm, Hg 546 nm

Proteínas Totales en orina• Complejo de absorción de pirogallol/molibdato• Coloración roja• Medición a 600 nm (580 – 620 nm), Hg 578 nm


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Calcio Arsenazo (AS)• Complejo de quelación con Arsenazo III• Coloración azul• Medición a 650 nm (630 – 670 nm), Hg 623 nm

Calcio Fhosfonazo (P) NEW• Complejo de quelación con Phosphonazo III• Coloración Púrpura-azul• Medición a 660 nm

Calcio CPC• Complejo de quelación con o-Cresolftaleina (CPC)• Coloración rojo-púrpura• Medición a 570 nm (550 – 590 nm), Hg 578 nm

• Método Alternativo en caso de longitud de onda de 650 nm no esta disponible

Substratos –Formación de complejos

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Fosfato• Complejo de absorción fosfato/molibdato• Absorción en el rango UV• Medición a 340 nm, Hg 334, 365 nm

Magnesio XL• Complejo de quelación con azul de xilidil• Coloración púrpura• Medición a 520 nm (500 – 550 nm), Hg 546 nm

Incremento de absorbancia• Medición a 628 nm (570 – 650 nm), Hg 623 nm

Decremento de absorbancia


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Hierro

• Complejo de quelación con ferrozina

• Coloración azul

• Medición a 595 nm (600 nm), Hg 623 nm


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Cloruro• Método de Tiocianato• El Cloruro libera al grupo tiocianato del tiocianato de

mercurio II (reacción de desplazamiento)• El Tiocianato forma un complejo rojo con los iones de

hierro• Medición a 463 nm

Hg(SCN)2 + Cl- à Hg(Cl)2 + SCN-

Fe3+ + SCN- à Fe(SCN)3


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• Otras

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Sustratos – Reacciones Trinder

• Colesterol• Creatinina PAP• Glucosa GOD• Ácido Úrico TBHBA + TOOS• HDL-C• LDL-C• Triglicéridos

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• H2O2 es liberado por la oxidasa

• H2O2, 4-aminoantipirina y fenol (o componente similar) reaccionan a un colorante de quinonaimina

Las reacciones Trinder se caracterizan por seguir estos últimos pasos de reacción:


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Las reacciones Trinder se caracterizan por seguir estos últimos pasos de reacción:

Derivados del Fenol o anilina pueden ser usados en lugar del fenol. Esto puede conducir a un coeficiente de absortividad molar mas alto (à señal mas grande)

Oxidasaà H2O2


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Éster de Colesterol + H2O CHE > Colesterol + ácido graso

Colesterol + O2CHO > Colesterol-3-ona + H2O2

2 H2O2 + 4-Aminoantipirina + Fenol POD >

Quinonaimina + 4 H2O

Ejemplo Colesterol FS


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• Coloración estable debido al enlace, normalmente no hay reacción reversible àpunto final estable

• Bajas interferencias comparadas contra tintes Redox

Ventajas de las reacciones Trinder


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Ejemplos de componentes de enlaceTrinder en reactivos DiaSys

Colesterol, Glucosa

Trigicéridos

Ácido Úrico TBHBA = 2,4,6-Tri-bromo-3-hydroxy benzoic acid

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Examples for Trinder coupling components in DiaSys reagents

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• Otras

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Sustratos – Reacciones Redox con deshidrogenasa• Glucosa Hexoquinasa• Urea cinética• Bicarbonato• ATP• Etanol• Lactato• Homocisteina

Medición de NADH at 340 nm, ε constante

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• Ejemplo Glucosa Hexoquinasa

Glucosa + ATP Glucosa-6-P + ADP

Glucosa-6-P + NAD Gluconato-6-P + NADH

Hexoquinasa

G-6-PDH

Sustratos – Reacciones Redox con deshidrogenasa

G-6-PDH = Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa

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• Otras


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Sustratos –otros principios de medición

Bilirrubina Auto Total Bilirrubina Auto Directa

• Enlace Diazo• Formación de un azocompuesto rojo• Medición a 546 nm (540 – 560 nm)

• Directa: mediciones solubles en agua, bilirrubina conjugada

• Total: detergentes liberan también la bilirrubina conjugada à medición de bilirrubina total

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Productos DiaSys


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