UNIVERSIDAD DEL CAUCAFACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, EXACTAS Y DE LA EDUCACIÓN

DEPARTAMENTO DE QUÍMICAQUÍMICA ORGÁNICA AVANZADA

PORTILLA O.M.

1. Compuestos orgánicos usados como indicadores bioquímicos

FUCSINA

Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen (que incluye Fucsina y azul de metileno) requiere calentamiento para que el colorante Fucsina atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste

2,6-DICLOROFENOL INDOFENOL (DCPIP)

Se trata de un colorante redox, usado en la determinación de la velocidad de las reacciones lumínicas como la fotosíntesis, ya que se trata de un aceptor de electrones, de color azul cuando se encuentra en su estado oxidado e incoloro cuando se reduce. La velocidad de la reacción fotolumínica de la fotosíntesis puede ser cuantificada por ésta propiedad dado que una de sus etapas involucra, la cadena de transporte electrónico que termina con la reducción del NADP+.

Cuando el DCPIP está presente, se reduce por la reacción lumínica. La cantidad de DCPIP reducida puede ser cuantificada por la absorbancia de la solución en un espectrofotómetro.

SAFRANINA

Cloruro de 3,7-diamino-2,8-dimetIl-5-fenilfenazinio

Este colorante se utiliza en la Tinción de Gram para proporcionar un color violeta más intenso a las bacterias Gram+ y tiñe de rosa a las bacterias G-, en histología y en citología. La safranina se usa como líquido de contraste en algunos protocolos de tinción, coloreando el núcleo celular de rojo. También para detectar cartílago, mucina y gránulos de mastocitos.

AZUL DE TRIPANO

Ácido (3Z,3'Z)-3,3'-[(3,3'-dimetilbifenil-4,4'-diil)di(1Z)hidracin-2-il-1-ilideno]bis(5-amino-4-oxo-3,4-dihidronaftaleno-2,7-disulfónico

Es un pigmento usado para la determinación de la viabilidad celular, basado en la exclusión de pigmentos por las células vivas, las células vivas, no son teñidas por este compuesto dado que no puede atravesar la pared celular, por el contrario las células muertas aparecen teñidas de color azul.1

2. Compuestos orgánicos usados como medicamentos

MERCURIOCROMO

1 Julio Coll Morales, Técnicas de Diagnóstico en virología, Ediciones Días de Santos, Madrid , 1993.

Fue desarrollado para el tratamiento de infecciones internas actualmente es utilizado como antiséptico 2 en soluciones del 1 al 2.5%, por su fuerte coloración es también usado como agente en la inspección por líquidos penetrantes en superficies de diferente tipo de materiales.

2 Thayer J.S Teaching bio-organometallic chemistry, JACS, Vol.54, No 11, 1977.

3A, 4-DIHIDRO-3H-INDENO[1,2C]PIRAZOL-2-CARBOXAMIDA (1)3A, 4-DIHIDRO-3H-INDENO[1,2C]PIRAZOL-CARBOTIOAMIDA (2)

Estos derivados de pirazolina, son ampliamente estudiados debido a su posible uso como agentes antimicrobianos y antivirales3

3 Mohamed Jawed Ahsan , Jeyabalan Govindasamy , Habibullah Khalilullah, Govind Mohan,James P. Stables, Christophe Pannecouque, Eric De Clercq. POMA analyses as new efficient bioinformatics’ platform to predict and optimize bioactivity of synthesized 3a,4-dihydro-3H-indeno[1,2-c]pyrazole-2-carboxamide/carbothioamide analogues. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 22 (2012) 7029–7035

ÁCIDO SALASPÉRMICO

ácido (3S,5aR,7bR,9aS,12R,13bS,15aR,16R)-3-hidroxi-7b,9a,12,13b,15a,16-hexametilicosahidro-1H-3,5a-metanocriseno[2,1-c]oxepin-12-carboxílico

Se trata de un ácido triterpénico, que ha sido aislado en Tripterygium Wifordii. Este ha mostrado tener poder inhibitorio en la replicación del VIH en células de linfocito H9. Otros compuestos como

los gránulos de Salvia Plebeia, han mostrado tener una actividad antibacterial contra las infecciones del tracto urinario4.

TRIPTERFORDINA

(4R,4aS,6aS,8R,9R,11aR,11bR)-8-hidroxi-4,8-dimetildodecahidro-1H-6a,9-metano-4,11b-(metanooximetano)ciclohepta[a]naphtalen-14-ona

4 John Wing Shing Ho, Bioactive Herbal Alkaloids as Anti-Infective Agents, Anti-Infective Agents, 2013, 11, 70-74

Al igual que el ácido salaspérmico muestra poder anti-replicatorio en células de linfocito H9 con un EC50 de 1µg/mL3.

ZANAMIVIR

Ácido (2R,3R,4S)-4-guanidino-3-(prop-1-en-2-ilamino)-2-((1R,2R)-1,2,3-trihidroxipropil)-3,4-dihidro-2H-piran-6-carboxílico

Es un inhibidor de la neuraminidasa (NA), el cápside del virus de la gripe común de ésta forma es capaz de aislar el sitio activo de la proteína del virus impidiendo que salga de su célula huésped lo que previene su dispersión sin embargo su absorción intestinal es bastante baja, por lo que se

suministra en forma de spray, esto ha llevado a investigar sus prodrogas a partir de su condensación con aminoácidos5.

3. Compuestos orgánicos usados en la inmovilización, separación y precipitación de enzimas, proteínas y ácidos nucleicos

1,4-BUTANODIOL-DIGLICIDOXIÉTER (BDE)

1,4-bis(oxiran-2-ilmetoxi)butano

5 Sheeba Varghese Gupta, Deepak Gupta, Jing Sun, Arik Dahan, Yasuhiro Tsume, John Hilfinger, Kyung-Dall Lee y Gordon L. Amidon. Enhancing the Intestinal Membrane Permeability of Zanamivir: A Carrier Mediated Prodrug Approach. Mol. Pharmaceutics 2011, 8, 2358–2367

Corresponde a un brazo espaciador para la inmovilización de enzimas, es decir, una molécula bifuncional la cual puede enlazarse en un extremo a una superficie, y con el otro extremo enlazarse a la enzima u otra molécula afín. Se usa para fijar enzimas en diferentes soportes que no cuentan con grupos activos, como el vidrio poroso, las dextranas, agarosas, silicatos de aluminio, y óxidos metálicos6,7.

ÁCIDO TÁNICO

(2R,3S,4S,5R,6S)-tetrahidro-2H-piran-2,3,4,5,6-pentail pentakis(3,4-dihhidroxi-5-((3,4,5-trihidroxibenzoil)oxi)benzoato)

6 Guadalupe Pensol Alonso, Diseño de herramientas bioquímicas para la ingeniería molecular de derivados inmovilizados de renina y β-galactosidasa. Memoria para optar al título de Doctor en Farmacia Universidad Complutense de Madrid. 1996.7 Luis rolando Díaz Alzate, Francisco Javier Arias Vargas. Inmovilización de pectinasas y/o celulasas y determinación de algunos de sus efectos en el jugo de guayaba . Trabajo de grado para optar al título de ingeniero químico Universidad Nacional de Colombia. 2002.

Este compuesto ha sido ampliamente usado en el curtido del cuero, astringente y antiinflamatorio, sin embargo, es conocida su propiedad de precipitar proteínas, péptidos y compuestos nitrogenados. En estudios recientes8, muestran que el ácido tánico es capaz de precipitar arginina, insulina, proteínas, poliaminas, bases nitrogenadas, quitina y quitosano, por lo que puede ser aprovechado para controlar la relación de nitrógeno en el suelo ya que modula la precipitación de los compuestos nitrogenados y variados usos analíticos que involucren la separación de estos compuestos.

8 Bartosz Adamczyk, Sylwia Adamczyk, Aino Smolander, Veikko Kitunen. Tannic acid and Norway spruce condensed tannins can precipitate various organic nitrogen compounds. Soil Biology & Biochemistry 43 (2011) 628-637.

TINTES DERIVADOS DE ANTRAQUINONA

(Derivados de 1-amino-4-((4-((4-cloro-6-(Fenilamino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-3-sulfonatofenil)amino)-9,10-dioxo-9,10-dihidroantraceno-2-sulfonato)

Para la cromatografía de afinidad se necesitan ciertos ligandos que correspondan con las conformaciones específicas de proteínas o enzimas que vayan a ser separadas. Los ligandos derivados de antraquinona tienden a ser aniónicos, debido a que los cromóforos cargados de éstos

ligandos mimetizan el enlace natural de heterociclos aniónicos como el NAD+, NADP+, ATP, Coenzima A, folato, piridoxal fosfato, oligonucleótidos y polinucleótidos9. Esto hace que permitan ser específicas para la purificación del la alcohol deshidrogenasa del hígado (ADH) del hígado de caballo y la fosfatasa alcalina de los intestinos de vaca.

PIGMENTOS BIOMIMÉTICOS BENZAMIDINO-TRIAZINA

1. amino(4-((4-((4,6-dicloro-1,3,5-triazin-2-Il)amino)-2-metilfenill)diazenil)fenil)metani minio2. 4-((4-((4-((4-(amino(iminio)metil)fenil)diazenil)-3-metilfenil)amino)-6-cloro-1,3,5-triazin-2-il)amino)-N,N,N-

trimetilbenzenaminio

9 Christopher R. Lowe, Steven J. Burton, Nicolas P. Burton, Wendy K. Alderton, Jennifer M. Pittis and Jeanette A. Thomas. Designer dyes: “biomimetic” ligands for the purification of pharmaceutical proteins by affinity chromatography. TIBTECH, Vol. 10, 1992.

En los extractos pancreáticos además de tripsina y quimiotripsina, se encuentra también otra proteasa conocida como calicreína, mientras que la tripsina se adsorbe sobre el tinte monocatiónico inmovilizado A, la calicreína no lo hace, por eso para su separación se hace necesario un ligando que no sea afín ni a la tripsina ni a la quimiotripsina, por tal razón se desarrollan ligandos bi-catiónicos como B. Ésta forma inmovilizada enlaza a la calicreína de un extracto pancreático crudo con un rendimiento del 79%, generando un producto 99% libre de actividad contaminante de tripsina10.

N-BENCILOXICARBONIL-L-TIROSINA

Bencil (3-(4-hidroxifenil)-1-(1H-imidazol-1-il)-1-oxopropan-2-il)carbamato10 Y.D. Clonis, N.E. Labrou, V.Ph. Kotsira, C. Mazitsos, S. Melissis, G. Gogolas. Biomimetic dyes as affinity chromatography tools in enzyme purification. Journal of Chromatography A, 891 (2000) 33–44

Este es un ligando utilizado en la cromatografía de afinidad para la purificación de IgG (inmunoglobulina G) del plasma humano, éste compuesto se soporta en geles Sepharose CL-4B. El análisis de las isotermas de enlace para el adsorbente indica una constante de asociación (Ka) entre este ligando y la IgG de 4.91X106 y una capacidad máxima de adsorción de 17.3mg IgG/mL de gel. La IgG puede obtenerse co un pureza del 98%11.

11 Hongqin Feng, Lingyun Jia, Honglin Li y Xicheng Wang. Screening and chromatographic assessing of a novel IgG biomimetic ligand. Biomed. Chromatogr. 20: 1109–1115 (2006)

ÁCIDO DESOXICÓLICO (DOC)

Ácido (R)-4-((3R,5R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,12-dihidroxi-10,13 dimetilhexadecahidro-1H-ciclopenta[a]phenantren-17-il)pentanoico

Es un ácido biliar, producto metabólico de las bacterias intestinales, es usado como detergente en procesos de precipitación de proteínas.

Principalmente para solubilizar membranas celulares y virales con el objetivo de aislar y caracterizar ciertos antígenos, proteínas cromosómicas, antígenos de linfocitos, y varias enzimas enlazadas a membranas12.

TRITON X-100

12 Louis F. Qualtiere, Amil G. Anderson, y Paul Meyers. Effects of ionic and nonionic detergents on antigen antibody reactions. The journal of immunology. Vol. 119, No. 5, November 1977

t-octilfenoxipolietoxietanol

Se trata de un surfactante no iónico, se usa frecuentemente como un auxiliar de disolución para proteínas integrales en medios acuosos; no obstante debe usarse a la concentración mínima posible con el objeto de no contaminar la muestra, lo que alteraría la determinación de trazas en espectroscopia de masas de la disolución resultante, es también usado como humectante en medios de cultivo antes de la realización de tinciones 13.

DODECILSULFATO DE SODIO

13 MSDS, product information, Triton X-100, Sigma- Aldrich

Es un surfactante del tipo iónico usado en la preparación de proteínas para electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). El SDS actúa rompiendo enlaces no covalentes en las proteínas, desnaturalizándolas, provocando que estas moléculas proteicas pierdan su conformación nativa. Esto ocurre porque el SDS se une a las zonas apolares del polipéptido. Además, la cantidad de SDS unido es similar para muchas proteínas: una molécula de SDS por cada dos residuos aminoácidos, correspondiendo a unos 1,4 g SDS/g proteína. Ello proporciona al polipéptido una carga negativa que resulta proporcional a la longitud de la cadena (el número de aminoácidos) y, por tanto, a la masa molecular de la proteína. Este aporte de carga negativa es sustancialmente mayor que la carga original de la proteína. La repulsión electrostática creada por la unión del SDS a la proteína es uno de las causas de que la proteína pierda su conformación nativa, eliminándose de este modo las diferencias en conformación de las diferentes proteínas que han de ser separadas en el gel14.

CHAPS14 SDS, [En línea], Marzo de 2013,[03 de marzo de 2013], disponible en la web: http://es.wikipedia.org/wiki/Dodecilsulfato_s%C3%B3dico

3-[(3-Colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato

CHAPS es un detergente zwitteriónico usado para solubilizar macromoléculas biológicas tales como proteínas. Es usado como un solvente no desnaturalizante en los procesos de purificación de proteínas y es especialmente usado en la purificación de proteínas de membrana, las cuales son

muy solubles o insolubles en soluciones acuosas debido a su hidrofobicidad nativa. CHAPS puede ser usado también puede usarse junto con detergentes no iónicos tales como el Tritón X-100 15

γ-AMINOFENL-ATP (AC-101)

El AP-ATP es inmovilizado sobre un gel de agarosa por la función fenilo con el objetivo de usarlo como ligando en cromatografía de afinidad. Los rellenos de ATP-Agarosa pueden enlazar a proteínas de enlace del ATP como quinasas, deshidrogenasas, etc. En este caso siendo mimético a un residuo de tirosina, hace que este material esté disponible para las tirosina quinasas (aunque las serina/treonina quinasas también podrían unirse)16. Para soportarse se utilizan brazos espaciadores consistentes en 10 grupos metilenos.

15 MSDS, product information, CHAPS, Sigma- Aldrich16 Haystead et al. (1983) Gamma-phosphate-linked ATP-sepharose for the affinity purification of protein kinases- rapid purification to homogeneity of skeletal muscle mitogen-activated protein kinase kinase. Eur.J. Biochem. 214 (2):459.

N-LAURILSARCOSINATO DE SODIO

2-(N-metildodecanamido)acetato de sodio

También conocido como sarkosyl, es un surfactante iónico usado para inhibir la iniciación de la transcripción del DNA, se relaciona estructuralmente a SDS, sin embargo, cuenta con un enlace adicional tipo peptídico (amido), dentro de la cadena principal hidrófoba. Esto brinda rigidez y conduce a una disminución de su capacidad para insertarse en membranas de bicapas hidrofóbicas y de proteínas. Esto explica porque es más suave que el SDS en su capacidad para desnaturalizar y romper la membrana y las estructuras de proteínas. Sus usos más comunes corresponden a la purificación de los factores sigma de la RNA polimerasa de Escherichia coli por solubilización de los cuerpos de inclusión, y la solubilización y purificación de la proteína de la tembladera (Scrapie protein) o proteína de los priones PrPSc. Al ser ampliamente eficiente para disociar nucleosomas y ribosomas su principal uso ha sido aislar ADN y ARN. También puede desnaturalizar los ácidos nucleicos e inhibir ciertas enzimas como desoxirribonucleasas y ribonucleasas que pueden degradar éstas moléculas17.17 MITRA S. Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry. Copyright © 2003 by John Wiley & Sons, Inc. All rights reserved. Pág. 341-342.

BROMURO DE CETILTRIMETILAMONIO (CTAB)

Bromuro de N, N, N-trimetilhexadecanamonio

El CTAB es un detergente catiónico que tiene la propiedad de precipitar ácidos nucléicos y polisacáridos ácidos en soluciones de baja concentración iónica. Bajo estas condiciones las proteínas y los polisacáridos neutros permanecen en solución. En soluciones de alta concentración iónica el CTAB forma complejos con las proteínas y polisacáridos pero no precipita ácidos nucleicos. Por esta razón es especialmente útil para precipitar ADN genómico de organismos que producen grandes cantidades de polisacáridos como las plantas y algunas bacterias Gram negativas (incluyendo algunas cepas de E. coli)18.

3, 3´-DIAMINOPLOPILAMINA (DADPA)18 CTAB, [En línea], Marzo de 2013,[03 de marzo de 2013], disponible en la web: http://en.wikipedia.org/wiki/Cetyl_trimethylammonium_bromide

N1-(3-aminopropil)propano-1,3-diamina

Se usa como brazo espaciador para soportar ligandos con funcionalidades carboxilo, sobre geles de agarosa activadas con CNBr, antes de enlazarse al soporte la amina también debe ser activada con CNBr.

BIOTINA

Ácido 5-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanoico

Se utiliza en procesos de biotinilación, que consisten en enlazarla a través del grupo carboxilo a grupos amino libres, usándose en cromatografía de afinidad con una columna que contiene avidina (también estreptavidina o neutravidina), que son sus ligandos naturales. Sin embargo para romper la interacción entre la biotina y el ligando se hacen necesarias condiciones bastante fuertes (6M de 6GuHCl a pH 1,5) que pueden llevar a desnaturalizar la proteína biotinada (o marcada con biotina), por lo que si se hace necesario aislar la proteína marcada se prefiere usar iminobiotina, que es mucho más fácil de liberar (usando un pH alrededor de 4)19,20

DL-DITHIOTHREITOL (DTT)19 Hofmann, Klaus; Wood, Sara W.; Brinton, Charles C.; Montibeller, Judith A.; Finn, Frances M. (1980)."Iminobiotin Affinity Columns and Their Application to Retrieval of Streptavidin". Proceedings of the National Academy of Sciences 77 (8): 4666–8

(2R,3R)-1,4-dimercaptobutano-2,3-diol

20 Sugawara, Kazuharu; Kamiya, Naoto; Hirabayashi, George; Kuramitz, Hideki "Voltammetric Homogeneous Binding Assay of Biotin without a Separation Step Using Iminobiotin Labeled with an Electroactive Compound". Analytical Sciences 21(8). (2005). 897–900

Es un agente reductor de puentes –S-S- a –SH. En esta reacción el DTT es oxidado a un sulfuro cíclico. La reducción de los sulfuros se completa en minutos a pH 8. Un uso común del DTT es como agente desprotector del DNA tiolado21.

4. Compuestos orgánicos usados como tampones

TRIS

2-amino-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol

21 Cleland, W. W. "Dithiothreitol, a new protective reagent for SH groups". Biochemistry (1964).: 480–482.

TRIS y sus sales son usados para la preparación de buffers en una variedad grande de sistemas biológicos y bioquímicos ya que su intérvalo útil de tamponamiento va de 7 a 9 unidades de pH. Sus usos incluyen el control in vivo e in vitro. Para fluidos corporales y como agente alcalinizante en el tratamiento de acidosis en la sangre22.

PIPES

22 MSDS, product information, TRIS, Sigma- Aldrich

Ácido 2,2'-(piperazin-1,4-diil)dietanosulfónico

Es un miembro de la serie de los ácidos etanosulfónicos, introducido por Good et. al., desarrollado para tener las siguientes propiedades: valores medios de pKa, máxima solubilidad en agua y mínima solubilidad en otros solventes, mínimos efectos salinos, poca variación en el valor de pKa debido al cambio de temperatura, estabilidad química y enzimática y mínima absorción en el UV. Ya que su pKa a 37°C e cercano al pH fisiológico es usado en trabajos de cultivos celulares. También se usa en la fijación de glutaraldehído en muestras de tejido de plantas y animales para evitar pérdida de lípidos o cuando se fijan organelos de hepatocitos de rata con cacodilato tamponado con glutaraldehído ya que retiene la actividad de la fosfatasa alcalina hasta en un 60%23,24.

23 MSDS, product information, PIPES, Sigma- Aldrich24 Yamamoto, K. and Ogawa, K., Histochemistry, 77, 339 (1983)

HEPES

Ácido 2-(4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il)etanosulfónico

Se trata de uno de los mejores tampones multipropósito, a pH fisiológico la molécula es zwitteriónica, siendo un buffer efectivo a pH entre 6.8 y 8.2. Se usa en cultivos de tejido, es el buffer indicado para la deposición de proteínas en la microscopía electrónica porque no afecta los sustratos metálicos. Sin embargo, interfiere en la determinación de proteínas por el método de Folin-Ciocalteu25,26.

25 MSDS, product information, HEPES, Sigma- Aldrich26 Good, N.E., et al., Biochemistry, 5, 467 (1966)

TES

Ácido 2-((1,3-dihidroxi-2-(hidroximetil)propan-2-il) amino)etanosulfónico

Este compuesto forma un buffer zwitteriónico, usado en un rango de pH de 6.5 a 7.9 a 37°C. Es usado en estudios de interacción de proteoglicanos con colágeno del tipo I, y en estudios de interacción de vesículas de fosfolípidos con poli(L-lisina)27,28.

27 Pogany, G., et al., The in vitro interaction of proteoglycans with type I collagen is modulated by phosphate. Arch. Biochem. Biophys., 313(1), 102- 111 (1994).28 MSDS, product information, TES, Sigma- Aldrich