Presentacin de PowerPoint

Universidad de El SalvadorFacultad de Ciencias Naturales y MatemticaEscuela de Biologa.

Marcadores basados en PCR y Polimorfismo de ADN amplificado arbitrariamente (RAPD).

Marcadores basados en PCRReaccin en cadena de la Polimerasa.

La tecnologa de la reaccin en cadena de la polimerasa fue concebida por Kary Mullis a mediados de la dcada del 80, la cual revoluciono la biologa en las reas de mejoramiento gentico de plantas y animales domsticos.

Muchos mtodos tradicionales de clonacin, secuenciacin y anlisis de polimorfismo de ADN fueron acelerados o sustituidos por el uso de las numerosas derivaciones de la tcnicas de PCR. Una de estas tcnicas es la tecnologa RAPD que comprende la amplificacin simultanea de varios loci annimos en el genoma utilizando primers (iniciadores) de secuencia arbitraria.

La PCR es una tcnica que comprende la sntesis enzimtica In Vitro de millones de copias de un segmento de ADN en presencia de la ADN polimerasa.

La reaccin de PCR se basa en el apareamiento y la polimerizacin enzimtica de un par de oligonucletidos utilizados como iniciadores (primers) que delimitan la secuencia de ADN de doble cadena, blanco de la amplificacin. Estos Primers son sintetizados artificialmente de manera que sus secuencias de nucletidos sean complementarios a las secuencias especificas de la regin blanco. Ciclo de PCR

Polimorfismo de ADN amplificado arbitrariamente (RAPD).Gracias a la tcnica de la PCR fue posible generar grandes cantidades de ADN de segmentos especficos del genoma. El ADN en grandes cantidades puede ser detectado fcilmente a simple vista directamente en gel de electroforesis atraves de colorantes especficos para ADN (Bromuro de etidio).

El gran avance en el rea de marcadores moleculares basados en PCR ocurri en 1990, con la idea de utilizar primers mas cortos y de secuencia arbitraria para dirigir la reaccin de amplificacin, eliminando la necesidad del conocimiento previo de la secuencia.

Esto permiti abrir una perspectiva enteramente nueva para el anlisis genmico de individuos y poblaciones.

Desde su descripcin el uso de marcadores RAPD en el anlisis gentico y mejoramiento de plantas ha tenido una rpida difusin.Aplicaciones:Base Gentica de los marcadores RAPD.Bsicamente RAPD es una variacin del protocolo de PCR, con dos caractersticas distintas:

Base molecular de los loci RAPD.La base molecular del polimorfismo RAPD no es enteramente conocida.

Evidencias experimentales indican que diferencias de un solo par de bases (mutaciones de punto) son suficientes para causar la no complementariedad del primer con el sitio de iniciacin e impedir as la amplificacin del segmento.

Datos experimentales de mapeamiento gentico en diversas especies indican que los loci de marcadores RAPD estn distribuidos al azar a lo largo del genoma, sin evidenciar agrupamiento de marcadores en regiones especificas.

Las secuencias internas de los segmentos amplificados incluyen desde secuencias de copia nica hasta secuencias altamente repetitivas.

Incremento del nivel de polimorfismo de marcadores RAPD.El uso de dos primers arbitrarios pueden ser usados para aumentar la cantidad de polimorfismo gentico.

De esta forma se esperara, un incremento de bandas cuatro veces mas a partir de un reaccin con dos primers que con dos reacciones separadas, cada una utilizando un primer individualmente.La combinacin de primers resulta en la perdida de identidad de los fragmentos amplificados, ya que un segmento puede ser el resultado de la amplificacin mediada por uno u otro primer o por la combinacin de ambos.

La digestin enzimtica de varios segmentos amplificados RAPD o de segmentos individuales reamplificados es una de las alternativas para detectar el polimorfismo adicional entre bandas monomorficas ( mismo tamao en pares de bases y las mismas secuencias en las extremidades donde el Primer inicio la amplificacin).

Otra estrategia para extraer mas polimorfismo a partir de un segmento de RAPD monomorfico es la del mtodo de SSCP (Single Strand Conformation Polimorphism) o polimorfismo de conformacin de cadena simple.

Competicin por sitios de amplificacin RAPD.

Tericamente, el numero de marcadores RAPD amplificados y visualizados en la electroforesis depende exclusivamente de la longitud del primer utilizado y del tamao y complejidad del genoma analizado.

La frecuencia de amplificacin de un segmento depende de la probabilidad de que el primer utilizado encuentre dos secuencias complementarias (sitios de iniciacin) en orientacin opuesta a lo largo del ADN y a una distancia amplificable, o sea como mximo algunos miles de pares de bases.Estudios realizados demuestran que el numero de bandas obtenido es independiente de la complejidad del genoma. Es decir el numero de bandas amplificadas a partir de genomas mas simples como los de Cianobacterias es semejante a los amplificados a partir de genomas mas complejos como el de soja.

La reaccin RAPD favorece la amplificacin de segmentos donde la complementariedad entre el primer y el sitio de iniciacin en el ADN molde es mas alta.La disponibilidad de sitios de amplificacin con mayor numero de bases en un genoma, resulta en una mejor competitividad de esos sitios y con esto la amplificacin preferencial, aun si hay presencia de exceso molar de ADN de otro genoma.Dominancia de los marcadores RAPD.

Una caracterstica fundamental de los marcadores RAPD es su comportamiento como marcadores genticos dominantes.

Al observar una banda RAPD en el gel no es posible distinguir si aquel segmento se origino a partir de una o de dos copias de la secuencia amplificada.Un individuo diploide homocigtico(AA): a partir de estos alelos dominantes se produce la amplificacin

Un individuo heterocigtico (Aa): el alelo A es amplificado, mientras que el alelo a no es amplificado.

En RAPD el genotipo homocigtico recesivo (aa) es identificado por la ausencia de la banda en el gel (fenotipo nulo), los genotipos homocigticos dominante (AA) y heterocigtico (Aa) son considerados como una misma clase fenotpica, esto es la presencia de las bandas en el gel.

Ventajas de marcadores RAPD.

Limitaciones de los marcadores RAPD.

As como para todos los tipos de marcadores moleculares, en el caso de los marcadores RAPD algunas bandas so fcil y claramente interpretadas, mientras que otras son ambiguas, esta ambigedad puede resultar de:

Esquema para realizar el anlisis RAPD RAPD.

Descongela el primer y la mescla maestra.Hervir agua en un Beaker.Rotular los tubos ependorf.Agregar a cada tubo 20 l de mescla maestra, mas 1.5 l de primer por cada muestra a analizar.Adiciona un l de ADN a cada tubo.Microcentrifugar lentamente por pocos segundos.Adicionar 35 l de aceite mineral.Colocar los tubos en la rejilla, hervir por 10 min.Prepara el termociclador.Preparar la solucin Taq mesclando en un ependorf colocado en hielo, 0.25 l de Taq-polimerasa mas 2.25 l de agua bidestilada por muestra a analizar. Luego de hervir, coloque rpidamente la rejilla en hielo picado durante 5 min.Adicione 2.5 l de solucin Taq a cada Eppendorf, transpasando la capa de aceite con la punta de la micropipeta. Saque los ependorf. Pongales aceite abajo y poner a funcionar la maquina.

Gracias por su atencin