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UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGOFACULTAD DE MEDICINA / CIENCIAS

CÁTEDRA DE MICROBIOLOGÍA

TEMA:

CRECIMIENTOMICROBIANO

Dr. José González Cabeza

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CRECIMIENTO MICROBIANOEl crecimiento de células, microorganismos, células vegetales y animales, puede tener dos acepciones, una referida al incremento de la masa celular y la otra al incremento del número de células; esta última es la válida desde el puinto de vista microbiológico. A la vez, ello puede mirarse bajo dos aspectos o tipos de crecimiento reproductivo.a.- Células individuales o población de células en crecimiento sincronizado para estudio del ciclo de vida celular. Procesos enlaboratorio.b.- División estocástica de la población, o división al azar.

Por tanto, la división celular se efectúa luego de un aumento en el tamaño de la célula, duplicación del núcleo, división celular, división citoplasmática (salva los organismos cenóticos) y de ésta manera una célula genera a dos células de tamaño similar, conteniendo los mismos elementos estructurales y potencialidades.

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DIVISIÓNCELULAR

El proceso general de fisión binaria en procariotas de forma bacilar. Por simplicidad el nucleoide esta representado como un simple círculo verde.

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DIVISIÓN CELULAR

El anillo FtsZ y la división celular. (a) Cut-away view of a rod-shaped cell showing the ring of FtsZ molecules around the division plane

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DIVISIÓN CELULAR

Síntesis de Pared Celular de una bacteria gram positiva. (a) localización de la síntesis de la nueva pared celular durante la dicióncelular. En cocos, la nueva síntesis de pared celular (mostrado en verde) esta localizada con un sólo punto. El anillo FtsZ define el plano de la divisón celular.

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DIVISIÓN CELULAR– Crecimiento de Pared –

Bactoprenol (undecaprenolphosphate), the lipid carrier of the cell wall peptidoglycan building blocks.

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Peptidoglycan synthesis. (a) Transport of peptidoglycan precursors across the cytoplasmic membrane to the growing point of the cell wall.

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Peptidoglycan synthesis. (b) The transpeptidation reaction that leads to the final cross-linking of two peptidoglycan chains. Penicillin inhibits this reaction.

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CURVA DE CRECIMIENTOMICROBIANO

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CURVAS DE CRECIMIENTO

Es la representación gráfica del logaritmo del número de células frente al tiempo.

La curva teórica sería una recta pues los microorganismos estarían creciendo constantemente pero en la práctica la curva presenta distintas fases:

Fase de Latencia (lag).- Período de adaptación de un microorganismo a las nuevas condiciones medio ambientales nuevas en un nuevo medio decultivo.

Fase de Aceleración.- Periodo donde las células mejor adaptadas empiezan a dividirse, por tanto poblacionalmente lo hacen gradualmente.

Fase exponencial o logarítmica (log).- La población se incrementa de modo regular, duplicándose a intervalos regulares de tiempo. Se considera que las células son fisiológicamente iguales y el tiempo de generación es constante.

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Fase Estacionaria o de Equilibrio.- Existe una merma en el crecimiento poblacional, esencialmente por agotamiento de nutrientes y acumulación de productos tóxicos. Se considera teóricamente como constantes las tasas de proliferación y la de muerte.

Fase de Declinación o Muerte.- El número de células que mueren es mayor que el número de células que se dividen. Se considera teóricamente que la tasa de muerte es mucho mayor que la de proliferación.

”Las propiedades de un microorganismo dependerán de la fase de la curva de crecimiento en que se encuentren”

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CRECIMIENTO MICROBIANO

La tasa de crecimiento de un cultivo microbiano

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Método para estimar el tiempo de generación (g) del crecimiento poblacional exponencial, con tiempos de generación de (a) 6 h y (b) 2 h de datos ploteadossobre un gráfico semilogarítmico. La pendiente de cada línea es igual a 0.301/g and n igual al número de generaciones que han ocurrido en este tiempo, t. Todos los números son expresados en notación científica; esto es, 10´000,000 is 1 x 107, 60´000,000 is 6 x 107.

CRECIMIENTOMICROBIANO

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CRECIMIENTO MICROBIANO

Acelera

ción

Lag

Curva típica de Crecimeinto de una Población Bacteriana.

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CRECIMIENTO SINCRONICOCRECIMIENTO SINCRONICO

Informa sobre el tipo de Informa sobre el tipo de crecimiento de las distintas crecimiento de las distintas bacterias.bacterias.Cultivos en los que todos los Cultivos en los que todos los individuos de una poblaciindividuos de una poblacióón n estestáán en la misma etapa del n en la misma etapa del ciclo celular.ciclo celular.Para obtenerlo se puede Para obtenerlo se puede utilizar el mutilizar el méétodo de todo de HelmstetterHelmstetter--CummingsCummings..Ciertas membranas se Ciertas membranas se adhieren a las membranas de adhieren a las membranas de filtros de nitrato de celulosa filtros de nitrato de celulosa con un tamacon un tamañño de poro inferior o de poro inferior a la de ellas.a la de ellas.

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CRECIMIENTO MICROBIANO – Estimaciones –

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CULTIVO CONTINUOCULTIVO CONTINUO

PoblaciPoblacióón microbiana n microbiana ⇒⇒ fase exponencial.fase exponencial.

Fermentaciones industriales Fermentaciones industriales ⇒⇒ actividad metabactividad metabóólica mlica mááxima.xima.

Pueden hacerse funcionar como Pueden hacerse funcionar como quimiostatosquimiostatos o como o como turbidostatosturbidostatos..

QuimiostatoQuimiostato: velocidad de flujo de entrada y salida de : velocidad de flujo de entrada y salida de nutrientes se mantiene.nutrientes se mantiene.

Velocidad de crecimiento del cultivo queda ajustada a esa Velocidad de crecimiento del cultivo queda ajustada a esa velocidad de flujo.velocidad de flujo.

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CRECIMIENTO MICROBIANO – Estimaciones –

Schematic for a continuous culture device (chemostat). In such a device, the population density is controlled by the concentration of limiting nutrient in the reservoir, and the growth rate is controlled by the flow rate. Both parameters can be set by the experimenter.

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CRECIMIENTO MICROBIANO – Estimaciones –Relationship between nutrient concentration, growth rate (green curve), and growth yield (red curve) in a batch culture (closed system). At low nutrient concentrations both growth rate and growth yield are affected.

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CRECIMIENTO MICROBIANO – Estimaciones –

Steady-state relationships in the chemostat. The dilution rate is determined from the flow rate and the volume of the culture vessel. Thus, with a vessel of 1000 ml and a flow rate through the vessel of 500 ml/h, the dilution rate would be 0.5 h-1. Note that at high dilution rates, growth cannot balance dilution, andthe population washes out. Note also that although the population density remains constant during steady state, the growth rate (doubling time) can vary over a wide range. Thus, the experimenter can obtain populations with widely varying growth rates without affecting population density.

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CRECIMIENTO MICROBIANO – Estimaciones –

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DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

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METODOSMETODOSMÉTODOS DIRECTOS

Recuento en placaTécnica del nª mas probable

Método de filtraciónRecuento en cámara

Clitómetro de flujo

MÉTODOS INDIRECTOS

MediciMedicióón de peson de pesoMMéétodo analtodo analííticotico

TurbidimetriaTurbidimetriaEstudio de la actividad metabEstudio de la actividad metabóólicalica

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METODOS DIRECTOSMETODOS DIRECTOSRECUENTRO EN PLACA.- Consiste en el plaqueo de un volúmen

conocido procedente de la muestra que se analiza. El resultado es función de una serie de factores (como son el método de muestreo) y los cultivos pueden hacerse tanto en superficie como en profundidad. Los pasos a seguir son los siguientes:Estima el número de células viables.

Se emplea placas Petri que contengan el medio de cultivo idóneo para el crecimiento bacteriano.

Se siembra un volúmen conocido de muestra.

Se procede a contar el número de colonias.

Si la cantidad de bacterias es elevada se preparan diluciones.

Se siembra un determinado volumen en la placa Petri, para luego calcular el número de bacterias por mililitro (expresado como UFC).

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VENTAJA:

• La ventaja del método de recuento en placa es su gran sensibilidad. si se utiliza un medio y unas condiciones de incubación adecuadas, puede detectarse incluso una única célula viva.

• El recuento en placa no requiere un equipo complicado.

DESVENTAJA:

• No mide el número total de células si no únicamente las viables.

• Un inconveniente es que el recuento en placa es lento y tedioso y no es preciso, porque la precisión depende del recuento de un número elevado de colonia

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CRECIMIENTO MICROBIANO – Estimaciones –

Two methods of performing a viable count (plate count). In either case the sample must usually be diluted before plating.

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CRECIMIENTOMICROBIANO

– Estimaciones –

Procedure for viable counting using serial dilutions of the sample and the pour plate method. The sterile liquid used for making dilutions can simply be water, but a balanced salt solution or growth medium may yield a higher recovery. The dilution factor is the reciprocal of the dilution. For spread plating, further dilutions may be necessary in order to spread samples of 0.1 ml.

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TTÉÉCNICA DEL NCNICA DEL NÚÚMERO MMERO MÁÁS PROBABLES PROBABLEEs un método estdístico basado en series de diluciones y cálculo estadístico del número de bacterias `presentes en las disoluciones mas altas.

Cuando mayor es la dilución necesaria

Reducir a 0 el número de bacterias en una muestra

Mayor será el número de bacterias en la misma.

Ventajas Técnica fácil. / Idea general de la población bacteriana. / También se usa para determinar el número de células de un cultivo mixto que pueden crecer en un medio líquido. / Proporciona un 95% de posibilidades de que la población bacteriana este dentro de un determinado margen.Desventajas Método popular pero poco exacto.

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MMÉÉTODO DE FILTACITODO DE FILTACIÓÓN.N.Utilizados cuando el número de bacterias es bajo, son filtros con un poro de 0,45um que retiene las bacterias, se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa de medio de cultivo apropiado, donde crecerán tantas colonias como bacteria hayan quedado adheridas al filtro.

Cuando la concentración es baja y El volumen de la muestra es grande La muestra se hace pasar por un filtro cuyo poro retenga a la bacteria. Estas son transferidas a un medio de cultivo donde serán contadas las colonias.

VENTAJAS:Nos permite poder separar las bacterias del medio acuoso.DESVENTAJAS:Hay la posibilidad de que no todas las bacterias se queden en elfiltro o sean transferidas.

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MMÉÉTODO DE FILTACITODO DE FILTACIÓÓN.N.

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RECUENTO EN CRECUENTO EN CÁÁMARAMARA

Se puede utilizar diversos tipos de cámaras. En general se conoce el volumen exacto del liquido que queda atrapado en el lugar donde se realiza el recuento, que se cuenta un número variable de estos cuadrados y se extrapola la media al número de microorganismo por mililitro.

VENTAJAS:

Cuando se cuenta por cuadrados evitaremos confundirnos.

DESVENTAJAS:No puede medir bacterias móviles.No distingue las células vivas de las muertas.Es impreciso.

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CRECIMIENTO MICROBIANO – Estimaciones –

Direct microscopic counting procedure using the Petroff-Hausser counting chamber

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CITOMETRO DE FLUJO.CITOMETRO DE FLUJO.

Método basado en hacer pasar una a una las células de una suspensión por un sistema de detección, este sistema puede contener un detector capaza de medir diferentes parámetros lo que permite identificar las bacterias durante su paso por el detector.

VENTAJA.- Es un sistema automatizado y rápido.

DESVENTAJA.- Esta técnica sigue sin distinguir entre bacteria viables y no viables.

Mediante un contador automático de bacterias CONTADOR COUNTER Mide la diferencia de conductividad al pasar una bacteria por un orificio estrecho conectado a dos electrodos.

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METODOS INDIRECTOSMETODOS INDIRECTOS

MEDICIÓN DE PESOPESO HÚMEDO ⇒⇒ UUtiliza una altiliza una alíícuota del medio cuota del medio CentrifugCentrifugáándolo ndolo Pesando el sedimento. MPesando el sedimento. Méétodo inexacto. todo inexacto. Es fácil de maniobrar.PESO SECO ⇒⇒ LiofilizaciLiofilizacióón. Sen. Se deben emplear balanzas muy exactas; un miligramo supone una desviación en el número de bacterias

MÉTODOS ANALÍTICOSComponentes de la bacteria Componentes de la bacteria ⇒⇒ NitrNitróógeno total, protegeno total, proteíínas totales nas totales o ADN. o ADN. Se consiguen medidas muy precisas. Desventaja: Algunas bacterias presentan deficiencia en la conformación las moléculas de ADN.

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TURBIDIMETRIAEstima la turbidez de una suspensión bacteriana mediante:A) Fotómetro o Espectrofotómetro: Mide la luz transmitida = “La disminución de esta luz es proporcional a la concentración de microorganismos”.B) Nefelómetro: Mide la luz dispersa. = “A mayor dispersión mayor concentración microbiana”.VENTAJAS.- Es más exacta y precisa, ya que se basa de aspectos físicos y químicos de las bacterias. / Es un método de recuento automatizado que da resultados con cálculos matemáticos.DESVENTAJAS:La presencia de precipitados u otras sustancias producidas por las bacterias puede aumentar la turbidez. / El método presenta el problema de que no puede medir bacterias móviles. / No distingue células vivas de muertas. / Es impreciso si el número de microorganismo es escaso. / Es lento y subjetivo.

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CRECIMIENTO MICROBIANO – Estimaciones –

Turbidity measurements of microbial growth. (b) Typical growth curve data obtained in Klett units or optical density (OD) for two organisms growing at different growth rates. For practice, calculate the generation time (g) of the two cultures using the formula n = 3.3 (log N – log N0) where N and N0 are two different Klett values taken between a time interval t. Which organism is growing faster, A or B? (c) Relationship between cell number or dry weight and turbidity readings. Note that the one-to-one correspondence between these relationships breaks down at high turbidities.

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CRECIMIENTO MICROBIANO – Estimaciones –

Turbidity measurements of microbial growth. (a) Measurements of turbidity are made in a spectrophotometer or photometer. The photocell measures incident light unscattered by cells in suspension and gives readings in optical density or photometer units.

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ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD METABÓLICA

Puede realizarse de diversas formas, entre las que destacan:• Determinación de un proceso metabólico natural.• Evaluación de una sustancia catabólica radioactiva a partir de un sustrato marcado.• Detección de la perdida de un compuesto persistente.• Asimilación de un producto que por la acción de enzimas bacterianas determina la aparición de un compuesto cromógeno o fluorescente.

VENTAJA• También se emplea para estudiar propiedades bioquímicas bacterianas.

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FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO MICROBIANO

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TEMPERATURA

Effect of temperature on growth rate and the molecular consequences for the cell. The three cardinal temperatures vary by organism.

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TEMPERATURA. Influye m. Influye máás en el crecimiento de los s en el crecimiento de los microorganismos. Cada microorganismo tiene una microorganismos. Cada microorganismo tiene una temperatura mtemperatura míínima, nima, óóptima (+ cerca de la temperatura ptima (+ cerca de la temperatura mmááxima) y mxima) y mááxima de crecimiento.xima de crecimiento.

PsicrPsicróófilosfilos: Temperatura : Temperatura óóptima baja (ptima baja (PseudomonasPseudomonas, , FlavobacteriumFlavobacterium, , AlcaligenesAlcaligenes).).

MesMesóófilosfilos: Temperatura : Temperatura óóptima normal (la mayor parte de ptima normal (la mayor parte de los organismos).los organismos).

TermTermóófilosfilos: Temperatura : Temperatura óóptima alta (microorganismos ptima alta (microorganismos aislados de aislados de ááreas volcreas volcáánicas).nicas).

TermTermóófilosfilos extremosextremos: Temperatura : Temperatura óóptima muy alta ptima muy alta ((ThermococcusThermococcus celerceler 103103°° C)C)

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Relation of temperature to growth rates of a typical psychrophile, a typical mesophile, a typical thermophile, and two different hyperthermophiles. The temperature optima of the example organisms are shown on the graph.

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TEMPERATURA

Growth of hyperthermophiles in boiling water. (a) Boulder Spring, a small boiling spring in Yellowstone National Park. This spring is superheated, having a temperature 1–2˚C above the boiling point. The mineral deposits around the spring consists mainly of silica and sulfur.

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Growth of hyperthermophiles in boiling water. (b) Photomicrograph of a microcolony of prokaryotes that developed on a microscope slide immersed in a boiling spring such as that shown in (a).

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pH

Microorganismos cambian el Microorganismos cambian el pHpH ⇒⇒ al crecer se debe al crecer se debe aaññadir un tampadir un tampóón en el medio para mantener el n en el medio para mantener el pHpHconstante.constante.

Para Para pHpH neutros se utiliza el tampneutros se utiliza el tampóón fosfato. n fosfato. pHpH de de ambientes naturales oscila ambientes naturales oscila ÷÷ 5 y 9.5 y 9.

AcidAcidóófilosfilos ⇒⇒ crecen a crecen a pHpH inferiores a 5 (inferiores a 5 (ThiobacillusThiobacilluspHpH: 0,5).: 0,5).AlcalinAlcalinóófilosfilos ⇒⇒ crecen a crecen a pHpH superiores a 9 (superiores a 9 (BacillusBacilluspHpH: 11).: 11).

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CRECIMIENTOMICROBIANO– Factores –

The pH scale. Note that although some microorganisms can live at very low or very high pH, the cell’s internal pH remains near neutrality

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HALÓFILOS: : Microorganismos que viven en altas concentraciones de Microorganismos que viven en altas concentraciones de sales.sales.

OSMÓFILOS::Microorganismos que viven en altas concentraciones de Microorganismos que viven en altas concentraciones de azazúúcares.cares.

XERÓFILOS::Microorganismos que viven en ambientes secos.Microorganismos que viven en ambientes secos.

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Effect of sodium ion concentration on growth of microorganisms of different salt tolerances or requirements. The optimum NaClconcentration for marine microorganisms such as V. fischeri is about 3%; for extreme halophiles, it is between 15 and 30%, depending on the organism

CRECIMIENTO MICROBIANO– Factores –

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Structures of some common compatible solutes in microorganisms. The structures of glutamate and proline, other common solutes, were shown in Figure 3.12. The formal name of ectoine is 1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidine carboxylate. Note that all the compounds shown here are very polar (water soluble) molecules.

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Structures of some common compatible solutes in microorganisms. The structures of glutamate and proline, other common solutes, were shown in Figure 3.12. Note that all the compounds shown here are very polar (water soluble) molecules

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OXIGENO

Aerobic, anaerobic, facultative, microaerophilic, and aerotolerantanaerobe growth, as revealed by the position of microbial colonies (depicted here as black dots) within tubes of thioglycolate broth culture medium. A small amount of agar has been added to keep the liquid from becoming disturbed and the redox dye, resazurin, which is pink when oxidized and colorless when reduced, is added as a redox indicator. (a) Oxygen penetrates only a short distance into the tube, so obligate aerobes grow only at the surface. (b) Anaerobes, being sensitive to oxygen, grow only away from the surface. (c) Facultative aerobes are able to grow in either the presence or the absence of oxygen and thus grow throughout the tube. However, better growth occurs near thesurface because these organisms can respire. (d) Microaerophiles grow away from the most oxic zone. (e) Aerotolerant anaerobes grow throughout the tube. However, growth is no better near the surface because these organisms can only ferment.

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A / MICROBIOLOGÍA / GONZÁLEZ CABEZA / MICROBIOLOGÍA / GCROBIOLOGÍA / GONZÁLEZ CABEZA / MICROBIOLOGÍA / GONZÁIOLOGÍA / GONZÁLEZ CABEZA / MICROBIOLOGÍA / GONZÁLEZ CNZÁLEZ CABEZA / MICROBIOLOGÍA / GONZÁLEZ CABEZA / MICREZ CABEZA / MICROBIOLOGÍA / GONZÁLEZ CABEZA / MICROBIO

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(a) AEROBIOS(b) ANAEROBIOS(c) AEROBIOS

FACULTATIVOS(d) MICROAEROFILOS(e) ANAEROBIOS

AEROTOLERANTES(Ver leyenda anterior)

OXIGENO

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OXIGENO

AEROBIOSObligados Requieren O2 para crecer (21%).Facultativos No requieren pero crecen mejor en presencia de O2.

MICRAERÓFILOSRequieren pero a niveles más bajos que los atmosféricos (1-15%).

ANAEROBIOSAerotolerantes No requieren y crecen peor cuando el O2está presente.Obligados La presencia de O2 es letal.

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CRECIMIENTOMICROBIANO– Factores –

Incubation under anoxic conditions. (a) Anoxic jar. A chemical reaction in the envelope in the jar generates H2+ CO2. The H2 reacts with O2 in the jar on the surface of a palladium catalyst to yield H2O; the final atmosphere contains N2, H2, and CO2.

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POTENCIAL DE AGUA

POTENCIAL DE AGUA (aw) Requerimientos de Requerimientos de agua para realizar actividades metabagua para realizar actividades metabóólicas.licas.

•• Valores de 0 a 1.Valores de 0 a 1.

•• El El awaw del Hdel H22O pura es 1.O pura es 1.

•• El El awaw de los frutos secos es 0,7. de los frutos secos es 0,7.

•• El El awaw de los campos de cultivo se sitde los campos de cultivo se sitúúa entre 0,9 y 1,0a entre 0,9 y 1,0

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Four-electron reduction of O2 to water by stepwise addition of electrons. All the intermediates formed are reactive and

toxic to cells except for water, of course.

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Enzymes that destroy toxic oxygen species. (a) Catalases and (b) peroxidases are porphyrin-containing proteins, although some flavoproteinsmay consume toxic oxygen species as well. (c) Superoxide dismutases are metal-containing proteins, the metals being copper and zinc, manganese, or iron. (d) Combined reaction of superoxide dismutase and catalase. (e) Superoxidereductase catalyzes the one electron reduction of O2

- to H2O2 using reduced cytochrome c as the electron donor.