Presentación de PowerPoint - UNSAM · 2013. 5. 14. · Laboratorio de Neuro y Citogenética...
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Desarrollo de un Set de Marcadores Genómicos y Proteómicos para optimización de predicción de Respuesta Terapéutica en Cáncer de Mama Vera Moncalero, Fernanda Peri, Claudia Perandones* y Martín Radrizzani (CONICET). Vera Moncalero, Fernanda Peri, Claudia Perandones* y Martín Radrizzani (CONICET). Laboratorio de Neuro y Citogenética Molecular, Escuela de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de San Martín, Argentina. Laboratorio de Neuro y Citogenética Molecular, Escuela de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de San Martín, Argentina. *Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud, ANLIS, Dr. Carlos G. Malbrán *Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud, ANLIS, Dr. Carlos G. Malbrán Conclusiones Se desarrollaron y pusieron a punto las sondas necesarias para la determinación de la dosis génica de Her-2/neu como los aptámeros para le detección de la proteína PTEN en biopsias de tejido provenientes de pacientes con cáncer de mama. Si bien el valor predictivo de los niveles de PTEN para determinar la respuesta terapéutica a Trastuzumab ya ha sido previamente descripto, el rol de PTEN de localización nuclear en esta respuesta es aun desconocido. Agradecimientos: A Verónica L. Farini, Pablo Sipowicz y Diego L. Viale, de la ECyT-UNSAM. Al grupo del Dr Daniel R. Ciocca del IMBECU, Mendoza. Conclusiones Se desarrollaron y pusieron a punto las sondas necesarias para la determinación de la dosis génica de Her-2/neu como los aptámeros para le detección de la proteína PTEN en biopsias de tejido provenientes de pacientes con cáncer de mama. Si bien el valor predictivo de los niveles de PTEN para determinar la respuesta terapéutica a Trastuzumab ya ha sido previamente descripto, el rol de PTEN de localización nuclear en esta respuesta es aun desconocido. Agradecimientos: A Verónica L. Farini, Pablo Sipowicz y Diego L. Viale, de la ECyT-UNSAM. Al grupo del Dr Daniel R. Ciocca del IMBECU, Mendoza. Materiales y Métodos FISH (hibridación fluoresente in situ). La sonda de Her-2/neu se realizó marcando la secuencia especifica del gen con nucleotidos conjugados a Rodamina mediante nick translation. Como sonda control se marcó una secuencia especifica del centrómero 17 con nucleotidos conjugados a FITC. Las sondas se concentraron y se realizó FISH sobre 14 tumores de mama previamente analizados por FISH con sondas comerciales (Vysis – Abbott). Inmunohistoquímica (IHQ). Las IHQ se realizaron en tumores de mama con y sin amplificación del gen Her-2/neu y en tejido de mama normal. Se utilizaron aptámeros (ADN simple cadena) sintetizados con biotina en el extremo 5´ que reconocen específicamente a la proteína PTEN (Moncalero et al., 2011, PLOS-ONE). Se reveló con Peroxidasa y Diamino-Bencidina (DAB). Materiales y Métodos FISH (hibridación fluoresente in situ). La sonda de Her-2/neu se realizó marcando la secuencia especifica del gen con nucleotidos conjugados a Rodamina mediante nick translation. Como sonda control se marcó una secuencia especifica del centrómero 17 con nucleotidos conjugados a FITC. Las sondas se concentraron y se realizó FISH sobre 14 tumores de mama previamente analizados por FISH con sondas comerciales (Vysis – Abbott). Inmunohistoquímica (IHQ). Las IHQ se realizaron en tumores de mama con y sin amplificación del gen Her-2/neu y en tejido de mama normal. Se utilizaron aptámeros (ADN simple cadena) sintetizados con biotina en el extremo 5´ que reconocen específicamente a la proteína PTEN (Moncalero et al., 2011, PLOS-ONE). Se reveló con Peroxidasa y Diamino-Bencidina (DAB). Resultados Se obtuvo una sonda para detectar la amplificación de Her- 2/neu en pacientes con cáncer de mama con sensibilidad y precisión comparables con sondas comerciales. A B C Fig 3. FISH con sondas para el gen Her-2/neu (Rojo) y Centromero 17 (Verde). A cromosomas en metafase de un extendido celular de linfocitos. B Corte de tumor de mama con baja amplificación del gen Her-2/neu. C Corte de tumor de mama con amplificación del gen Her-2/neu Fig 4. FISH en Tumor de mama con amplificación del gen Her-2/neu A Sondas realizadas en el laboratorio B Sondas comerciales. Sondas Her-2/neu (Rojo) y Centromero 17 (Verde). Introducción El cáncer de mama es el tumor más frecuente de la población femenina. Este tipo de tumores poseen una gran heterogeneidad clínica e histológica. La amplificación del oncogen ErbB2 o Her-2/neu (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) está presente en el 20 a 30 % de los cánceres mamarios, y no sólo condiciona mayor agresividad tumoral sino que también es criterio de elegibilidad para el tratamiento con trastuzumab. La FDA recomienda que el análisis del oncogen sea realizado por FISH por sobre los métodos inmuhistoquímicos (IHQ) debido a limitaciones como subjetividad del observador y discrepancia en especificidad y sensibilidad de los anticuerpos (Fig 1). La deficiencia del supresor tumoral PTEN (Phosphatase and tensin homolog) fue observado en la mitad de los cánceres de mama asociado a una pobre prognosis y a la resistencia a Trastuzumab, siendo un buen marcador de resistencia al tratamiento (Fig2) (Pandolfi PP 2004, NEJM 351;22). El objetivo de este proyecto es desarrollar las herramientas que permitan la evaluación accesible y sistemática de la amplificación del gen Her-2/neu y la expresión de la proteína PTEN para determinan la respuesta al tratamiento con Trastuzumab. Introducción El cáncer de mama es el tumor más frecuente de la población femenina. Este tipo de tumores poseen una gran heterogeneidad clínica e histológica. La amplificación del oncogen ErbB2 o Her-2/neu (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) está presente en el 20 a 30 % de los cánceres mamarios, y no sólo condiciona mayor agresividad tumoral sino que también es criterio de elegibilidad para el tratamiento con trastuzumab. La FDA recomienda que el análisis del oncogen sea realizado por FISH por sobre los métodos inmuhistoquímicos (IHQ) debido a limitaciones como subjetividad del observador y discrepancia en especificidad y sensibilidad de los anticuerpos (Fig 1). La deficiencia del supresor tumoral PTEN (Phosphatase and tensin homolog) fue observado en la mitad de los cánceres de mama asociado a una pobre prognosis y a la resistencia a Trastuzumab, siendo un buen marcador de resistencia al tratamiento (Fig2) (Pandolfi PP 2004, NEJM 351;22). El objetivo de este proyecto es desarrollar las herramientas que permitan la evaluación accesible y sistemática de la amplificación del gen Her-2/neu y la expresión de la proteína PTEN para determinan la respuesta al tratamiento con Trastuzumab. Fig 1. IHQ vs FISH. En el panel superior se muestran Histologías en tumores de mama con amplificación del receptor Her-2/neu alta (A), baja (B,C) y sin amplificación (D). En el panel inferior se muestran FISH con amplificación del gen Her-2/neu alta (E), baja (F) y sin amplificación (G). Amplificación Amplificación alta Normal Normal Amplificación Amplificación baja A B C D E F G Pandolfi, P 2004 Fig 2. Resistencia a Trastuzumab debido a la deficiencia de PTEN. En el Panel A se muestra la activación de la via de Akt por la amplificación del receptor Her-2/neu (o ErbB2). El tratamiento con Trastazumab inhibe la vía de Akt mediante PTEN (B) En ausencia de PTEN la vía de Akt no se inhibe por el tratamiento (C). Los aptámeros contra PTEN reconocen a la proteína en IHQ de tumores de mama y en tejido normal. En los distintos tumores en donde la proteína estaba presentes la localización celular de la proteína fue diferente. Tabla 1.Comparación del análisis de Her-2/neu por FISH con sondas comerciales y con sondas producidas en el Laboratorio de Neuro y Citogenética Molecular (LNCM). Señales de Her-2/neu normalizadas con las señales del centrómero 17 (Cep17) contabi- lizadas en 20 células. Se considera como amplificación del gen Her- 2/neu (Her-2/neu+) los valores mayores a 2. Caso Relación Her-2/neu / Cep17 Sondas Comerciales Sondas LNCM 1055 2,74 2,7 1070 1,26 1,24 1071 1,03 1,05 1072 2,78 2,8 1074 1,62 1,55 1093 1,31 1,2 1099 1,05 1,15 1105 2,06 2,1 1114 1,05 1,21 1121 4,19 4,3 1147 3,58 3,65 1152 4,38 4,05 1204 2,98 3,1 1221 1,05 0,98 Figura 5. Inmunihistoquímicas utilizando aptámeros de ADN que reconocen específicamente la Proteína PTEN.IHQ a 100X con detalle a 400X en tejido normal ( A), en un tejido con amplificación del gen de Her-2/neu ( B) y un tejido sin amplificación del gen ( C) A B C Esquema 1 Procedimiento para elegir a Trastuzumab como terapia para tumores Her-2/neu positivos. Otro hace referencia a la búsqueda de otros marcadores indicativos de terapias diferentes. Otro Otro Her-2/neu PTEN + - + - Núcleo y/o Citoplasma ¿? Trastuzumab
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Desarrollo de un Set de Marcadores Genómicos y Proteómicos para optimización de predicción de
Respuesta Terapéutica en Cáncer de MamaVera Moncalero, Fernanda Peri, Claudia Perandones* y Martín Radrizzani (CONICET).Vera Moncalero, Fernanda Peri, Claudia Perandones* y Martín Radrizzani (CONICET).
Laboratorio de Neuro y Citogenética Molecular, Escuela de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de San Martín, Argentina.Laboratorio de Neuro y Citogenética Molecular, Escuela de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de San Martín, Argentina.*Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud, ANLIS, Dr. Carlos G. Malbrán *Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud, ANLIS, Dr. Carlos G. Malbrán
Conclusiones
Se desarrollaron y pusieron a punto las sondas necesarias para la determinación de la dosis génica de Her-2/neu como los aptámeros para le detección de la proteína PTEN en biopsias de tejido provenientes de pacientes con cáncer de mama. Si bien el valor predictivo de los niveles de PTEN para determinar la respuesta terapéutica a Trastuzumab ya ha sido previamente descripto, el rol de PTEN de localización nuclear en esta respuesta es aun desconocido.
Agradecimientos: A Verónica L. Farini, Pablo Sipowicz y Diego L. Viale, de la ECyT-UNSAM. Al grupo del Dr Daniel R. Ciocca del IMBECU, Mendoza.
Conclusiones
Se desarrollaron y pusieron a punto las sondas necesarias para la determinación de la dosis génica de Her-2/neu como los aptámeros para le detección de la proteína PTEN en biopsias de tejido provenientes de pacientes con cáncer de mama. Si bien el valor predictivo de los niveles de PTEN para determinar la respuesta terapéutica a Trastuzumab ya ha sido previamente descripto, el rol de PTEN de localización nuclear en esta respuesta es aun desconocido.
Agradecimientos: A Verónica L. Farini, Pablo Sipowicz y Diego L. Viale, de la ECyT-UNSAM. Al grupo del Dr Daniel R. Ciocca del IMBECU, Mendoza.
Materiales y Métodos
FISH (hibridación fluoresente in situ). La sonda de Her-2/neu se realizó marcando la secuencia especifica del gen con nucleotidos conjugados a Rodamina mediante nick translation. Como sonda control se marcó una secuencia especifica del centrómero 17 con nucleotidos conjugados a FITC. Las sondas se concentraron y se realizó FISH sobre 14 tumores de mama previamente analizados por FISH con sondas comerciales (Vysis – Abbott).
Inmunohistoquímica (IHQ). Las IHQ se realizaron en tumores de mama con y sin amplificación del gen Her-2/neu y en tejido de mama normal. Se utilizaron aptámeros (ADN simple cadena) sintetizados con biotina en el extremo 5´ que reconocen específicamente a la proteína PTEN (Moncalero et al., 2011, PLOS-ONE). Se reveló con Peroxidasa y Diamino-Bencidina (DAB).
Materiales y Métodos
FISH (hibridación fluoresente in situ). La sonda de Her-2/neu se realizó marcando la secuencia especifica del gen con nucleotidos conjugados a Rodamina mediante nick translation. Como sonda control se marcó una secuencia especifica del centrómero 17 con nucleotidos conjugados a FITC. Las sondas se concentraron y se realizó FISH sobre 14 tumores de mama previamente analizados por FISH con sondas comerciales (Vysis – Abbott).
Inmunohistoquímica (IHQ). Las IHQ se realizaron en tumores de mama con y sin amplificación del gen Her-2/neu y en tejido de mama normal. Se utilizaron aptámeros (ADN simple cadena) sintetizados con biotina en el extremo 5´ que reconocen específicamente a la proteína PTEN (Moncalero et al., 2011, PLOS-ONE). Se reveló con Peroxidasa y Diamino-Bencidina (DAB).
Resultados
Se obtuvo una sonda para detectar la amplificación de Her-2/neu en pacientes con cáncer de mama con sensibilidad y precisión comparables con sondas comerciales.
A B C
Fig 3. FISH con sondas para el gen Her-2/neu (Rojo) y Centromero 17 (Verde). A cromosomas en metafase de un extendido celular de linfocitos. B Corte de tumor de mama con baja amplificación del gen Her-2/neu. C Corte de tumor de mama con amplificación del gen Her-2/neu
Fig 4. FISH en Tumor de mama con amplificación del gen Her-2/neu A Sondas realizadas en el laboratorio B Sondas comerciales. Sondas Her-2/neu (Rojo) y Centromero 17 (Verde).
Introducción
El cáncer de mama es el tumor más frecuente de la población femenina. Este tipo de tumores poseen una gran heterogeneidad clínica e histológica. La amplificación del oncogen ErbB2 o Her-2/neu (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) está presente en el 20 a 30 % de los cánceres mamarios, y no sólo condiciona mayor agresividad tumoral sino que también es criterio de elegibilidad para el tratamiento con trastuzumab. La FDA recomienda que el análisis del oncogen sea realizado por FISH por sobre los métodos inmuhistoquímicos (IHQ) debido a limitaciones como subjetividad del observador y discrepancia en especificidad y sensibilidad de los anticuerpos (Fig 1).La deficiencia del supresor tumoral PTEN (Phosphatase and tensin homolog) fue observado en la mitad de los cánceres de mama asociado a una pobre prognosis y a la resistencia a Trastuzumab, siendo un buen marcador de resistencia al tratamiento (Fig2) (Pandolfi PP 2004, NEJM 351;22).
El objetivo de este proyecto es desarrollar las herramientas que permitan la evaluación accesible y sistemática de la amplificación del gen Her-2/neu y la expresión de la proteína PTEN para determinan la respuesta al tratamiento con Trastuzumab.
Introducción
El cáncer de mama es el tumor más frecuente de la población femenina. Este tipo de tumores poseen una gran heterogeneidad clínica e histológica. La amplificación del oncogen ErbB2 o Her-2/neu (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) está presente en el 20 a 30 % de los cánceres mamarios, y no sólo condiciona mayor agresividad tumoral sino que también es criterio de elegibilidad para el tratamiento con trastuzumab. La FDA recomienda que el análisis del oncogen sea realizado por FISH por sobre los métodos inmuhistoquímicos (IHQ) debido a limitaciones como subjetividad del observador y discrepancia en especificidad y sensibilidad de los anticuerpos (Fig 1).La deficiencia del supresor tumoral PTEN (Phosphatase and tensin homolog) fue observado en la mitad de los cánceres de mama asociado a una pobre prognosis y a la resistencia a Trastuzumab, siendo un buen marcador de resistencia al tratamiento (Fig2) (Pandolfi PP 2004, NEJM 351;22).
El objetivo de este proyecto es desarrollar las herramientas que permitan la evaluación accesible y sistemática de la amplificación del gen Her-2/neu y la expresión de la proteína PTEN para determinan la respuesta al tratamiento con Trastuzumab.
Fig 1. IHQ vs FISH. En el panel superior se muestran Histologías en tumores de mama con amplificación del receptor Her-2/neu alta (A), baja (B,C) y sin amplificación (D). En el panel inferior se muestran FISH con amplificación del gen Her-2/neu alta (E), baja (F) y sin amplificación (G). AmplificaciónAmplificación
alta
Normal Normal AmplificaciónAmplificación
baja
A B C D
E F G
Pandolfi, P 2004
Fig 2. Resistencia a Trastuzumab debido a la deficiencia de PTEN. En el Panel A se muestra la activación de la via de Akt por la amplificación del receptor Her-2/neu (o ErbB2). El tratamiento con Trastazumab inhibe la vía de Akt mediante PTEN (B) En ausencia de PTEN la vía de Akt no se inhibe por el tratamiento (C).
Los aptámeros contra PTEN reconocen a la proteína en IHQ de tumores de mama y en tejido normal. En los distintos tumores en donde la proteína estaba presentes la localización celular de la proteína fue diferente.
Tabla 1.Comparación del análisis de Her-2/neu por FISH con sondas comerciales y con sondas producidas en el Laboratorio de Neuro y Citogenética Molecular (LNCM). Señales de Her-2/neu normalizadas con las señales del centrómero 17 (Cep17) contabi-lizadas en 20 células. Se considera como amplificación del gen Her-2/neu (Her-2/neu+) los valores mayores a 2.
Caso
Relación Her-2/neu / Cep17
Sondas ComercialesSondas LNCM
1055 2,74 2,7
1070 1,26 1,24
1071 1,03 1,05
1072 2,78 2,8
1074 1,62 1,55
1093 1,31 1,2
1099 1,05 1,15
1105 2,06 2,1
1114 1,05 1,21
1121 4,19 4,3
1147 3,58 3,65
1152 4,38 4,05
1204 2,98 3,1
1221 1,05 0,98
Figura 5. Inmunihistoquímicas utilizando aptámeros de ADN que reconocen específicamente la Proteína PTEN.IHQ a 100X con detalle a 400X en tejido normal (A), en un tejido con amplificación del gen de Her-2/neu (B) y un tejido sin amplificación del gen (C)
A
B
C
Esquema 1 Procedimiento para elegir a Trastuzumab como terapia para tumores Her-2/neu positivos. Otro hace referencia a la búsqueda de otros marcadores indicativos de terapias diferentes.
Otro
Otro
Her-2/neu
PTEN
+ -
+ -
Núcleo y/o Citoplasma¿?
Trastuzumab
