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PREPARACION Y AISLAMIENTO DE VECTORES REPORTEROS PARA LA EVALUACION DE COMPUESTOS CON ACTIVIDAD HORMONAL TO% CLAUDIA a2QOXICA ZAGA CLA-LIXfl. MATRICULA 90337649 ASESOR EXTERNO: M en 1.B.B Ana María Pasapera. Limón. INVESTIGADOR ASOCIADO "B" DEFTO.: BIOLOGIA DE LA REPRODUCCION. INN-SZ. ASESOR INTERNO: M.en C. Pablo G. Damián Matzumura. PROFESOR TITULAR "B" TIEMPO COMPLETO. DEPTO.: BIOLOGIA DE LA REPRODUCCION . D.C.B.S. UAM-I.

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PREPARACION Y AISLAMIENTO DE VECTORES REPORTEROS PARA LA EVALUACION DE

COMPUESTOS CON ACTIVIDAD HORMONAL

TO% CLAUDIA a2QOXICA ZAGA CLA-LIXfl.

MATRICULA 90337649

ASESOR EXTERNO: M en 1.B.B Ana María Pasapera. Limón. INVESTIGADOR ASOCIADO "B" DEFTO.: BIOLOGIA DE LA REPRODUCCION. INN-SZ.

ASESOR INTERNO: M.en C. Pablo G. Damián Matzumura. PROFESOR TITULAR "B" TIEMPO COMPLETO. DEPTO.: BIOLOGIA DE LA REPRODUCCION . D.C.B.S. UAM-I.

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I.- INTRODUCCION

a) Regulación de la actividad génica por hormonas esteroides La comprensión de los mecanismos moleculares que regulan la

expresión de los genes en los organismos eucariontes es uno de los principales retos a resolver, ya que esta compleja regulación es una combinación de señales tanto genéticas como epigenéticas, además, puede ser tejido-específica, temporal y/o el resultado de la variabilidad e interacción de una gran cantidad de factores extracelulares como las hormonas o los factores de crecimiento. Cualquiera que sea la composición del sistema en cuestión es aquí donde la regulación de la expresión génica se efectúa a nivel de la transcripción, y existe una cascada de señales celulares donde ocurren una serie de interacciones entre las proteinas reguladoras, los factores de transcripción y las secuencias específicas en el ácido desoxirribonucleico (ADN).

Las hormonas esteroides, modulan un gran número de actividades biológicas en los animales por medio del control de su actividad génica. La capacidad de un órgano blanco para responder a dichas hormonas esteroides ha sido atribuida principalmente a la presencia de receptores específicos a ellas (1). Los receptores a hormonas esteroides pertenecen a una familia de reguladores de la transcripción, los cuales controlan la expresión de genes hormono-dependientes por efecto de su ligando específico. La unión de la hormona con la región carboxilo terminal del receptor provoca una "activación" de éste, y aumenta su afinidad por el ADN en secuencias específcas de aproximadamente 15 pares de bases (pb), en regiones conocidas como amplificadores hormono-dependientes 6 elementos de respuesta hormonal (HRE).

Cada receptor tiene una alta especificidad por una hormona en particular, y cada complejo hormona-receptor (H-R) tiene la capacidad de unirse a un HRE. Las secuencias de los HRE son palindromes (en ocasiones no perfectos), las cuales se encuentran en la cadena del ADN y su localización varía de un gene a otro (1, 2). Se ha observado que los complejos hormona- receptor se unen a sus respectivos HREs en forma multimérica y probablemente en forma cooperativa (3) .

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Varios estudios han demostrado que un requisito básico para que una hormona esteroide lleve a cabo su papel fisiológico es la unión de éSta con su respectivo receptor, ya que para que la hormona pueda tener efectos biológicos requiere, además interaccionar con otros factores (por ejemplo, las proteínas de choque térmico o HSP 90) que permitan la activación de este complejo H-R. Posteriormente, dicho complejo adquiere la capacidad de interaccionar con los HER, los cuales regulan la transcripción de genes específicos, hormono-dependientes que son traducidos a proteínas, siendo éstas las responsables de ejercer los efectos fisiológicos característicos de la hormona esterioide de la que se trate (1, 2, 3). 2 2 2 5 2 9

Se ha sugerido que los receptores como el de estrógenos (RE) y el de progesterona (RP), pueden competir por factores de transcripción in vivo; a la fecha no se sabe si receptores que unen a una misma secuencia consenso, compiten por los mismos factores de transcripción involucrados en la maquinaria que desencadena la transcripción de estos genes "hormono- regulados" (4, 5, 6).

b) Mecanismo de acción de las progestinas 2;<2:i29 Los estudios realizados para determinar el modo de acción de varios

esteroides sintéticos han demostrado que entre éstos, las progestinas sintéticas se biotransforman a nivel de los órganos blanco y que los productos de transformación metabólica pueden interactuar con receptores localizados dentro de las mismas células blanco. El efecto biológico de estas interacciones pueden resultar en actividades agonistas, antagonistas y/o sinergistas, dependiendo de la naturaleza del receptor al que se unen. Estas progestinas se han clasificado en dos grupos de acuerdo a su estructura química: Las que derivan de la molécula 17-hidroxi-progesterona y aquellas que derivan de la 19-nortestosterona.

Dentro de este último grupo se encuentra la Norestisterona (NET; 17 a- etinil, 17 1S-hidroxi, 4-estren -3-ona), la cual es ampliamente utilizada en diversas formulaciones empleadas en la regulación de la fertilidad y terapia clínica debido a sus propiedades biológicas (9, 10:).

En experimentos llevados a cabo en varias especies de mamiferos ha quedado demostrado que la NET presenta una gama de efectos hormonales, los cuales son el resultado de las interacciones de los diferentes productos de bioconversión de esta molécula con los receptores a hormonas esteroides (14, 15). A través de estudios bioquímicos se ha establecido que la NET se metaboliza tanto in vitro como in vivo, a nivel de órganos blanco y que los

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metabolitos S a -reducidos (Sa-DHNET) se unen a los receptores para andrógenos (RA) y para progesterona (RP) y que los metabolitos tetrahidrorreducidos (313, 5a -THNET) interaccionan con receptores para estrógenos (RE) (13, 14, 15).

c) Modelos para el estudio del mecanismo de acción de los esteroides Los mecanismos de interacción entre los RPs y RES con los factores de

transcripción y el ADN son aún desconocidas, por lo que es importante diseñar un modelo que permita elucidar algunos de estos eventos tan importantes en la regulación génica, como lo es la localización de los elementos de respuesta hormonal (HRE) que participan de manera directa en la transcripción de un gene específico.

Entre los modelos más ampliamente utilizados en el estudio de la regulación génica a nivel del promotor están los sistemas de transfección de plásmidos conteniendo algún promotor insertado en un vector que además, contiene un gene reportero por medio del cual se puede medir la activación de la transcripción por efecto de la interacción de €actores de transcripción con las secuencias del promotor en cuestión. De esta manera, los genes reporteros codifican para proteínas que poseen una actividad enzimática única y/o son fácilmente distinguibles de la composición proteínica tanto intracelular como extracelular del sistema donde se expresan. La estrategia básica para analizar las propiedades transcripcionales de los elementos del promotor que se desea estudiar es insertándolos en el extremo 5' de la. región codificante del gen reportero, para que de esta manera se genere un vector quimérico, en el cual los elementos del promotor están controlando la actividad transcripcional del gen reportero, la cual puede ser cuantificada fácilmente (7, S).

d) La uteroglobina como indicador de actividad progestacional Para estudiar los efectos hormonales de la progesterona (P4), y de

diversas progestinas sintéticas, se ha utilizado el modelo de la uteroglobina (UTG), proteína que es secretada por las células endometriales de la coneja. La secrección de UTG se mantiene aproximadamente los primeros 12 días de la gestación, teniendo su máximo de producción al día 5 de la misma, constituyendo en esta etapa del 40-60% de las proteinas totales del fluido uterino (11, 12).

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. La UTG está compuesta por dos subunidades identicas, consitiendo cada

una de ellas de 70 aminoácidos unidas entre si por puentes disulfuro y uniones no covalentes (15). L a s funciones de esta proteína son desconocidas aún, pero se postula que puede estar directamente relacionada con la implantación y manutención del producto (16, 17), además de que se ha demostrado que la UTG está regulada por P4, ya que se ha observado que la sola administración de esta hormona aumenta los niveles del ácido ribonucleico mensajero (RNAm) de la UTG (18, 20).

Después de que el gene de UTG fué clonado y secuenciado, se han hecho estudios de interacción de receptor de P4 con ciertas regiones del gene, y se ha reportado la existencia de una zona de interacción del receptor de P4 a nivel de la región 5' del promotor, así como dentro del primer intrón del gene, las cuales contienen una secuencia palindrómica 5' TGTTCACT-3' que es consenso a un Elemento de Respuesta a Progesterona (PRE). Estos sitios han sido localizados entre las regiones -2427 a -2372 y -2706 y -2616 pb corriente arriba del sitio de iniciación de la transcrpción de dicho gene (19 ).

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11.- OBJETIVOS GENERAL Y PARTICULARES.

1. Construir vectores de expresión que contengan diferentes regiones del promotor de uteroglobina (UTG) suceptibles de regulación hormonal.

l. 1. Obtener, mediante el uso de enzimas de restricción, diferentes regiones del promotor de UTG, purificarlas y separarlas en geles de agarosa, e insertarlas en vectores de expresión (plásmido pEMBL8+) que contengan el gene reportero que codifica para la enzima cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). c E LB k 0 r; c; ?.? 2 9

1.2. Clonación, mediante el uso de técnicas de transformación bacteriana, de cada uno de los vectores de expresión que contengan las diferentes regiones del promotor de UTG.

1.3. Purificar los diferentes vectores de expresión mediante técnicas de purificación de plásmidos a pequeña y gran escala conocidas como "Miniprep" y "Maxiprep" respectivamente.

1.4. Verificar la funcionalidad e integridad de cada uno de los diferentes vectores mediante cortes enzimáticos y sus respectivas cartas de restricción.

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111.- OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS.

Tomando en cuenta los objetivos planteados al inicio del proyecto y los resultados obtenidos, se pueden mecionar que las metas alcanzadas son:

1) Se lograron obtener cepas bacterianas XL1 Blue transformadas con cada una de las clonas de interés que contienen regiones suceptibles de regulación hormonal del promotor de UTG.

2) De estas las cepas positivas que se obtuvieron, se amplificaron y purificaron cada uno de los vectores de expresión mediante técnicas de obtención de plásmidos a pequeña y gran escala (denominados "Miniprep" y "Maxiprep" respectivamente).

3 ) Se verificaron cada una de las clonas con enzimas de restricción y se obtuvieron diferentes fragmentos separados por medio de la técnica de electroforesis en geles de agarosa , lo que permitió comproborar la integridad de los diferentes vectores, así como cuantificar el grado de contaminación con DNA genómico bacteriano.

4) En ambas técnicas de extracción y purificación de los plásmidos (miniprep y maxiprep) se logró optimizar #el rendimiento tanto en concentración de DNA obtenido, así como en el tiempo de realización de la técnica.

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1V.- MATERIAL Y METODOS.

Se clonaron y purificaron cada uno de los vectores que contienen las regiones del promotor de uteroglobina, que poseen dominios que pueden ser potencialmente regulados por progesterona y progestinas sintéticas (insertadas en la región 5' del gen reportero CAT), mediante la transformación de bacterias E. co2i competentes (por la técnica de choque térmico), la posterior recuperación del vector por aislamiento del plásmido (mediante las técnicas de Mini-prep y Maxi-prep), y su verificación mediante digestiones enzimáticas.

A.- Preparación de medios. Para el crecimiento del cultivo bacteriano se prepararon las siguientes soluciones en condiciones de esterilidad:

1.- Medio LB (Luria Bertani). 10 g de triptona grado bacteriológico (Gibco BRL,, USA). 5 g de extracto de levadura grado bacteriológico (Gibco BRL, USA). 5 g de NaCl (Sigma Chemical Co., USA).

Ajustar a pH 7.5 con NaOH, aforar a 1 1 y esterilizar en autoclave. Guardar a temperatura ambiente.

2.- Medio LB sólido en caias de cultivo Medio LB líquido. Agar grado bacteriológico 1.5% (p/v) (Gibco BRL, USA). Ampicilina SO pg/ml.(selección de las bacterias transfonnantes).

3.- Ampicilina 1 mg/ml( - solución stock). 10 mg de ampicilina en 10 ml de agua estéril (Sigma Chemical Co., USA). Guardar en alícuotas de 1 ml a -2WC

4.- Bacterias Escherichia coli cepa - XL1-Blue Genotipo: recA 1 endA 1 gyrA96 thi- 1 hsdR17 sup E44 relAl lac [F'proAB IacIq ZAMlS TnlO (Tetr) ] (Stratagene, USA).

5.- Glicerol estéril . Glicerol (Sigma Chemical Co., USA) se esterilizar por autoclave y se guardar a temperatura ambiente

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B.- Tansformacion bacteriana Se realizaron transformaciones de la bacteria Escherichia coli , cepa XL1 Blue con cada uno de los siguientes plásmidos, los cuales contienen las secuencias de interes del promotor de Uteroglobina:

l.-UTG Eco RI-Bam HI TK CAT (UG 1) 2.-UTG Eco RI-Ava I TK CAT (UG 2) 3.-UTG Eco RI-Nae I TK CAT (UG 3) 4.-UTG Avr 11-Nae I TK CAT (UG 4)

1 .- Transformación bacteriana Para la transformación de las células bacterianas, cada uno de los

vectores de expresión (ADN plasmídico) contiene un origen de replicación autónomo y un gen de resistencia a un antibiótico (ampicilina; el cual se usa como criterio de selección de las bacterias transformadas). Es necesario que las bacterias se encuentren en la fase logarítmica de crecimiento en el medio de cultivo, para posteriormente se hagan permeables al ADN plasm'dico por medio de la incubación con una solución CaC12 0.1 M, de tal forma que el plásmido adicionado al medio pueda pasar al interior de la bacteria; se concluye este proceso por un choque térmico a 42OC, que sensibiliza aún más su pared para la fácil incorporación del plásmido. Las colonias de bacterias son seleccionadas con base en su crecimiento en un medio de cultivo selectivo en fase sólida que contiene un antibiótico específico (p. ej. ampicilina), al cual el plásmido introducido les confirió resistencia.

2.- Subcultivos de las bacterias transformadas De las bacterias transformadas, se seleccionaron las colonias con

características de crecimiento más definidas para ser resembradas en tubos estériles con 10 ml de medio LB (pH 7.4) con 50 pg/ml de ampicilina.

3.- Preservación de bacterias transformadas Subcultivos bacterianos, a una concentración de 3 X 1010 células/ml,

fueron congelados en glicerol al 50% y almacenadas a -2OOC, para su conservación. Estas bacterias permanece viables para posteriormente ser amplificadas mediante la técnica de aislamiento de plásmidos "maxiprep".

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C.- Arnplificacion v purificacion del DNA plasmídico.

1. Mini preparación - por lisis alcalina (Miniprep) A partir de 5 m1 de un cultivo bacteriano en LB/Ampicilina ( 5 0 pg/ml),

incubados durante 18-24 h, a 370C, en agitación constante, se tomaron 1.5 m1 en un tubo Eppendorf estéril de 1.9 m1 y se centrifugaron a 14,000 rpm por 20 segundos.se decantó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en 100 pl de GTE, se agregaron 200 p1 de un solución recién preparada de NaOWSDS y se mezcló por inversión. Se mantuvo en hielo durante 5 minutos y se agregaron 150 pl de Acetato de Sodio 5M, pH 4.8. Se centrifugó a 14,000 rpm durante 3 minutos, recuperándose el sobrenadante en un tubo nuevo al que se le agregaron 0.8 ml de etanol abssoluto, agitando por inversión. La muestra se congeló a - 20OC por 10 minutos y se centrifugó a 14,000 rpm por 10 minutos,se decantó el sobrenadante y se lavó el pellet con 1 ml de etanol al 70%. Nuevamente se centrifugó a 14,000 rpm por 5 minutos y se decantó, resuspendiendo el pellet en 30 pl de TE pH 8.0. Finalmente se cuantificó la concentracion de DNA obtenido por espectrofotometría. De ser necesario, se incubó la muestra con 3 pl de RNA asa (10 m@) a 37oC para eliminar la contaminación de RNA's. Se almacena a -2OoC 0*-7@c hasta su utilización.

SOLUCIONES. - GTE 50 mM Glucosa. 25 mM Tris-HC1 pH 8.0 10 mM EDTA pH 8.0.

Solución de NaOH/SDS 0.2 N NaOH 1% (p/v) SDS. (Preparada al momento de ser utilizada)

RNAasa 10 mg/ml. de ribonucleasa A Se guarda en alícuotas de 20 p1 a -2OoC

TE, pH 8.0 10 mM Tris-HC1, pH 8.0 1mM EDTA, pH 8.0 (Guardar a temperatura ambiente)

Acetato de sodio 3M 408 g de Acetato de Sodio x 3 H20 Ajustar pH a 5.2 con ácido acético Aforar a un litro.

Etanol al 70%. 70 ml de Etanol absoluto y 30 ml de agua esteril.

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2.- Maxi preparación " en Columnas de OUIAGEN 500 (Maxiprep) Teniendo 250 ml de un cultivo bacteriano en LB/Ampicilina (50 pg/ml),

incubado durante 18-24 h, a 37OC, en agitación constante, éste fué centrifugado a 7,000 rpm durante 3 minutos, se decantó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en 10 m1 de del buffer P1, inmediatemente después se añadieron 10 ml del buffer P2, mezclándose y dejandose incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente, posteriormente se agragaron 10 ml del buffer €3 y se centrifugó a 40C durante 30 minutos a una velocidad de 7,000 rpm, se recuperó el sobrenadante y se centrifugó nuevamente a 7,000 rpm durante 10 minutos. En las columnas (previamente equilibradas con 10 ml del buffer QBT) fué aplicado el sobrenadante prviamente centrifugado y se permitió que fluyera atravez de la columna (por la fuerza de gravedad), permitiendo con esto que el DNA plasmídico quedara retenido en las columnas, las cuales fuéron lavadas con 30 m1 de buffer QC y 15 m1 del buffer QF lo que permitió recuperar el DNA plasmídico, el cual fué resuspendido en TE pH 7.4 y cuantificado por espectrofotometria, obteniendo un rendimiento promedio aproximado de 500 p g por 250 m1 de cultivo bacteriano en LB, incubado a 37OC por 18-24 hrs.

Buffer P1 Buffer P2 Buffer I 3

EDTA 10 m M . SDS al 1% pH 5.5 pH 8.0. Adicionado con ARNasa (lmg/ml).

"";15")3 M r d 2 k-9

Tris-HC150 m M . NaOH 0.2 N Acetato de potasio 3M

Buffer QBT (Equilibrar columna) NaCl750 mM MOPS 50 mM Etanol al 15 % Triton la 15%

Buffer QC (Lavado de columnas) NaCl 1M. MOPS 50 mM Etanol al 15% Ajustar PH 7.0

.

Buffer OF. (Recupera el plásmido de las columnas) NaCl 1.25M.

Etanol al 15% Tris-HC1 50 mM

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D.- Electroforesis en geles horizontales de agarosa.

1.- Geles de agarosa al 1 % La electroforesis en geles de agarosa al 1% en TBE al OSX, es el

método más ampliamente utilizado para separar, identificar y purificar fragmentos de DNA; esta técnica permitió separar mezclas de fragmentos de DNA; que no pueden ser separados adecuadamente por otras técnicas de fraccionamiento, tales como los gradientes de densidad. Además de que la localización de bandas de DNA pudo ser determinadas dentro del mismo gel con el colorante fluorescente bromuro de etidio; se pueden detectar cantidades tan pequeñas como un ng de DNA por observación directa del gel en la luz ultravioleta (21).

Buffer TBE 5X (solución stock) Bromuro de etidio (10mg/ml) 54g. Tris base Disolver el colorante en agua 27.5g Acido bórico Guardar en frasco ámbar a 40C EDTA 0.5 M pH 8.0 Esterilizar por filtración

Gel de Agarosa.al 1 % Marcadores de peso molecular 0.5 g agarosa en 50 m1 TBE 0.5X Fago h cortado con Hind I11 Solución TE (pH 7.4) Fago +X-174 cortado con Hae I11

2.- Verificacion de los plasmidos con enzimas de restricción y comparación con sus respectivas cartas de restricción

Para la verificación de los plásmidos obtenidos se procedió a la digestion del plásmido con !.as siguientes enzimas de restricción, con respecto a las cartas de restricción de cada plásmido:

-€'st I la cual corta específicamente en la siguiente secuencia: 5' CTGCAA/G3'

y, Pvu I1 la cual corta específicamente en la siguiente secuencia: S'CAGICTG3' .

Buffer para Pst I Buffer para Pvu I1

MgC12 1OmM MgCl:! 6 mM NaCl50 m M . KC1 50 mM

NaCl50 mM

Tris-HC15OmM, pH 8.0 Tris-HC15OmM, pH 8.0

El digestión enzimática se llevó a cabo durante una hora a 37OC

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V.- RESULTADOS

AMPLIFICACION, PURIFICACION Y DIGESTION ENZIMATICA

Con el objetivo de obtener DNA puro se llevo a cabo la amplificación , purificación y digestión enzimática de los vectores por medio de la técnica de maxiprep, obteniéndose el DNA puro. Los resultados obtenidos se muestran en las figuras 1, 2 y 3.

Figura 1. Gel de agarosa al 1% que muestra el DNA obtenido de los plásmidos después de llevar a cabo la amplificación por medio de la técnica de maxiprep.

1353 -

603 -

CARRIL MUESTRA 1 marcador de peso molecular h/Hind 111, 2 pliismido UG 4, 3 plásmido UG 3, y 4 plásrnido UG 1.

Como se puede observar en los carriles 2, 3 y 4, presentan diversas bandas debido a las diferentes formas de enrollamiento presentes en la estructura de los plásmidos

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Figura 2. Gel de agarosa al 1% que muestra el DNA obtenido por medio de la técnica de maxiprep.

El primer carril coresponde al marcador de peso molecular @X- 174/Hae I l l ) y el segundo carril al plásmido UG 2.

Figura 3 . Digestión Enzimática con las enzimas de restricción Pst I y PVU 11.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1

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.

CARRIL 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10

MUESTRA marcador de peso molecular de 1 kb plásmido UG 4 intacto, plásmido UG 4 cortado con Pst I y Pvu 11, plásmido UG 2 intacto,. plásmido UG 2 cortado con Ps,t I, plásmido UG 3 intacto, -

plásmido UG 3 cortado con Pst I, plásmido UG 1 intacto, 2 2 2 5 2 9 plásmido UG 1 cortado con Pst I marcador de peso molecular @X-174 cortado con Hae I11

El plásmido UG 4 digerido con Pst I y Pvu I1 presentó los cuatro fragmentos ;- . .

esperados, correspondiendo el primero a aproximadamente 3762 pb, el 1.; * r: segundo fragmento a 1534 pb, el tercer fragmento a 438 y el cuarto k;. "' fragmento a 228 pb. t , >'',,, ;

.$. . *

El plásmido UG 2 digerido con Pst I presento dos fragmentos, el primero f ;

corresponde a 1700 pb, y el segundo de 938 pb.

El plásmido UG 3 digerido con Pst I presentó dos fragmento, uno de 3074 pb ;-* , . ~

y el otro de 41 1 pb.

El plásmido UG 1 digerido con Pst I presentó cinco fragmento de 3122 pb, 3074 pb, 1078 pb, 970 pb y de 785 pb respectivamente. i I

Los fragmentos obtenidos de cada uno de los plásmidos corresponden con sus respectivas cartas de restricción.

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VI.- CONCLUSIONES.

1.- El proceso de transformación de las bacterias fué el óptimo ya que se lograron obtener cepas resistentes a la ampicilina (antibiótico) , característica que solo pudo haber obtenido al ser transformada por un plasmid0 que le proporcionara tal resistencia.

2.- La resistencia a antibióticos se mantuvo, ya que colonias originales fueron reaisladas y mantuvieron su característica de sobrevivencia en medio con antibioticos.

3.- La técnica de miniprep, nos permitió obtener una concentración suficiente para poder corroborar que la bacteria fué transformada con el plásmido correcto, y que éste físicamente se encontraba integro.

4.- Con la técnica de Maxiprep, se obtuvieron concentraciones mayores, de las cuales permitió la verificación de cada uno de las clonas con enzimas de restricción

5.- La purificación de los plásmidos conteniendo regiones del promotor de UTG suceptibles de regulación hormonal fue realizada correctamente, ya que los plásmidos se encuentran tanto física como funcionalmente intactos, ya que los fragmentos obtenidos después de la digestión enzimática fueron los esperados en relación con la carta de restricción.

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