Escuela de Ingeniera en Biotecnologa Facultad de Ciencias Biolgicas Ingeniera en Gentica y Biotecnologa Acucola BIT 220-2Jorge Aedo Abadie Cristina Navarro Valenzuela

Practico de patologa en peces:Deteccin de Piscirickettsia salmonis a travs de un Ensayo inmunolgico en Fase Slida (ELISA)

Integrantes: Fernanda Arredondo Villalobos Mariajesus Nazal Valdebenito Francisco Gonzlez Wistuba Felipe Sez Cortez

Fecha de realizacin: 02 septiembre 2014Fecha de entrega: 09 septiembre 2014

IntroduccinLa industria acucola salmonera chilena es el segundo sector exportador del pas, y tambin es el segundo productor ms grande de salmones a nivel mundial, despus de Noruega hasta el 2013 segn la Asociacin de la Industria de Salmn de Chile A.G.1. Las tres especies ms cultivadas fueron introducidas al mar chileno en el siglo XX, siendo estas el Salmn Atlntico (Salmo salar), el Salmn del pacfico o Coho (Oncorhynchus kisutch) y la Trucha Arcoris (Oncorhynchus mykiss). El ao 1989 en Latino Amrica se report una prdida en un rango del 30 al 90% de Salmn Coho2 debido a una infeccin sistmica caracterizada por la colonizacin de varios rganos, incluyendo rin, hgado, bazos, intestinos, cerebro, ovarios y branquias3. Inicialmente se crea que la patologa estaba limitada solo a esta especie, ms aun posteriormente se report mortalidad por esta enfermedad en Salmon Atlntico, Salmn Salar, Salmn Chinook y Trucha Arcoris4. Piscirickettsia salmonis es el agente etiolgico de la Septicemia Rickettsial Salmondea (SRS) o Piscirickettsiosis. Esta bacteria es caracterizada por ser un patgeno intracelular no mvil, no encapsulado, pleomorfo, generalmente cocodea con un dimetro variable de 0.5 a 1.5 m5. Tiene una alta tasa de mortalidad en peces juveniles por lo que es de suma importancia el desarrollo de tecnologas para la deteccin rpida y oportuna del patgeno debido al alto impacto de la Industria acucola salmonera en la economa del Pas. Para ello se han desarrollado tcnicas de inmunoensayos para la deteccin oportuna, estas se basan en la interaccin especfica antgeno-anticuerpo. ELISA (Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay) es un mtodo inmunoenzimtico empleado para la deteccin de antgenos o anticuerpos. Se fundamenta en dos principios: 1) En que los antgenos y anticuerpos pueden ser absorbidos a una fase solida sin perder su reactividad inmunolgica, y 2) que tanto a los antgenos como anticuerpos se les puede ligar una enzima, formando un conjugado con actividad inmunolgica y enzimtica simultnea, facilitando la interpretacin de los resultados6. Especficamente, para la deteccin de P. salmonis en muestras de tejido se utiliza ELISA SRS, donde los anticuerpos monoclonales utilizados son especficos para P. salmonis ATCC y para 14 aislados obtenidos de diferentes centros de cultivo del sur de Chile. ObjetivosDeterminar la presencia de Piscirickettsia salmonis en una muestra problema a travs de un inmunoensayo ELISA SRS

Materiales y mtodos

En este practico se realiza un ensayo inmunoenzimtico en fase solida con el kit ELISA SRS del grupo BIOS S.A. el cual contiene los anticuerpos Anti- Piscirickettsia salmonis Policlonal y Anti- Piscirickettsia salmonis clon 7G4/D9, adems de un moderno sistema de un adhesivo biolgico para la fijacin de los anticuerpos a la placa.Para esto se agrega a cada pocillo de la placa 100 ul de cada muestra, las cuales consisten en 4 muestras problemas, un control positivo de p. salmonis y un control negativo. Luego la placa se sella y se lleva a incubar por 1 hora a 37C. En esa hora se prepara la solucin de lavado y se diluye 1:25.A continuacin se elimina el contenido de los pocillos y cada uno se lava con 350 ul de la solucin preparada anteriormente, luego el contenido se elimina nuevamente, esto se repite 4 veces para asegurar un buen lavado.Una vez que los pocillos fueron meticulosamente lavados se agrega a cada uno 50 ul de una solucin de anticuerpo y 50 ul de una solucin de conjugado, se vuelve a sellar y se lleva a incubar por 30 minutos a 37C y luego se vuelve a repetir el lavado, nuevamente 4 veces para asegurar un buen lavado. Luego se mezclan los sustratos A (Tetrametil-benzidina) y B (Perxido de Hidrogeno) en partes iguales y de esta mezcla a cada pocillo se le agregan 100 ul, esto se realiza para luego poder revelar los resultados. Se agregan 100 ul de H2SO4 3N para detener la reaccin.Finalmente se realiza la lectura.

Resultados:Se utiliz una placa de ELISA pequea con 8 pocillos, sin embargo, solo se utilizaron 6 pocillos (Figura 1). A cada pocillo de la placa de ELISA se le midi la absorbancia (tabla 1). Estos resultados son consistentes con lo esperado, puesto que se obtuvo una mayor absorbancia en el control positivo, el cual consiste de una muestra en una suspensin pura de Piscirickettsia salmonis (P. salmonis) que se encuentra inactiva, mientras que el pocillo con menor absorbancia corresponde al control negativo (agua destilada).

PocilloAbsorbancia

C+0,966

C-0,021

M10,486

M20,105

M30,291

M40,027

Figura 1: Esquema representativo de la placa de ELISA de 8 pocillos utilizada, donde C+ corresponde al pocillo de control positivo (muestra pura de P. salmonis), C- al pocillo de control negativo (agua destilada), M1, M2, M3 y M4 corresponden a pocillos de muestra, X1 y X2 corresponden a pocillos extras que no se utilizaron, por lo que se ignoran.

Tabla 1: Valores de absorbancia obtenidos en la placa de ELISA. En la columna izquierda se observa el pocillo al cual se le midi la absorbancia, donde C+ corresponde al control positivo de P. salmonis, C- corresponde a agua destilada, M1, M2, M3 y M4 corresponden a muestras problemas.

Para determinar que muestra efectivamente corresponde a un resultado positivo, es necesario calcular el Cut off. Para esto, es necesario conocer el promedio de los valores de los controles negativos obtenidos por los otros investigadores (tabla 2).Tabla 2: Valores de absorbancia de los controles negativos obtenidos por los distintos grupos de investigadores.

MuestraGrupo 1Grupo 2Grupo 3Grupo 4Grupo 5Promedio

C-0,0380,0210,0870,0250,0360,0414

El clculo del Cut off se determina con la siguiente frmula:

El Cut off en este caso corresponde a 0.314, por lo que todos los valores de absorbancia por sobre 0.314 corresponden a un resultado positivo. Por consiguiente, se determina que slo la muestra 1 contienen antgenos que son reconocidos por los anticuerpos del Kit, por lo que se sugiere fuertemente que la muestra 1 (M1) contienen Piscirickettsia salmonis.

Discusin:La tcnica ELISA corresponde a un mtodo ampliamente usado como tcnica de deteccin de txicos o bacterias mediante el uso de anticuerpos especficos conjugados a enzimas, y se caracteriza por presentar varias ventajas en comparacin a otras tcnicas, tales como su alta sensibilidad, deteccin de sustancias a concentraciones bajas, o por su rapidez, aunque como inconveniente es posible que ocurran reacciones cruzadas que entreguen falsos resultados positivos7. Para obtener buenos resultados y asegurar que sean confiables y reproducibles adems de las ventajas y desventajas antes mencionadas, es importante considerar distintos elementos entre los cuales estn: La eleccin de la fase slida, de los conjugados, de los sustratos, y la cuantificacin del producto coloreado. Por lo que la disminucin en la especificidad de la tcnica o errores presentados en esta se podran deber a una mala determinacin de estos factores8. En resumidas cuentas se tiene lo siguiente: La eleccin de la fase slida es uno de los elementos ms importantes ya que consiste en el soporte de la reaccin, por lo que la adsorcin a esta depende de factores como el pH, caractersticas fsicas de su superficie y el tipo de protena. Elementos que deben ser estandarizados para cada procedimiento en especfico8. Los conjugados elegidos dependen del tipo de ensayo, en ELISA se utilizan anticuerpos unidos a enzimas (tal como se hizo en este experimento) o unido a antgenos. Se consideran distintos tipos de anticuerpos, ya sean policlonales o monoclonales de acuerdo a la especificidad, y la eleccin de la enzima depende de su estabilidad, bajo costo, alta velocidad de recambio, fcil deteccin, entre otros7. Como sustrato ptimo se tiene que elegir alguno que genere un producto soluble cuantificable, teniendo en cuenta su estabilidad, toxicidad y costo. En general se utiliza como primer sustrato perxido de hidrgeno (como en este experimento) y un segundo sustrato (Cromgeno) que cambia de color al oxidarse por el O2 liberado, que en este prctico fue Tetrametil-benzidina8. Y finamente el anlisis de producto coloreado se logra mediante la medicin de intensidad de color por espectrofotometra, para cada color se debe determinar la longitud de onda a la cual se da la mxima absorcin, para nuestro caso en Tetrametil-benzidina se lee a 450 nm8.Entonces al tener en cuenta todo esto como posibles errores y enfocndonos ahora al experimento en s, la enzima peroxidasa conjugada con el anticuerpo (luego de la unin al antgeno) debiese generar un producto coloreado al reaccionar con los sustratos. Esto sirve como indicador ya que la concentracin de este producto se relaciona directamente con la cantidad de antgeno presente en la muestra9, por lo que al medir mediante espectrofotometra es posible detectar si hay o no presencia de Piscirickettsia salmonis. Los resultados vistos en la tabla 1 revelan un valor de absorbancia bajo para M2, M3 y M4 al compararlos con la muestra M1, adems como se mencion anteriormente se considera que los valores menores al Cut off, cuyo valor es 0.314 como se observa en la tabla 2, no indicaran presencia del antgeno. Entonces se presume que slo en M1 podra haber Piscirickettsia salmonis ya que concuerda con los resultados de los controles al haber ms cercana al control positivo, aunque la cantidad de antgeno presente en la muestra sera relativamente pequea. Cabe destacar tambin que hay concordancia en los controles utilizados segn lo esperado, es decir, en C+ donde se sabe que hay antgeno se ve una alta absorbancia, mientras que para el agua destilada (C-) esta es mnima. Entonces los resultados fueron bastante satisfactorios ya que hay concordancia respecto a los fundamentos de la tcnica y lo obtenido, adems de que hay claras evidencias que sugieren que hubo deteccin del antgeno en M1, donde est por ejemplo el uso de controles y tambin el hecho de haber empleado anticuerpos monoclonales (que resultan ser ms especficos para el antgeno a detectar ya que presentan un mayor homogeneidad)10, que dan ms fiabilidad a la tcnica. ConclusinSe concluye que hay indicios muy evidentes de que haya Piscirickettsia salmonis en la muestra 1 y no en las otras, lo que da cuenta de la utilidad, facilidad de uso y eficiencia del mtodo SRS ELISA para la deteccin en este caso, de la bacteria antes mencionada.

Referencias1. http://www.salmonchile.cl/es/historia-en-chile.php#2008-2013. Visitado 06.09.2014 a las 11.25 am2. Fryer, J. L., Lannan, C. N., Giovannoni, S. J., & Wood, N. D. (1992). Piscirickettsia salmonis gen. nov., sp. nov., the Causative Agent of an Epizootic Disease in Salmonid Fishes.International Journal of Systematic Bacteriology,42(1), 120-126.3. Gomez, F. A., Tobar, J. A., Henrquez, V., Sola, M., Altamirano, C., & Marshall, S. H. (2013). Evidence of the presence of a functional Dot/Icm type IV-B secretion system in the fish bacterial pathogen Piscirickettsia salmonis.PloS one,8(1), e54934.4. Garcs, L. H., Larenas, J. J., Smith, P. A., Sandino, S., Lannan, C. N., & Fryer, J. L. (1991). Infectivity of a rickettsia isolated from coho salmon Oncorhynchus kisutch.5. Gmez, F., Henrquez, V., & Marshall, S. H. (2009). Additional evidence of the facultative intracellular nature of the fish bacterial pathogen Piscirickettsia salmonis.Arch Med Vet,41, 261-267.6. Gmez, S. F., Ardila, N. S. R., & Gutirrez, M. F. (1994).La inmunologa en el diagnstico clnico. Pontificia Universidad Javeriana. Pgina 807. Repetto, M. (1997). Toxicologa Fundamental. Ediciones Diaz de Santos. 335-336.8. Gmez, A. A., Agudelo, C. M., Snchez, S. B., Clavijo, M. C., vila, A. C., Correa, C. D., ... & Isabel, S.Fundamentos de ciencias bsicas aplicadas a la odontologa. Pontificia Universidad Javeriana.158-159.9. Devlin, T. M. (2004).Bioqumica: libro de texto con aplicaciones clnicas. Revert. 456-457.10. lvarez-Vallina, L. (Ed.). (2004).Anticuerpos monoclonales: realidades y perspectivas. Editorial Complutense.