Prácticas de Virología

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Prácticas de Virología. Índice Práctica 1: Detección y cuantificación de bacteriófagos de Escherichia coli. Introducción Material y método Resultados y discusión Práctica 2: Aislamiento, purificación y titulación de un stock fágico. Introducción Material y método Resultados y discusión Práctica 3: Estudio comparativo de distintos filtros de membrana en la adsorción y recuperación de bacteriófagos. Introducción Material y método Resultados y discusión Práctica 4: Lisogenia e inducción al ciclo lítico. Introducción Material y método Resultados y discusión Práctica 5: Fagotipia de Salmonella. Introducción Material y método Resultados y discusión Anexo.

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Prácticas de Virología. 

Índice

Práctica 1: Detección y cuantificación de bacteriófagos de Escherichia coli.

IntroducciónMaterial y métodoResultados y discusión

Práctica 2: Aislamiento, purificación y titulación de un stock fágico.

IntroducciónMaterial y métodoResultados y discusión

Práctica 3: Estudio comparativo de distintos filtros de membrana en la adsorción y recuperación de bacteriófagos.

IntroducciónMaterial y métodoResultados y discusión

Práctica 4: Lisogenia e inducción al ciclo lítico.

IntroducciónMaterial y métodoResultados y discusión

Práctica 5: Fagotipia de Salmonella.

IntroducciónMaterial y métodoResultados y discusión

Anexo.

Medios de cultivoÍndice NMP

 

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Práctica 1: Detección y cuantificación de bacteriófagos de Escherichia coli.

>> Introducción:

El objetivo de la práctica es detectar y cuantificar bacteriófagos específicos de E. coli (colifagos) en una muestra de agua residual, utilizando las técnicas de recuento directo (Doble abar layer, DAL) y número más probable (NMP). Como cepa hospedadora se utilizará Escherichia coli C (ATCC 13706).

Por la técnica DAL se detectan bacteriófagos por placas de lisis. Una calva o placa de lisis es una zona de lisis o de inhibición celular causada por la infección vírica en un cultivo de células sensibles. Para favorecer la adsorción del fago en la célula hospedadora se usará medio agar Luria, el cual es un medio rico enriquecido en iones divalentes como Mg++ y Ca++.

La técnica DAL es poco util para muestras muy contaminadas: interferencias por parte de microorganismos diferentes al hospedador del bacteriófago de interacciones de los fagos con materia orgánica particulada provocan que se subestime el título vírico. Para eliminar el error por subestimación debido a la contaminación de la muestra, que nos puede impedir distinguir placas de lisis, someteremos a ésta a distintos tratamientos físicos o químicos para eliminar los elementos contaminantes. Estos son los siguientes:

- Medio selectivo: utilización del medio mFC como agar soporte en la técnica de DAL. El medio mFC es un medio selectivo de bacterias coliformes fecales (como E. coli).

- Pretratamiento de la muestra (a realizar sobre 10 ml de la muestra). Este paso permite eliminar la microbiota acompañante sin eliminar los bacteriófagos, evitando que los microorganismos presentes nos oculten al crecer las calvas de lisis. Estos son los diferentes pretratamientos que se aplicarán:

- centrifugación: 3000 xg, 20 min. En el sobrenadante estarán los bacteriófagos, el cual se recogerá y se analizará por la técnica DAL.

- filtración por membrana: filtros de policarbonato de 0.45 mm de tamaño de poro.

- filtros sin tratar: el tamaño de poro del filtro impide que bacterias atraviesen el filtro, pasando solamente los bacteriófagos. El inconveniente es que algunos fagos quedan adsorbidos a las membranas.

- filtros tratados con solución estéril de extracto de carne al 3%, pH 9.0: este pretratamiento del filtro cubre las cargas negativas de este, disminuyendo la capacidad de retener los bacteriófagos.

- tratamiento con cloroformo: 10% de cloroformo, 4ºC durante 20 min. El cloroformo rompe las membranas lipídicas de bacterias Gram negativas. Tras incubación se deja que precipiten las bacterias y se recoge el sobrenadante con los fagos. El inconveniente de esta técnica es que tambien elimina los bacteriófagos envueltos.

- Control: como control usaremos la técnica DAL sobre muestras sin tratar.

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Para expresar los resultados se cuentan las placas de lisis y se procede a la titulación de bacteriófagos. Una placa de lisis procede a una partícula fágica, por lo que el número de placas que aparecen en el cesped bacteriano después de la incubación es directamente proporcional a la cantidad de fago sembrado. Si se producen y placas al sembrar un volumen v (en ml) de una dilución x, el título n de unidades formadoras de placas por mililitro (ufp/ml) es: n = y / vx. El recuento de placas de fagos es completamente análogo a una enumeración de colonias bacterianas; la relación entre el número de placas y la cantidad de fago sembrada es estrictamente lineal. Esta linearidad puede explicarse porque cada placa procede de una sola partícula viral.

La técnica del número más probable (NMP) es más larga que la de DAL pero es también más sensible ya que presenta un paso de enriquecimiento. Es un método que se usa para aguas muy poco contaminadas. Este método es muy sensible ya que con él somos capaces de detectar una sola partícula vírica en un volumen total de 33.3ml. Presenta tres fases:

- Presuntiva: tendremos una batería de tres series de tres tubos a unos volúmenes determinados. Con esta fase lo que pretendemos es conseguir un enriquecimiento de las partículas víricas presentes en la muestra.

- Descontaminación: la descontaminación se puede hacer mediante centrifugación o por adición de cloroformo. Haremos uso de esta última.

- Confirmativa: con esta última fase identificaremos qué tubo, de los sembrados en la prueba presuntiva, es positivo. Para ello haremos uso de la prueba de la gota de Adams, gracias a ésta los positivos se detectarán por la formación de placas de lisis.

Una vez obtenida la combinación de los positivos miraremos en las tablas del índice NMP, basado en las distribución de Poison, que nos dará el Número Más Probable de partículas víricas en 100ml (NMP/100ml).

>> Material y método:

Para la técnica de DAL (Doble Agar Layer / Doble capa de agar) el material es el siguiente:

- Cultivo en caldo de Escherichia coli C (ATCC 13706).

- Solución salina.

- Agar Luria.

- Agar blando.

- Cloroformo.

- Extracto de carne al 3%.

- Medio mFC.

- Filtros de policarbonato de 0.45 mm de poro.

- Centrifugadora.

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- Placas de Petri.

- Pipetas.

Detectaremos los bacteriófagos por formación de placas de lisis. Primeramente construiremos una batería de diluciones seriadas en solución salina partiendo de nuestra muestra, que serán las que analizaremos: 10-2, 10-3, 10-4 y 10-5. El procedimiento para cada uno de los casos es el que se describe a continuación:

- Control: Nuestro control no pasará por ningún tratamiento de descontaminación bacteriana por lo que directamente inocularemos los tubos de agar blando (en sobrefusión, mantenidos a 45ºC) con 0.2 ml de un cultivo en caldo en fase exponencial de crecimiento bacteriano de Escherichia coli, bacteria hospedadora, y 1 ml. de las respectivas diluciones a analizar. Agitamos suavemente sin que se formen burbujas y vertemos sobre una capa de Petri con una placa soporte de agar Luria, procurando una diseminación uniforme. Una vez solidificada la doble capa la invertimos las placas y dejamos incubando a 18ºC durante 15 h. Pasado el tiempo de incubación se desarrollará un césped bacteriano sobre el que aparecerán placas de lisis que nos indicarán la presencia de colifagos. Realizaremos el recuento de las placas a partir del cual podremos calcular el título de fagos en unidades formadoras de placas por mililitro (ufp/ml).

- Centrifugación: Cogeremos 5ml de las diferentes diluciones creadas a partir de la muestra y las sometemos a centrifugación a 3000xg durante 20 min. Una vez centrifugadas tomaremos el sobrenadante que es donde se encuentran las partículas víricas. De ese sobrenadante inocularemos 1 ml. al tubo de agar en sobrefusión al que previamente le hemos añadido 0.2 ml del cultivo en caldo de la bacteria hospedadora. Verteremos sobre agar Luria en una placa, dejamos que solidifique. La incubación se dará a 37ºC durante 24 h. Haremos un recuento de las placas una vez formadas.

- Cloroformo: Tomamos 5ml de cada una de las diluciones de la muestra a las que añadiremos 1 ml. de cloroformo (la concentración de cloroformo debe ser del 10%). Agitamos y mantenemos a 4ºC durante 10min. Pasado ese intervalo de tiempo observaremos cómo las bacterias han precipitado quedándonos con el sobrenadante del que tomaremos 1ml que inocularemos en el tubo de agar en sobrefusión, más 0.2 ml. del cultivo de la bacteria hospedadora. Agitamos y vertemos sobre una capa soporte de agar Luria. Dejamos solidificar e incubamos 24h a 37ºC, y volvemos a hacer un recuento de las placas de lisis.

- Filtración por membrana: Pasaremos a través de un filtro de 0.45mm de tamaño de poro 10 ml. de cada una de las diluciones de la muestra. El volumen del filtrado será en el que se encuentren las partículas víricas ya que la bacterias al ser de mayor tamaño se quedan retenidas en el filtro. Del filtrado tomaremos 1 ml. que, junto con 0.2 ml. de la bacteria hospedadora, inocularemos en un tubo de agar blando que verteremos sobre una placa de Petri con agar Luria como base. Dejamos solidificar y se incuba a 37ºC, 24h. Tras este tiempo de incubación se observarán y contarán las placas de lisis formadas por la infección de las partículas víricas existentes en nuestra muestra sobre las bacterias.

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- Filtración a través de filtro tratado con solución ésteril de extracto de carne: Tomamos 10ml de solución extracto de carne al 3% que pasaremos a través de un filtro de 0.45 mm. de tamaño de poro. Con esto lo que provocamos es una colmatación del filtro por las proteínas que constituyen el extracto. Ahora filtraremos las diluciones de la muestra con el mismo filtro tratado. Obtendremos tanto las partículas víricas obtenidas con el tratamiento anterior (filtración) más aquellas que quedaban retenidas en los poros debido a que ahora el filtro está colmatado por las proteínas. Del filtrado tomaremos 1ml y seguiremos los mismos pasos que los indicados en los tratamientos anteriores para formar una doble capa de agar. Incubamos y haremos, posteriormente el recuento de placas de lisis.

- Empleo de medio mFC: Se hará de la misma manera que con el control pero como agar soporte usaremos el medio mFC que es selectivo, en lugar del agar Luria.

Expresaremos el % de recuperación fágica, siendo el título de las placas control el 100%. El mejor método será aquel que consiga mayor recuperación y mayor descontaminación.

Para la técnica del NMP (Número Más Probable) el material requerido es el siguiente:

- Cultivo en caldo de Escherichia coli C (ATCC 13706).

- Caldo PAB (Ver Medios de cultivo).

- Agar Luria (Ver Medios de cultivo).

- Cloroformo.

- Pipetas.

- Asa de platino.

El primer paso es el enriquecimiento: disponemos de tres series de tres tubos de PAB (la primera de ellas con medio doble concentrado) y añadiremos a cada uno de los tubos 0.2ml del cultivo en caldo de Escherichia coli C e inocularemos distintos volúmenes de la muestra a analizar:

- Serie nº1 (caldo doble concetrado): 10ml

- Serie nº2: 1ml

- Serie nº3: 0.1ml

Incubamos los tubos a 37ºC durante 18h. Pasado el tiempo de incubación añadiremos a cada tubo un 10% de cloroformo, agitaremos vigorosamente y dejamos decantar a 4ºC durante 20min. Tomaremos el sobrenadante que es el que está constituído por las partículas víricas.

¿Como determinamos que existe ese microorganismo? Haciendo una prueba confirmativa: identificaremos cuál de los tubos es positivo, el enriquecido en partículas víricas, haciendo uso de la prueba de la gota de Adams. Ésta consiste en sembrar una placa de agar Luria por la técnica de la doble capa con el hospedador bacteriano y dejamos solidificar. Dividiremos la placa en tres sectores correspondientes a las distintas series (10, 1 y 0.1), y con el asa de platino flameada y fría depositaremos una gota de cada uno de los tubos ya crecidos y previamente descontaminados con

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cloroformo de PAB (coger de a fase acuosa superior). La incubación de la placa será a 37ºC durante18h.

Transcurrido el periodo de incubación hay que anotar los resultados positivos en función del volumen de muestra analizado, es decir, las gotas que aparecen con calvas o lisis confluente o semiconfluente en función del volumen de muestra analizado. Determinaremos el NMP de colifagos en 100 ml. de muestra a partir de la combinación de resultados positivos en la prueba confirmativa utilizando una tabla de NMP.

>> Resultados y discusión:

Los resultados obtenidos en la práctica del DAL fueron los que se indican en la siguiente tabla:

  -2 -3 -4 Contaminación

Control 130 / 146 21 / 23 5 / 2 + + +

mFC 89 / 221 20 / 17 5 / 4 -

Filtración 2 / 2 1 / 0 0 / 0 -

F+BE 97 / 166 0 / 6 0 / 1 -

Centrifugación 141 / 149 15 / 22 0 / 1 + +

159 / 159 20 / 28 5 / 9 +

Cloroformo 4 / 0 1 / 3 1 / 0 -

Cálculo del título =

Título control = = 1.79 · 104 unidades formadoras de placas / ml.

Título mFC = = 8.95 · 103 ufp/ml.

Título filtración = no calculado (bajo número de ufp).

Título filtración + extracto de carne esteril = = 1.315 · 104 ufp/ml.

Título centrifugación = = 1.785 · 104 ufp/ml.

Título cloroformo = no calculado (bajo número de ufp).

  ufp/ml % de recuperación Contaminación

Control 1.79 · 104 100 + + +

mFC 8.95 · 103 50 -

Filtración ? ? -

F+BE 1.315 · 104 73.5 -

Centrifugación 1.785 · 104 99.72 + +

+

Cloroformo ? ? -

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Se observa un mayor porcentaje de recuperación en el uso de la centrifugación, pero si tenemos en cuenta que existe contaminación con la centrifugación vemos que el mejor tratamiento es el de la filtración pretratada con extracto de carne ya que, además de conseguirse un gran porcentaje de recuperación de bacteriófagos es capaz de eliminar la contaminación de la muestra por parte de bacterias o de materia orgánica particulada. Esto contrasta con el filtrado sin pretratamiento, por lo que claramente nos indica que ha habido adsorción por parte del filtro de las partículas fágicas.

En cuanto a la práctica del NMP estas fueron las placas de lisis obtenidas por la prueba de la gota de Adams:

Serie nº 1 (10ml): 3

3 - 1 - 0 Serie nº 2 (1ml): 1

Serie nº 3 (0.1ml): 0

Dilución: 10-5

4.3 · 106 NMP / 100 mlLímite de confianza 95%: 7 (inf) - 210 (sup)

En los otros grupos:

3 - 3 - 3 ³ 2.4 · 108 NMP / 100 ml3 - 3 - 0 2.4 · 106 NMP / 100 ml3 - 2 - 0 9.3 · 105 NMP / 100 ml3 - 1 - 0 4.3 · 106 NMP / 100 ml2 - 0 - 0 9 · 105 NMP / 100 ml

Vemos que con la técnica del DAL el título era de 1.79 · 104 unidades formadoras de placas / ml, mientras que con la técnica del NMP nos sale un valor de 4.3 · 104 NMP / ml, valores bastante aproximados aunque generalmente el NMP sobrevalora el título del DAL.

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Práctica 2: Aislamiento, purificación y titulación de un stock fágico.

>> Introducción:

El objetivo es la obtención de un stock fágico a partir de una de las placas de lisis del ensayo de detección de bacteriófagos específicos de Escherichia coli, utilizando el método en caldo. El stock fágico obtenido se titulará por la técnica DAL.

Asumimos que cada calva procede de una única partícula vírica, luego cogemos una porción de cada calva. Si una calva de lisis crece indefinidamente todo el agar sería una gran calva, pero esto no sucede asi, pues hay un tamaño máximo que viene determinado por cada sistema fago-hospedador (morfología y tamaño mas o menos constantes para cada fago-hospedador). Tambien depende del medio de cultivo, influyendo este en el tamaño de la calva.

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Los fagos que son grandes y con morfología completa tienen mas dificultades físicas para difundir por el agar. Ademas, los fagos mas complejos tardan mas en multiplicarse. La concentración de agar en el medio tambien influye, favoreciendo que las partículas víricas difundan mas o menos. Entonces, si tenemos todos los parámetros fijos y vemos dos placas distintas entonces estamos con dos fagos diferentes.

Las calvas se pueden diferenciar en:

- diámetro de las calvas.

- bordes regulares o lisos.

- calvas claras o turbias.

- presencia o ausencia de anillos concentricos (los anillos pueden ser causa de variación en el crecimiento bacteriano o bien porque al lisarse las bacterias se liberen enzimas que lisas a bacterias vecinas).

- presencia o ausencia de halos (los halos son consecuencia de la liberación de enzimas de degradación por parte de las bacterias lisadas, enzimas que difunden en el agar).

Para el aislamiento y purificación utilizamos la característica de las placas de lisis, las cuales se forman a partir de un fago. Elegiremos una placa de lisis, lo ideal será tomar la de la dilución mayor ya que será la que presente menor contaminación al no encontrarse las placas cerca unas de otras, la purificación se obtendrá de forma más fácil. Debemos apuntar las características de la placa a aislar, lo cual nos servirá para compararlas con las placas formadas en nuestro stock, comprobando si verdaderamente hemos aislado y purificado la placa.

>> Material y método:

- Agar Luria.

- Agar blando.

- Caldo TSB, suplementado con 1.2mM de SO4Mg-7H2O y 5mM de Cl2Ca, con cultivo de Escherichia coli y sin nada.

- Centrifugadora.

- Asa de platino.

- Pipetas.

El procedimiento es el siguiente: hay que seleccionar una placa de lisis individualizada de la que anotaremos sus características. Con el asa de platino rasparemos esa placa, incluso podemos llegar a introducirla en el interior del agar ya que las partículas víricas también se encuentran ahí. Este inóculo fágico se transfiere a un tubo de cultivo en fase exponencial de crecimiento del hospedador bacteriano en caldo TSB, suplementado con 1.2 mM de SO4Mg - 7 H2O y 5 mM de Cl2Ca. Agitamos vigorosamente e incubamos a 37ºC durante 12-18 h., periodo durante el cual se da un enriquecimiento del inóculo.

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Tras la incubación eliminamos las bacterias por centrifugación (3000xg, 20 min) quedándonos con el sobrenadante que es donde se encuentran las partículas víricas.

Dos notas: por un lado, el uso de la centrifugación se hace preferentemente al del cloroformo, ya que el fago puede ser sensible a este compuesto. Por otro, todo este proceso generalmente se repite dos o tres veces mas, pero por falta de tiempo solo lo haremos una vez.

Con esa fracción vamos a hacer una titulación realizando una batería de diluciones:

- 10-2 (que se consigue añadiendo 9.9 ml. de solución salina a 0.1 ml. de sobrenadante).

- 10-4, 10-6 y 10-7 (a partir de la dilución 10-2).

Por duplicado, realizaremos la técnica DAL de las diluciones 10-6 y 10-7 (añadiendo 1 ml. de cada una de estas dos diluciones en dos placas en cada caso), y de una nueva dilución 10-8 (esto se consigue añadiendo 0.1 ml. de la dilución 10-7 en las dos placas correspondientes). Incubamos a 24 h. a 37ºC. Transcurridas las 24 h. observaremos las placas de lisis formadas y calcularemos el título fágico.

>> Resultados y discusión:

La placa a aislar era una calva clara de borde regular, sin anillos ni halos y cuyo diámetro era de aproximadamente 4 mm. Hacemos el recuento de las placas obtenidas en cada una de las diluciones:

Dilución Nº de placas de lisis Título (ufp / ml)

10-6 62 / 73 6.75 · 10-7

10-7 11 / 13 -

10-8 2 / 0 -

Observaciones: las placas coinciden perfectamente en la morfología de la calva que aislamos. Asi hemos aislado, purificado el stock fágico y enriquecido la muestra.

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Práctica 3: Estudio comparativo de distintos filtros de membrana en la adsorción y recuperación de bacteriófagos.

>> Introducción:

El método de concentración de virus se usan para muestras muy diluídas, pues gracias a este método es posible detectar contaminación a pesar de estar a muy baja concentración. Asi, si hay que analizar la presencia de virus en un volumen de 10-100 l. de una muestra de origen animal se procede a la concentración debido al gran volumen del que se dispone.

El objetivo de esta práctica es ensayar y evaluar dos métodos empleados para la concentración de virus: filtración simple y VIRADEL (virus/adsorción/elución), aplicados al análisis cuantitativo de una muestra de colifagos de bajo título. Para evaluar la eficiencia de los métodos de concentración

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utilizados se estimará el número de colifagos presentes en la muestra mediante recuento directo, utilizando las técnicas de la capa de agar simple (SAL) y la doble capa de agar (DAL). Los resultados deben expresarse como:

- porcentaje de recuperación fágica: respecto al título obtenido en el ensayo directo de la muestra.

- porcentaje de adsorción de las partículas víricas a los distintos tipos de filtros ensayados: se estimará a partir del título fágico del filtrado.

- porcentaje de elución: se estimará considerando como 100% el número de fagos adsorbidos al filtro ensayado.

Existen varias técnicas de concentración de muestras diluidas, entra las cuales distinguimos las siguientes:

- ultracentrifugación.

- precipitación diferencial con polietilenglicol.

- adsorción a distintas sustancias y elución en bajo volumen (por ejemplo 5 ml.).

En las técnicas de adsorción se presentan dos problemas: como adsorbemos y como despegamos. Para la adsorción hay que usar un tipo de soporte en el que el virus pueda unirse por interacciones electrostáticas. Los filtros que existen en el mercado son:

- filtros electronegativos: policarbonato o estereocelulosa.

- filtros electropositivos: son mas difíciles de conseguir.

En los filtros electronegativos, a pH 7.0 los virus tienen carga neta negativa y no sería posible una buena adsorción. Los filtros electropositivos están hechos de materiales difíciles de utilizar (no están aun muy perfeccionados) porque son muy gruesos y se colmatan muy pronto. A su desuso por estas causas hay que añadirle su alto coste en el mercado.

Distinguimos una primera fase en el método de concentración: la fase de adsorción. Hay que conseguir las condiciones idóneas para que los bacteriófagos queden retenidos en las membranas de los filtros. Hay que tener en cuenta que los filtros que utilizamos presentan carga neta negativa y que la mayor parte de los virus presentan, a pH 7.0 carga negativa. Asi no es posible que se den interacciones electrostáticas entre los virus y la membrana. Hay 3 mecanismos para evitar esto y favorecer la adsorción de las partículas fágicas por parte del filtro:

- bajando el pH de la muestra cambiamos la carga del virus a un valor de pH de aproximadamente 4.0 la carga del virus es positiva. Los enterovirus (virus resistente al pH ácido del estómago) son resistentes a la acidificación, pero estos virus son una excepción: la mayoría de los virus no soportan valores bajos de pH, asi que una disminución en el pH puede inactivar a bacteriófagos.

- modificando la carga del filtro, tratando estos con polímeros catiónicos que se encargarán de modificar la carga. En este caso se usará una resina llamada PEI (polietilénimina). Gracias a este cambio de carga del filtro los virus se sentirán atraídos/adsorbidos, por el filtro.

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- mediante puente salino entre la partícula vírica y el filtro (ambos cargados negativamente), usando una sal anticaotrópica (como sales de calcio y magnesio): la adición a la muestra iones divalentes, como Mg++, permite la unión al filtro, ya que sus dos cargas sirven como puente de unión entre la partícula vírica y el filtro.

En la práctica vamos a ensayar y evaluar el proceso de concentración con un mismo filtro electronegativo de 0.45 mm de diámetro de poro en los casos de: filtro y muestra sin tratar, filtro tratado con PEI y muestra tratada con Cl2Mg. Todos los filtrados obtenidos por los tres tratamientos se analizarán por la técnica SAL.

Una vez tengamos los virus adsorbidos a la membrana, se procede a la elución (separación de los virus que han quedado adsorbidos en el filtro). La elución implica dos técnicas que lo que hacen es debilitar las fuerzas de unión partícula vírica-filtro. Esos dos tratamientos son:

- filtración simple: esta técnica consiste en poner en contacto a la membrana de policarbonato con una placa de medio de cultivo donde vaya una sustancia capaz de romper estas interacciones electrostáticas (detergente, urea, etc...). La urea es tóxica en un medio de cultivo, pero hay componentes no tóxicos para el crecimiento bacteriano, como Tween-80. Asi pues las placas de agar Luria presentan Tween-80, detergente que actúa rompiendo las interacciones hidrofóbicas y, por tanto, eluirá a los virus. Hay que anotar que el medio presenta TTC que favorece la visualización de las placas de lisis ya que cuando lo reduce la bacteria toma color rojo

- técnica del VIRADEL (virus-adsorción-elución): esta técnica puede aplicarse para cualquier virus, pero está optimizada para bacteriófagos. Se añade un pequeño volumen de líquido/sustancia sobre el filtro (en este caso haciendo pasar un volumen de extracto de carne a pH 9.0). Gracias a esto las proteínas que constituyen el extracto compiten con los virus por los sitios de unión, además el pH 9.0 proporciona carga positiva a los virus, separándose éstos del filtro y se logra romper las fuerzas hidrofóbicas. A partir de aquí analizaremos la muestra mediante la técnica DAL.

>> Material y método:

- Filtros electronegativos (filtros de policarbonato de 0.45 mm de diámetro de poro).

- Filtros electronegativos tratados con polietilenimina (PEI) al 1% en agua destilada estéril.

- Muestra adicionada con una sal anticaotrópica (5% de una solución 1M de MgCl2).

- Medio PAC en sobrefusión.

- Agar blando.

- Agar Luria.

- Agar Luria suplementado con un 0.3% (p/v) de Tween-80 y 0.04% (p/v) de TTC.

- Solución al 13% de Cl2Ca -2H2O.

- Solución de extracto de carne al 3%, pH 9.

- Cultivo del hospedador bacteriano ( Escherichia coli).

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- Matraz.

- Placas de Petri.

- Pipetas.

El procedimiento a seguir es el que se describe a continuación:

- Filtración / adsorción: Realizaremos la técnica de SAL, para ello tomaremos los filtrados obtenidos al filtrar 100 ml. de la muestra por los distintos tratamientos (filtro y muestra sin tratar, filtro tratado con PEI al 1% en agua destilada estéril durante 2 horas y muestra adicionada con una solución 5% de otra solución de 1M de Cl2Mg). Los volúmenes filtrados los introduciremos en un recipiente estéril, y adicionaremos 1 ml. de una solución al 13% de Cl2Ca - 2H2O a 100 ml. de filtrado. Inocularemos la muestra con 5 ml. del cultivo del hospedador bacteriano. Mezclamos bien e incubamos 3 minutos a 45ºC. Adicionamos dicha mezcla a un matraz que contiene 100 ml. del medio PAC en sobrefusión. A continuación se mezcla y se reparte el medio en placas estériles de 14 mm. de diámetro y dejamos solidificar. La incubación será a 37ºC durante 18-24h.

- Elución / VIRADEL: pasamos por los mismos filtros utilizados en el apartado anterior 3-5 ml. de extracto de carne a pH 9.0 y analizamos ese filtrado por la técnica DAL. Para ello tomaremos 1 ml. de cada muestra de filtrado obtenida tras cada uno de los tratamientos que inocularemos junto con 0.2 ml. de cultivo en caldo de hospedador bacteriano en un tubo de agar blando. La mezcla la vertemos en una placa de Petri con agar Luria como base. Una vez solidificada la doble capa dejamos incubando de 18 a 24 horas a 37ºC.

- Elución / filtración simple: los filtros utilizados en los distintos tratamientos de adsorción, especificados en el proceso de adsorción, se dispondrán al revés sobre placas de agar Luria suplementado con Tween-80 (detergente que rompe las interacciones hidrofóbicas) y TTC (compuesto que favorece la visualización de las placas de lisis). Se siembra por la técnica DAL y se incuba a 37ºC durante un periodo de 18 horas.

Tendremos controles negativos para cada uno de los ensayos en los cuales la muestra no ha sido sometida a ningún tratamiento, pero sí filtrada. A la vez también sembraremos el filtrado de 100 ml. de la muestra con la técnica SAL, y de 10 ml. con la DAL. Estas placas nos darán el número total de partículas víricas presentes en la muestra.

>> Resultados y discusión:

Transcurrido el correspondiente tiempo de incubación pasaremos a hacer un recuento del número de placas de lisis formadas tras cada uno de los tratamientos:

  Filtrado Filtrado simple VIRADEL

Filtro y muestra sin tratar 188 ufp/100 ml 15 ufp / 100 ml 34 · 4 ufp / 100 ml

Filtro - PEI 12 ufp / 100 ml 50 ufp / 100 ml 95 · 4 ufp / 100 ml

Muestra con Cl2MG 0 ufp / 100 ml 30 ufp / 100 ml 62 · 4 ufp / 100 ml

SAL muestra (100 ml): 422 ufp/100ml.

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DAL muestra: 4 ufp/ml - 2 ufp/ml - 6 ufp/ml.

El porcentaje de recuperación fágica es el número de partículas fágicas que han eluido (tanto en el caso de la filtración simple como en el del VIRADEL) respecto al total de partículas fágicas de la muestra (que corresponde al SAL aplicado a la muestra directamente). Estos son los resultados:

- filtro y muestra sin tratar: 3.5% en filtración simple y 32.2% en VIRADEL.

- filtro-PEI: 11.8% en filtración simple y 90.0% en VIRADEL.

- muestra-Cl2Mg: 7.1% en filtración simple y 58.7% en VIRADEL.

Porcentaje de adsorción: Si restamos el número total de placas de lisis presentes en la muestra menos el número de placas de lisis obtenidos tras la filtración, tendremos el número de virus adsorbidos. De ahí sacaremos el porcentaje de adsorción, tomando como 100% el número de virus en la muestra (el dato que debemos tomar es el obtenido con la técnica de DAL, ya que el de SAL es un error experimental). Los resultados son los siguientes:

- 55% en filtro sin tratar.

- 97.1% en filtro-PEI.

- 100% en muestra-Cl2Mg.

Porcentaje de elución: se obtienen los porcentajes de elución de cada uno de los tratamientos considerando como 100% el número de placas de lisis obtenidos en la muestra. El porcentaje de elución es igual a los fagos eluídos respecto a los virus adsorbidos. Aqui se ofrecen los resultados:

- filtro y muestra sin tratar: 6.4% en filtración simple y 58.1% en VIRADEL.

- filtro-PEI: 12.2% en filtración simple y 92.7% en VIRADEL.

- muestra-Cl2Mg: 7.1% en filtración simple y 58.7% en VIRADEL.

Los datos nos muestran como el filtro tratado con PEI es el mejor método de concentración y recuperación de, en este caso, bacteriófagos T6 de Escherichia coli. Estos valores de recuperación son especialmente altos cuando se emplea la técnica re recuperación de partículas víricas VIRADEL.

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Práctica 4: Lisogenia e inducción al ciclo lítico.

>> Introducción:

El objetivo de esta práctica es comprobar la inmunidad de una bacteria lisogénica a la infección por bacteriófagos similares al profago que tiene integrado (del mismo grupo de incompatibilidad), pero no a otros fagos. Aunque una bacteria lisógena puede ser susceptible de infectarse por otros virus, no puede ser infectada por partículas virales del tipo para el cual ésta es lisógena. Esta inmunidad es conferida

Page 14: Prácticas de Virología

gracias al mecanismo de represión intracelular que está bajo el control de los genes del virus. Como cepa lisogénica se utilizará Salmonella LT2, que contiene el profago P22. También utilizaremos una suspensión del fago m2 (específico de Salmonella pero de distinto grupo de incompatibilidad que el P22), con el que si tendremos lisis.

Tambien demostraremos la inducción del ciclo lítico de esa misma cepa lisogénica por exposición a la luz UV (15, 30 y 60 segundos). En la inducción el virus abandona el genoma bacteriano y comienza el ciclo lítico (esto lo hace de forma espontánea o inducido por agentes físicos o químicos como radiación ultravioleta, mostaza nitrogenada, rayos X, etc...). Tras la incubación la presencia o ausencia de placas de lisis nos indicará la inducción, o no, de la cepa lisogénica; es decir, si se producen placas de lisis significa que la radiación ha inducido en el profago el inicio del ciclo lítico.

>> Material y método:

Para la inducción del ciclo lítico en bacterias lisogénicas el material es el siguiente:

- Cultivo en caldo de Salmonella LT2.

- Agar Luria.

- Agar blando.

- Lámparas U.V.

- Pipetas.

Prepararemos tres placas con césped de Salmonella según la técnica de la doble capa. Expondremos las placas a radiación de U.V. a distintos tiempos: 15, 30 y 60 segundos. Una vez dada la radiación dejaremos incubar a 37ºC durante 24h. Tras la incubación observaremos las placas y podremos calcular el tiempo mínimo de inducción (tiempo de exposición que ha de transcurrir para que se ponga de manifiesto la presencia de placas de lisis).

Para la parte de la práctica consistente en comprobar la inmunidad de una bacteria lisogénica a la infección por bacteriófagos similares al profago que tiene integrado el material es el siguiente:

- Suspensión de bacteriófago P22.

- Cultivo en caldo de Salmonella LT2.

- Agar Luria.

- Agar blando.

- Pipetas.

Haremos uso de la técnica de la doble capa (DAL), con ella haremos dos ensayos: uno en el que inocularemos el agar blando con 0.2 ml.de Salmonella LT2 y 1 ml. del bacteriófago P22 (bacteriófago que nuestra bacteria tiene ya integrado en su genoma) y un segundo ensayo en el que el bacteriófago inoculado sea el m2.

Page 15: Prácticas de Virología

>> Resultados y discusión:

Se observa que aparecen calvas de lisis en la placa expuesta a 60 segundos a luz U.V. (en concreto12 calvas). Si hicieramos exposiciones superiores observaríamos un aumento del número de placas de lisis a mayor tiempo de exposición a la radiación ultravioleta (inducción del ciclo lítico del fago en lisogenia): a mayor tiempo de exposición a la radiación, mayor número de fagos que inician crecimiento lítico.

En cuanto a la parte de inmunidad, vemos que con el bacteriófago P22 no aparecen calvas de lisis, debido a que Salmonella es inmune a él ya que lo presenta integrado en su genoma, pero en cambio si es susceptible a la infección por el fago m2, provocando la aparición de placas de lisis.

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Práctica 5: Fagotipia de Salmonella.

>> Introducción:

La fagotipia es un método de tipificación bacteriana que permite realizar una diferenciación intraespecífica en base a la especificidad de infección por bacteriófagos. El patrón de susceptibilidad de una cepa bacteriana a un conjunto determinado de bacteriófagos es lo que se denomina fagotipo.

Para realizar el fagotipado de una cepa bacteriana se utiliza la prueba de la gota de Adams. La sensibilidad de una cepa bacteriana a un determinado fago se demuestra por la aparición de un área de lisis que puede variar desde placas aisladas o lisis semiconfluente (placas de lisis individualizadas) a lisis confluente (una zona grande de lisis). Esta técnica se utiliza mucho para el estudio de brotes alimentarios.

En esta práctica utilizaremos un set de tipado constituído por 5 fagos, específicos de Salmonella enterica:

Cepa propagadora Fago

S. ohio 1079M 7

S. london 4F 11

S. typhi 1448M 17

S. typhi 1448M 18

S. enteritidis 7F 21

Antes de realizar el fagotipado, hay que calcular la dilución rutinaria de prueba (RTD o Rutinary Test Dilution) de cada uno de los fagos del esquema de tipado. La RTD se define como la máxima dilución de un determinado stock fágico que en la prueba de la gota produce lisis, confluente o semiconfluente sobre la capa de propagación, siendo la cepa propagadora la que se utilizó en el aislamiento del bacteriófago. Este cálculo nos sirve para estandarizar el resultado ya que no es igual el número de bacteriófagos que hay en cada suspensión de muestra.

Page 16: Prácticas de Virología

Para identificar los fagotipos, suelen asignárseles códigos alfanuméricos (regla de Farmer et al., 1970, modificada por Castro et al., 1992):

Triplete Dígito asignado Fago Dígito asignado

+ + + 1 + + A

+ + - 2 + - B

+ - + 3 - + C

- + + 4 - - D

+ - - 5    

- + - 6    

- - + 7    

- - - 0    

El objetivo de esta práctica es determinar el patrón de sensibilidad o resistencia a una serie de bacteriófagos de Salmonella, mediante la prueba de la gota de Adams. Obtendremos el fagotipo, diferenciación intraespecífica, de cada una de las cepas de Salmonella.

>> Material y método:

- Cultivo en caldo del hospedador bacteriano (Salmonella).

- Agar Luria.

- Agar blando.

- Solución salina.

- Pipetas.

- Asa de platino.

Se siembra sobre agar la bacteria a fagotipar haciendo un cesped homogeneo por la técnica de la doble capa (con agar blando que permita la dispersión de partículas víricas). Se añaden gotas de las 5 suspensiones fágicas y despues de la incubación vemos si la bacteria es infectada o no por cada una de las gotas.

Hay que utilizar los bacteriófagos con la misma concentración. La manera de estandarizar es poniendo a todos los fagos a un mismo nivel de infectividad. Primero tenemos que calcular la RTD (infección rutinaria de prueba). Para ello realizaremos una batería de diluciones de nuestros fagos (7,11,17,18,21), de la 10-2 a la 10-6. Prepararemos un césped bacteriano según la técnica de la doble capa de agar con 0.2 ml. del cultivo de la bacteria hospedadora ( Salmonella); haremos tantas placas como fagos tenemos, es decir, 5 placas. Una vez solidificadas añadiremos, con la ayuda del asa de platino, una gota de cada dilución del fago correspondiente más una gota de la muestra sin diluir como control. El proceso de incubación es de 24h a 37ºC. Transcurrido este tiempo observaremos las placas de lisis formadas en las distintas diluciones, anotando la máxima dilución donde se produce lisis siendo ésta la RTD.

Page 17: Prácticas de Virología

Una vez sabida la RTD sabemos que dilución de cada fago tenemos que utilizar: añadiremos 0.2ml de Salmonella a un tubo de agar blando y lo vertemos en una placa con una capa soporte de agar Luria. Dejamos solidificar y con el asa de platino vamos poniendo cada una de las gotas que corresponden a las diluciones respectivas de cada fago (diluciones calculadas por la RTD). Incubamos de nuevo a 37ºC durante 24 h. y dejando que se desarrolle un césped bacteriano más placas de lisis.

>> Resultados y discusión:

Estos son las medias de los diferentes grupos de prácticas de todos los datos que obtuvimos cuando calculamos la RTD para los distintos fagos:

Fago 7 11 17 18 21

RTD 10-3 10-2 10-5 10-3 10-4

Una vez hecha la prueba de la gota de Adams estos fueron los resultados (el + simboliza la formación de placas de lisis, y el símbolo - indica la no evidencia de infección por parte del fago):

Grupo 7 11 17 18 21 Fagotipos

A1 - + - - - 6D

A2 - - + + + 7A

A3 - - + + + 7A

A4 - - + + + 7A

A5 - - + + + 7A

A6 - - + + + 7A

A7 - - + + + 7A

A8 - - + + + 7A

A9 - - + + + 7A

A10 - - + + + 7A

A11 - - + + - 7B

A12 - + - - - 6D

A13 - - + + - 7B

A14 - - + + - 7B

A15 - - + + - 7B

Este tipo de pruebas permite hacer una historia epidemiológica del origen de la infección atendiendo a la fagotipia obtenida (origen de las cepas: misma cepa y serotipo). Por ejemplo, y usando estos datos, si se aisló un brote de origen alimentario y se analizaron a dos personas del restaurante (A3 como manipulador nº1 y A11 como manipulador nº2) y a diversos alimentos (A1 como carne, A2 como mayonesa y A12 como salsa) podríamos concluir que fue el manipulador nº1 el que provocó dicha infección, al corresponderse la fagotipia de las muestras del manipulador nº1 con la de la mayonesa (y no corresponderse en absoluto las fagotipias del resto de alimentos con ninguno de los dos manipuladores).

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Page 18: Prácticas de Virología

Medios de cultivo.

>> Solución salina

- 0.85% (p/v) NaClpH 7.2

>> Caldo triptona soja (TSB)

- Peptona de caseína 17 g- Peptona de soja 3 g- Cloruro sódico 5 g- Fosfato dipotásico 2.5 g- Glucosa 2.5 g- Agua destilada 1000 mlpH 7.3 ± 0.2 a 25ºC

>> Agar Luria

- Triptona 10 g- Extracto de levadura 5 g- Cloruro sódico 5 g- Sulfato magnésico heptahidrato 0.125 g- Agar 15 g- Agua destilada 1000 mlpH 7.2

Tras esterilizar (121ºc,15min), enfriar aproximadamente a 50ºC y añadir 10ml/l de una solución al 5% de Cl2Ca-2H2O estéril.

>> Agar blando

- Triptona 10 g- Cloruro sódico 5 g- Sulfato magnésico heptahidrato 0.12 g- Agar 8 g- Agua destilada 1000 mlpH 7.2

>> Agar mFC (Difco)

Composición por litro de medio:- Triptosa 10 g- Proteosa peptona No.3 5 g- Extracto de levadura 3 g- Lactosa 12.5 g- Sales biliares No.3 1.5 g- NaCl 5 g

Page 19: Prácticas de Virología

- Azul de anilina 0.1 g- Agar 15 g- Agua destilada 1000 mlpH 7.4 ± 0.2 a 25ºC

>> Medio PAB (Phage Assay Broth)

- Extracto de carne 3 g- Peptona 5 g- ClNa 5 g- Sulfato magnésico heptahidrato 0.2 g- Sulfato manganésico 0.05 g- Agua destilada 1000 mlpH 7.2

Tras esterilizar (121ºC, 15min) y enfriar, añadir 1ml/l de una solución al 3% de Cl2Ca-2H2O estéril.

>> Medio PAC (Phage Agar Concentrate)

- Extracto de carne 14 g- Extracto de levadura 4 g- Cloruro sódico 4 g- Peptona 12 g- Carbonato sódico 1 g- Cloruro magnésico hexahidrato 1 g- Agar 12 g- Agua destilada 1000mlpH 7.2

 

Indice NMP y límites de confianza del 95% para combinaciones de resultados positivos empleando series de 3 tubos por dilución (10 ml, 1 ml, 0,1 ml).

Combinación de positivos

NMP / 100 ml

Límite superior de confianza (95%)

Límite inferior de confianza (95%)

0-0-0 < 3    

0-0-1 3 < 0.5 9

0-1-0 3 < 0.5 13

0-2-0 -    

       

1-0-0 4 < 0.5 20

1-0-1 7 1 21

1-1-0 7 1 23

1-1-1 11 3 36

1-2-0 11 3 36

Page 20: Prácticas de Virología

       

2-0-0 9 1 36

2-0-1 14 3 37

2-1-0 15 3 44

2-1-1 20 7 89

2-2-0 21 4 47

2-2-1 28 10 150

2-3-0 -    

       

3-0-0 23 4 120

3-0-1 39 7 130

3-0-2 64 15 380

3-1-0 43 7 210

3-1-1 75 14 230

3-1-2 120 30 380

       

3-2-0 93 15 380

3-2-1 150 30 440

3-2-2 210 35 470

3-3-0 240 36 1300

3-3-1 460 71 2400

3-3-2 1100 150 4800

3-3-3 ³ 2400    

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© 1999 - Manuel B. A.