Fundamentos de Microbiologa Predictiva: aplicaciones tericas y prcticas Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D. CdigoFMP V. 01 Pgina1 de 11 Universidad de Pamplona Facultad de Ciencias Bsicas Departamento de Microbiologa 2013 DESARROLLO DE UN MODELO DE RELACION ENTRE DENSIDAD OPTICA (MTODO TURBIDIMTRICO) VS RECUENTO EN PLACA. 1.1. OBJETIVOS Los objetivos que se buscan con esta prctica son: Diferenciarentrelosdistintostiposdemtodosderecuentobacterianoydiscernirculde ellos emplear bajo diversas situaciones. Comprenderlosfundamentosquerigenlosdiversosmtodosinstrumentalesderecuento microbiano. Construirunacurvaderelacinparalamedidaindirectadelcrecimientodiversas bacterias (E. coli, S. aureus, Salmonella spp., etc.) para futuras prcticas. Ahorrarmaterialdelaboratorio,tiempodetrabajo,etc.,eneldesarrollodelasfuturas actividades relacionadas a la asignatura de Microbiologa predictiva. Obtenerecuacionesdeprimerordenparalaprediccindelcrecimientodeestasbacterias dependiente de la poblacin inicial a temperatura constante. 1.2. MARCO TERICO El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser entendido desde perspectivas diferentes y de acuerdoastassepuedellegaradeterminarlamedidadelcrecimientomediantediversas metodologas. Para algunos, el crecimiento esla capacidad que tienen las clulas individuales para multiplicarse,estoesiniciarycompletarunadivisincelular.Deestaforma,seconsideraalos microorganismoscomopartculasdiscretasyelcrecimientoesentendidocomounaumentoenel nmerototaldepartculasbacterianas.Existenvariasformasdedeterminarelnmerototalde microorganismos en una muestra: Determinacin del nmero de microorganismos, Determinacin de la masa celular, y Determinacin de la actividad celular. Independientemente de los mtodos empleados para el conteo bacteriano estos se pueden agrupar endosmodalidadesclaramentedefinidas,aspuestendramoslosmtodosderecuentodirectoo cuantitativos(comosunombreloindicanospermitecontardirectamenteelnmerodeclulas)y aquellos indirectos o cualitativos, que a travs de la determinacin de diversos factores nos permite correlacionarlamedidadelosmismosconunnmerodebacterias.Enlaprcticahabitualdel laboratorio,losensayosserealizansiempreconpoblacionesbacterianas,amenudotomando muestrasendiversosmomentosdesucrecimientoenunmediodecultivo.Enelrestodelmanual nos vamos a referir al crecimiento microbiano a escala de poblaciones. Comenzaremos con describir algunosmtodoshabitualesdemediresecrecimientopoblacional,algunosdeloscualessern reforzados por el alumno en las siguientes prcticas de laboratorio. Fundamentos de Microbiologa Predictiva: aplicaciones tericas y prcticas Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D. CdigoFMP V. 01 Pgina2 de 11 Universidad de Pamplona Facultad de Ciencias Bsicas Departamento de Microbiologa 2013 El crecimiento de una poblacin o cultivo bacteriano se puede expresar en funcin de: Aumento del nmero de clulas (microorganismos). Aumento de masa del cultivo (masa celular). Aumento de la actividad celular. Estostiposdeexpresionessonequivalentesentresencultivosqueestnencrecimiento balanceadooequilibrado(enelquetodosloscomponentesaumentanunamismaproporcinpor unidaddetiempo).Encultivoscerrados(discontinuosonoequilibrados)estasexpresionesde crecimientosoncoincidentesdurantealgnperiodoperotranscurridoeltiempo,dejandeser equivalentes, por ejemplo la masa celular y la actividad celular. Lamedidadelcrecimientobacterianopuedemedirsetambinmediantedostiposdemtodos: directos(loscualesrequierenpreparacioneslimpias,sinpartculasextraas)eindirectos.Ahora bien, hagamos una descripcin de cada uno de ellos: 1.2.1.DETERMINACIN DEL NMERO DE MICROORGANISMOS Estos mtodos pueden ser indirectos como el Recuento en placa ya sea en superficie o incorporado, MtododelasdilucionesmltiplesodelNmeroMsProbable,Filtracinpormembranae incubacin de sta sobre medio de cultivo slido, o mtodos directos como Recuento microscpico directodelosmicroorganismos,yaseaenfrotisoencmaras,Conteoalmicroscopiode membranas, Conteo electrnico de partculas (tipo Coulter), Recuento proporcional de Wright. 1.2.2.DETERMINACIN DE LA MASA CELULAR El crecimiento de una poblacin bacteriana pueden determinarse por medio de mtodos directos de conteodelapoblacin:medidadelpesoseco,medidadelpesohmedo,medidadelvolumen, determinacin del contenido de N, etc., o bien por mtodos indirectos como turbidimetra (escala de McFarland y espectrofotometra) y Nefelometra. 1.2.3.DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD CELULAR Estetipodeconteonospermiteentreotrosladeterminacindeunaactividadenzimtica, determinacindeunmetabolito,medidadelconsumodeoxgeno,medidadeATP,calorimetra, medidadeimpedancia,radiometra(deC02).Alosefectosdellevaracabocualquiertcnicade recuento,hayquetenerencuentaeltipodemuestrasobrelaquesevaatrabajar,porcuantoes posiblequealgunosdelosmtodosnoseanaplicables.Cuandoesnecesariollevaracabo Fundamentos de Microbiologa Predictiva: aplicaciones tericas y prcticas Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D. CdigoFMP V. 01 Pgina3 de 11 Universidad de Pamplona Facultad de Ciencias Bsicas Departamento de Microbiologa 2013 diluciones, la toma y preparacin de la muestra se realiza de la manera comn. En las descripciones que siguen se denominar homogeneizado a la muestra preparada para su anlisis microbiolgico. Losprimerosincluyennormalmenteelrecuentoenplaca(muchotrabajo,costos,tiempo)oconteo directoalmicroscopio(cmaradeNeubauer),mientraslossegundoscuantificanindirectamentela poblacin a travs de diferentes mtodos: Mtodos elctricos: impedancia, conductancia. Mtodos turbidimtricos pticos: Escala de McFarland. Mtodos turbidimtricos instrumentales: Absorbancia, Tramitancia. Citometra de flujo Otros. 1.2.4.MTODOS TURBIDIMTRICOS INSTRUMENTALES Lamedicin delcrecimientopor mtodosturbidimtricosresultaser msrpidoytil, para obtener una estimacin del nmero de clulas o biomasa. Una suspensin celular aparece turbia porque las clulas dispersan la luz que atraviesa la suspensin. Cuantas ms clulas haya ms luz se dispersa ymsturbiaaparecelasuspensin.Laturbidezpuedemedirseconunfotmetrooun espectrofotmetro, aparatos que hacen pasar la luz a travs de una suspensin celular y detectan la cantidad de luz no dispersada. La mayor diferencia entre estos dos instrumentos es que el fotmetro emplea un filtro simple(normalmente rojo, verde o azul) para generar luz incidente de una amplitud deondarelativamenteancha,mientrasqueelespectrofotmetroempleaunprismaoredde difraccinparagenerarluzincidentedebandaestrecha.Sinembargo,ambosaparatosmiden solamenteluznodispersadaexpresandolosresultadosenunidadesfotomtricas(porejemplo, Unidades Klett) o unidades de densidad ptica (DO) para espectrofotmetro. Paraorganismosunicelulares,lasunidadesfotomtricasDOsonproporcionales(dentrodeciertos lmites) a la masa celular y tambin al nmero de clulas. Por tanto las medidas de turbidez pueden utilizarsecomounsustitutoparaotrosmtodosdecontaje.Sinembargoyantesdeutilizarla turbidezcomomtododecontaje,hayquerealizarunacurvaestndarquerelacionemedidas directas(microscpicasoporrecuentoenplaca)conlasunidadesindirectasdeturbidez(DO) (Francoisetal.,2007).Talescurvascontienendatosparanmerodeclulasymasacelular, permitiendo la estimacin de ambos parmetros a partir de una sola medida de la turbidez. Aelevadasconcentracionesdeclulas,laluzdispersadadelaunidaddetectorapuedeser rescatada por otra (apareciendo a la fotoclula como si nunca se hubiese dispersado). Cuando esto ocurre,lacorrespondenciaunoaunoentrenmerodeclulasyturbidezpierdelinealidad.Sin embargo,dentrodeciertoslmites,lasmedidasdeturbidezpuedenser razonablemente precisas y ademstienenlavirtud de ser rpidasyfcilesdetomar.Adicionalmente,lasmedidas deturbidez Fundamentos de Microbiologa Predictiva: aplicaciones tericas y prcticas Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D. CdigoFMP V. 01 Pgina4 de 11 Universidad de Pamplona Facultad de Ciencias Bsicas Departamento de Microbiologa 2013 pueden tomarse sin distorsionar mucho las muestras. Por estas razones, las medidas de turbidez se empleanampliamenteparaseguirelcrecimientodeloscultivosmicrobianos;sepuedemedir repetidamentelamismamuestrayconstruirgrficossemilogartmicosparacalculartiemposde generacin. La poblacin bacteriana puede determinarse midiendo la turbidez del cultivo a diferentes intervalosdetiempoyconfrontandoestosresultadosconmedidasdirectasdelapoblacinalos mismos intervalos de tiempo por ejemplo mediante recuento directo en placa. El cambio de luz se registra en el espectrofotmetro como porcentaje de transmisin (cantidad de luz transmitida)yabsorbanciaodensidadptica(D.O.),valorderivadodelporcentajedetransmisin, correspondiente al log del cociente entre la intensidad de luz incidente sobre la suspensin (Io) y la de la luz transmitida por la suspensin (I). A = log Io/I. Cuandoseinoculaunapequeapoblacinbacterianaenunmediodecultivolquidoadecuado, generalmente el crecimiento no comienza inmediatamente, sino que hay un perodo de latencia. Una vez que empieza el crecimiento, se observa un incremento exponencial en la densidad celular, que correspondealafaseexponencialdecrecimiento.Estafaseeslamssignificativaenelciclode crecimiento de los microorganismos y se caracteriza porque los parmetros cinticos del crecimiento (,k)semantienenconstantes.Amedidaqueelcrecimientoavanza,laconcentracindelos nutrientes esenciales disminuye, y se acumulan los productos finales del metabolismo, hasta que el crecimiento llega a detenerse, de modo que el cultivo entra en fase estacionaria. Despus las clulas lentamente se mueren, lisndose en algunos casos, en una ltima fase de muerte celular (Fig. 1.1). Figura 1.1. Representacin grfica de las fases de crecimiento bacteriano (Tomado de Labuza, 1994). Tomado de Schlessinger et al., 1994. Fundamentos de Microbiologa Predictiva: aplicaciones tericas y prcticas Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D. CdigoFMP V. 01 Pgina5 de 11 Universidad de Pamplona Facultad de Ciencias Bsicas Departamento de Microbiologa 2013 1.3. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS 2 frascos Erlenmeyer con 99 mL de caldo CASO. 48 tubos de ensayo con 9 mL de agua peptona. 64 Pipetas estriles de 1 mL. 16 Pipetas estriles de 10 mL. 96 cajas de petri estriles 1920 ml de agar CASO. 12 tubos de ensayo estriles. Incubadora de 35C +/- 2C Espectrofotmetro calibrado a 600 nm. Celdas plsticas para espectrofotometra. 1.4. REACTIVOS Patrn de McFarland 5 (0,5 ml de BaCl2 al 1,175% + 9,5 ml de H2SO4 al 1%) (Ver anexo 1.1 y 1.2, preparacin y control de calidad del estndar de McFarland). 1.5. PROCEDIMIENTO 1.5.1.Cultivos SeusarauncultivopuroenfaseexponencialdeSalmonellaenteritidisvarenteritidismantenidoa 37C durante 18 horas en caldo CASO (Oxoid Ltd., Basingstoke, UK). 1.5.2.Preparacin del inoculo, mantenimiento del cultivo y medida directa del crecimiento:1.A partir de un cultivo bacteriano (en fase exponencial) preparar una suspensin inicial (Patrn 1P1)delacepaseleccionadayajustarlaaunaturbidezcorrespondientealpatrn McFarland0,5,elcualequivaleaproximadamentea1,5x108bacterias/ml(ICONTEC,2000). De este cultivopreparar unadilucin 1:10 (Patrn 2 P2) inoculando 1 ml de P1 en un tubo conteniendo 9 ml de caldo CASO (poblacin final equivalente a 1,5x107 bacterias/ml). 2.ApartirdeP2prepararcincodiluciones1:10encaldoCASOparaobtenerlospatronesP3, P4, P5 y P6 con unas poblaciones aproximadas a 1,5x106 bacterias/ml; 1,5x105 bacterias/ml; 1,5x104 bacterias/ml; 1,5x103 bacterias/ml, respectivamente. 3.Apartirdecadapatrnpreparardilucionesdecimales(1:10)consecutivasenaguapeptona estrildetalformaquelapoblacintericafinalseade1,5x102bacterias/ml,segnel esquemaanexoalfinaldelagua(veranexo1.3).Delaltimadilucinsembraren profundidadyporduplicado0,1mlparacadapatrn.Deladilucinanteriorsembraren Fundamentos de Microbiologa Predictiva: aplicaciones tericas y prcticas Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D. CdigoFMP V. 01 Pgina6 de 11 Universidad de Pamplona Facultad de Ciencias Bsicas Departamento de Microbiologa 2013 profundidadyporduplicado1mldecadapatrn.Adicionar15mLdeagarCASOy homogenizar las cajas, llevando a incubar la totalidad de las cajas a una temperatura de 35C 2C por 24 48 horas. 4.Al finalizar el tiempo de incubacin, realizar los clculos de la poblacin as:

Deestaformasecalculalapoblacinenufc/mLequivalentesalpatrn1,lacualser correlacionada con el valor inicial de la curva obtenida por espectrofotometra. 5.Apartirdecadapatrn(P1,P2,P3,P4, P5,P6)determineelvalordelaabsorbanciaa600 nm,deestaformaobtendremoselequivalenteenAbparacadapatrn,lacualser correlacionada con el recuento en placa profunda para cada patrn. 6.Con ayuda de Excel obtener una grfica de dispersin donde ubicaremos en el eje X el valor delaabsorbanciayenelejeYelLog10delapoblacin.Posteriormenteusandoregresin lineal, agregar la lnea de tendencia que mejor ajuste tenga segn el coeficiente de regresin (R2) y obtener el valor de la ecuacin. 7.Estaecuacinservalidadaenlaprcticaposteriorysiesfiableseusaraparafuturos clculosdepoblacin.Solobastaconprepararelinoculoinicialdelmicroorganismo(en nuestrocasoSalmonellaenteritidisvarenteritidis)medirlaabsorbanciayreemplazareste valorenlavariableXdelaecuacin.Deestaformaobtendremoselvaloraproximadodela poblacin en ufc/ml. 1.6. RESULTADOS ConstruirlacurvaexperimentaldeabsorbanciavsLnNempleandolosdatosrecogidosenla siguiente tabla 1.1: Tabla 1.1. Tabla de resultados de la actividad prctica 1. Patrn (dilucin del patrn) Poblacin terica (cel/ml) Absorbancia media (600 nm) Media Poblacin (ufc/ml) Poblacin real (Ln ufc/ml) 1 (100)1,5x108 2 (10-1)1,5x107 3 (10-2)1,5x106 4 (10-3)1,5x105 Fundamentos de Microbiologa Predictiva: aplicaciones tericas y prcticas Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D. CdigoFMP V. 01 Pgina7 de 11 Universidad de Pamplona Facultad de Ciencias Bsicas Departamento de Microbiologa 2013 5 (10-4)1,5x104 6 (10-5)1,5x103 Ajustar la curva a lafuncin ms adecuada (lineal, exponencial, logartmica o polinmica). Calcular la ecuacin de prediccin y corregir hasta obtener un R2 > 0,98. Trabajar con un mnimo de 4 valores dereferencia.Laecuacinasobtenidaserlaqueseemplearparalosclculosdelapoblacin final a diferentes intervalos de tiempo en las prcticas siguientes. 1.7. NIVEL DE RIESGO Para el desarrollo de la presente prctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya que semanejaranmicroorganismosconsideradosoportunistasyqueenalgnmomentopormalas prcticasdelaboratoriopuedenconllevaralgnpeligroparalosmanipuladores.Portanto,todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deber usar los siguientes equipamientos: Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo, Pantaln Largo. 1.8. BIBLIOGRAFA Schlessinger,D.,Schaechter,M.,Eisenstein,B.I.(1994).Biologadelosagentesinfecciosos, captulo3.En:Microbiologa.Mecanismosdelasenfermedadesinfecciosas,enfoque mediantelaresolucindeproblemas.2daedicin.Editores:Schaechter,M.,Medoff,G., Eisenstein,B.I.,Guerra,H.EditorialMdicaPanamericana,S.A.Buenosaires.Argentina. Pgs. 47 76. http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/cholera/ch9.pdf. Fernndez, C.M., Gonzlez, M., Illnait, M.T., Martnez, G. (1998). Determinacin de la concentracin mnima inhibitoria de Anfotericina B en levaduras de inters mdico. Rev Cubana Med Trop., 50(1): 48-53. Francois, A., Valero, A., Geeraerd, A.H., Van Impe, J.F., Debevere, J., Garca-Gimeno, R.M., Zurera, G.,Devlieghere,F.(2007).EffectofpreincubationtemperatureandpHontheindividualcell lagphaseofListeriamonocytogenes,culturedatrefrigerationtemperatures.FoodMicrobiol., 24: 32 43. ICONTEC.InstitutoColombianodeNormasTcnicasyCertificacin.(2000).NTC2455. Desinfectantes.Limpiadoreslquidos.Desinfectantesparausodomstico.Tercera actualizacin. 25-10-2000. Fundamentos de Microbiologa Predictiva: aplicaciones tericas y prcticas Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D. CdigoFMP V. 01 Pgina8 de 11 Universidad de Pamplona Facultad de Ciencias Bsicas Departamento de Microbiologa 2013 Madigan,M.T.,Martinko,J.M.,Parker,J.(2001).Crecimientomicrobiano,Captulo5.En:Brock BiologadelosMicroorganismos.8edicinrevisada.EditorialPrenticeHallIberia,Madrid, Espaa. ISBN: 84-89660-36-0. 4 reimpresin. Pgs. 155 157. Willett, H.P. (1997). Fisiologa del Crecimiento Bacteriano, Captulo 5. En: Zinsser, Microbiologa. 20 edicin.Editores:Joklik,W.K.,Willett,H.P.,Amos,D.B.,Wilfert,C.M.EditorialMdica Panamericana, S.A.Buenos Aires.Argentina. Pgs. 78 109. ANEXOS ANEXO 1.1. Escala de McFarland Fundamento:ElpatrnolaescaladeMcFarlandconsisteenunaseriedetuboshermticamente cerrados,previamentecalibradosycon unadensidadpticadiferenteoriginada por laaparicin de un precipitado de sulfato de bario (SO4Ba) resultante de la reaccin entre el cloruro de bario (Cl2Ba) al1,175%(0,048M)yelcidosulfrico(H2SO4)al1%(0,36N).Estaturbidezpuedeinterpretarse pticamenteopormtodosespectrofotomtricosycadaunadeellassecorrespondeauna concentracinconocidadebacterias/ml.Paracadacepabacterianahayqueestablecerla equivalenciaentrelaturbidezdecadatuboylamasaolaconcentracindebacterias(cel/ml)que genera una turbidez similar. Inconveniente: Es un mtodo poco preciso, que solo se emplea cuando no hace falta exactitud, ha sido desplazado por los mtodos espectrofotomtricos. Conservacin: El estndar de McFarland puede ser almacenado hasta por 6 meses en la oscuridad y a temperatura ambiente entre 22 a 25C. Sin embargo, se recomienda almacenarse a ser posibles en refrigeracin. Cuidados:Descartardespusde6mesesoantessisuvolumenesmenor.Antesdecadauso, debeagitarsemuybienusandounshaker,hastaqueelprecipitadoblancodesulfatodebariose haya disuelto en todo el medio. Para asegurar la densidad del estndar de McFarland as preparado puedeserchequeadousandounespectrofotmetroconunaceldadecuarzode1-cm;parael estndar 0,5 de McFarland, la absorbancia a una longitud de onda de 625 nm puede estar entre 0,08 a 0,1. Alternativamente, el aseguramiento del estndar de McFarland puede ser verificado por ajuste deunasuspensindeunacepacontrol(porejemplo,E.coliATCC25922)alamismaturbidez, preparando diluciones seriadas 1:10, y realizando el respectivo recuento en placa. La suspensin as ajustada puede tener un conteo de 1,5x108 ufc/ml. Fundamentos de Microbiologa Predictiva: aplicaciones tericas y prcticas Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D. CdigoFMP V. 01 Pgina9 de 11 Universidad de Pamplona Facultad de Ciencias Bsicas Departamento de Microbiologa 2013 Para levaduras el estndar 0,5 de McFarland es equivalente a una suspensin de 106 ufc/ml (Andreu et al., 1998). Preparacin:Seadicionancantidadescrecientes(odecrecientessegncorresponda)de BaCl2*2H2O al1,175%(p/v) enH2SO4 al1%(v/v)de acuerdoalasiguientetabla(Tabla1.2.) para obtener la equivalencia deseada: Tabla 1.2. Preparacin del estndar de McFarland. Escala de McFarland BaCl2*2H2O (0.048M)H2SO4 (0.36N)ml final[ ] celular 10,19,910,03 x 108 20,29,810,06 x 108 30,39,710,09 x 108 40,49,610,012 x 108 50,59,510,015 x 108 60,69,410,018 x 108 70,79,310,021 x 108 80,89,210,024 x 108 90,99,110,027 x 108 101,09,010,030 x 108 Fuente: ICONTEC, 2000. Los estndares de turbidez se preparan en tubos similares a los que se emplearan para preparar la suspensindelinoculo.Despus,eltubodebeserbientapadousandounataparoscacontefln, Parafilm,oalgnotromedioqueevitelaevaporacindelmismo.Estaescalade3x108a3x109 bacterias por ml es de gran utilidad en cuanto que, en la mayora de los experimentos, los conteos quedarn dentro de estos lmites, excepto en los casos de muy bajo crecimiento. Fundamentos de Microbiologa Predictiva: aplicaciones tericas y prcticas Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D. CdigoFMP V. 01 Pgina10 de 11 Universidad de Pamplona Facultad de Ciencias Bsicas Departamento de Microbiologa 2013 ANEXO 1.2. Procedimiento para la preparacin y control de calidad del estndar 0,5 de McFarland (Equivalente a 1,5x108 bact/ml) Fuente: Fernndez et al., 1998. Fundamentos de Microbiologa Predictiva: aplicaciones tericas y prcticas Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D. CdigoFMP V. 01 Pgina11 de 11 Universidad de Pamplona Facultad de Ciencias Bsicas Departamento de Microbiologa 2013 ANEXO 1.3.Esquema de trabajo curva de calibracin de poblacin por mtodo turbidimtrico y recuento en placa. LECTURA TURBIDIMTRICARECUENTO EN PLACA P7 PT = 102 PT =101 PT =102 Cultivo madre de E. coli / o S. aureus fluorescens PT =101 PT =102 PT =101 PT =102 PT =101 PT =102 PT =101 PT =102 PT =101 PT =102 P1 PT = 108 P2 PT = 107 P3 PT = 106 P4 PT = 105 P5 PT = 104 P6 PT = 103 1 ml 1 ml 0,1 ml 1 ml1 ml 1 ml 0,1 ml 1 ml1 ml1 ml 1 ml 0,1 ml 1 ml1 ml1 ml1 ml 1 ml 0,1 ml 1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml 1 ml 0,1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Medir Absorbancia a 600 nm 1 ml 1 ml 0,1 ml