Practica n°8: Determinación de E.coli y pruebas bioquímicas de identificación

bacteriana

INTEGRANTES:

Juan Reynaldo Ranilla Yanac

PROFESOR:

Prof. Martin Martínez

Objetivos

Reconocimiento e identificación de E.coli en muestras de carne molida Aplicar el método de número más probable Realizar la correcta interpretación para el recuento E.coli Aprender las pruebas bioquímicas para identificación de E.coli y otros tipos de enterococos

Introducción

Escherichia coli

La Escherichia coli también conocida por la abreviación de su nombre, E. coli, es quizás el organismo procariota más estudiado por el ser humano. Se trata de una enterobacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales, y por ende en las aguas negras, pero se lo puede encontrar en todos lados, dado que es un organismo ubicuo. Fue descrita por primera vez en 1885 por Theodore von Escherich, bacteriólogo alemán, quien la denominó Bacterium coli. Posteriormente la taxonomía le adjudicó el nombre de Escherichia coli, en honor a su descubridor.

Esta y otras bacterias son necesarias para el funcionamiento correcto del proceso digestivo, además de producir las vitaminas B y K. Es un bacilo que reacciona negativamente a la tinción de Gram (gramnegativo), es anaerobio facultativo, móvil por flagelos peritricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa y su prueba de IMVIC es ++.

Prueba de Indol:

es una prueba bioquímica realizada en especies bacterianas para determinar la habilidad del organismo de romper el indol del aminoácido triptófano. Esta división molecular es lograda por una serie de enzimas intracelulares diferentes, un sistema que en conjunto se le llama con frecuencia triptofanasa.

Se genera el indol por una desaminación reductiva del triptófano via la molécula intermediaria ácido indolpirúvico. Las triptofanasas catalizan la reacción de desaminación, durante el cual se remueve el grupo amino (NH2) de la molécula de triptófano. Los productos finales de la reacción son el indol, ácido pirúvico, amoníaco (NH3) y energía. Como coenzima de la reacción se requiere al fosfato de piridoxal.

Clasica para el caso de E.coli que es positivo. Las proteínas de este medio serán degradadas por la E.coli

Rojo de metilo:

El rojo de metilo es un indicador de pH. (Fórmula: C15H15N3O2). Actúa entre pH 4,2 y 6,3 variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo tanto, permite determinar la formación de ácidos que se producen durante la fermentación de un carbohidrato. El rojo de metilo se prepara con 0,1 g de este reactivo en 1500 ml de metanol. Una reacción positiva (más o menos) indica que el microorganismo realiza una fermentación acidoláctica de la glucosa por la vía ácido-mixta

Se usa caldo MRVP . a partir de la fermentación de la glucosa se produce acido que se mide con el rea

Caldo MR VP:

En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano y la glucosa es el hidrato de carbono fermentable.La glucosa puede ser metabolizada por los microorganismos, a través de distintas vías metabólicas. Según la vía utilizada, se originarán productos finales ácidos (ácido láctico, ácido acético, ácido fórmico), o productos finales neutros (acetil metil carbinol).Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podría ser reconocida por la adición de un indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de productos ácidos, y por la adición de alfa naftol e hidróxido de potasio para evidenciar la presencia de productos finales neutros. Voges y Proskauer, describieron una coloración rojiza que aparecía después de adicionar hidróxido de potasio a los cultivos de ciertos microorganismos en medio con glucosa. Esta coloración se debe a la oxidación del acetilmetil carbinol a diacetilo el cual reacciona con la peptona del medio para dar un color rojo.

Citrato de Simmons

En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad.El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa.

Materiales y equipos

Requisitos necesarios para la preparación y dilución de muestras de alimentos y suelos Incubadora 35 – 37 °c y baño maría 44.5 ± 0.2 °c Asas de siembra Los medios de cultivo y materiales para enumeración de coliformes fecales: caldo LST y caldo EX,

volumen 10 ml en tubos de fermentación (campanas dunhan) , de 75 x 10 Agar endo en placa Agar nutritivo en placa Agar nutritivo plano inclinado Caldo lactosado. 8 ml de medio en tubos de 16 x 150 mm , conteniendo campanas dunhan invertidas (75

x 10 mm) Bacteria Gram, lamina portaobjeto, asa de siembre, soporte de vidrio. Microscopio compuestos, aceite

de inversión Pipetas bacteriológicas 1 ml Caldo triptona, vol 5 ml (prueba voges –proshaven) en tubos 13 x 100 mm Agar citrato de Simmons, plano inclinado o en tubos de 16 x 150. Columna de agar 2.5 cm Medio SIM Reactivos para indol (reactivo de kovecs) Solución de rojo de metilo Sol de alfa naftol (5 %) e hidróxido de potasio 40 % para (voges – proskaver)

Procedimiento experimental

1. Sembrar y estriar agar nutritivo y agar endo 2. Colocar al agar nutritivo plano inclinado y caldo lactosado3. El agar nutritivo plano inclinado se hara la prueba IMU +SIM y al caldo lactosado tinción gram4. Se sembrara por inoculación o estriado el caldo triptona , caldo MR VP dos veces , agar citrato Simmons

y medio sin5. Colocar sus respectivos indicadores

Resultados

SIMMONS SIM TRIPTONA MRVP (agar) MRVP (r. m.)

10−1 A verde (+) (+) (-) (+)

10−1 B Azul (+) (+) (+) (+) (-)

10−2 A Azul (+) (-) (+) (+) (-)

10−2 B Azul (+) (-) (+) (-) (+)

10−3 A verde (-) (+) (+) (-) (+)

10−3 B verde (-) (+) (+) (-) (+)

10−3 C verde (-) (+) (+) (+) (-)

Numero de tubos

Dilución (-1) Dilución (-2) Dilución (-3) Dilución (-4) Dilución (-5)LST 3 3 3 3 0Brila 3 3 3 3 0EC 3 3 3 0 0Endo 3 3 3 3 0

Observaciones / discusiones

La presencia de E.coli es u determinante en la relación indirecta por contaminación de microorganismos patógenos

Si el citrato de Simmons reacciona positivo significa crecimiento de la bacteria y formación del citrato se vuelve alcalino y se torna color azul

Bibliografía

http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/mr-vpmedio.htm Fotos: lisseth vergaray baiz

Anexos