PRACTICA Microbiologia Humana- UNPRG

UNIVERSIDAD NACIONAL “Pedro ruiz gallo”

Informe de practicas

Microbiología Humana

Yesenia Rubí Girón Santa Cruz

25/07/2012

BIOLOGIA GENERAL

PRACTICA Nº1

Técnicas de Coloración y Siembra Bacteriana

I. OBJETIVOS:

Conocer y aprender las diferentes técnicas de coloración y siembra bacteriana.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

II.1. Técnicas de Coloración

Se emplea para distinguir diferentes tipos de células o para revelar la presencia de

determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes

celulares. Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas,

proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque

también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después

de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el

protoplasma. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el

contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo que es realmente, de manera que las

medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra

sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente;

un mordiente habitual es el ácido tánico. El mordiente se combina con un constituyente celular y

lo altera de ta1 modo que ahora sí podrá atacar el colorante.

TINCIÓN GRAN

La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio

bacteriológico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad

práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología las

referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc) se basan

justamente en la tinción de GRAM. Las bacterias GRAM-positivas y GRAM-negativas se tiñen de

forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares.

Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de cristal

violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el

exceso de colorante. En este estado, todas las células, tanto las grampositivas como las

gramnegativas, están teñidas de azul.

El portaobjetos se cubre entonces con Lugol. El ingrediente activo es aquí el I2; el KI

simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble

en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células grampositivas como las gramnegativas

se encuentran en la misma situación.

Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en

las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (grampositivas) no se

decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen.

La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la

decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias

Gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana

exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la membrana citoplásmica a la que se

une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo

cristal violeta-yodo y la célula se decolora.

Las células grampositivas, a causa de sus paredes celulares más espesas (tienen más

peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al disolvente ya que éste deshidrata la pared

celular y cierra los poros, disminuyendo así el espacio entre las moléculas y provocando que el

de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la

decoloración las células grampositivas son todavía azules, pero las gramnegativas son incoloras.

Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste.

Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de

la coloración de contraste las células gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas

permanecen azules.

SIEMBRA BACTERIANA

Todos los microorganismos viven y se multiplican gracias a substratos nutritivos que se

encuentran en el medio ambiente de forma natural. Pero podemos reproducir dichas condiciones

en el laboratorio, a fin de observar la presencia, ausencia o comportamiento de determinados

microorganismos. Este método de análisis se llama "medios de cultivo" y es en estos medios

donde se "siembran bacterias" con el fin de estudiar la morfología de las colonias, conservación

de cepas identificadas, obtención de toxinas, cultivo y aislamiento de bacterias para elaboración

de productos biológicos y otros más. La siembra se puede realizar en placas por estrías o en

tubos en medio solido (agar inclinado) o liquido (caldo nutriente).

III. MATERIALES

Cultivos bacterianos

Placas con Agar Tripticasa soja.

Tubos con Caldo Nutriente

Batería GRAM

Batería de Ziehl-Neelsen.

Asas bacteriológicas

Láminas portaobjetos.

Mechero

Aceite de Inmersion,

Microscopio

IV. PROCEDIMIENTO

A. Técnica GRAM

a) Preparación del frotis (1 gota de agua destilada + cultivo)

b) Agregar la frotis Cristal Violeta y dejar 3`

c) Agregar lugol y dejar 1`

d) Lavar

e) Decolorar con Alcohol-Acetona.

f) Lavar.

g) Agregar safranina y dejar 1`

h) Lavar y secar

i) Observar y dibujar

B. Técnica de Ziehl-Neelsen

a) Preparación del frotis (1 gota de agua destilada + cultivo).

b) Agregar al frotis Fucsina Fenicada y calentar hasta la emisión de vapores (repetir 3

veces) dejar 3’

c) Lavar.

d) Decolorar con Alcohol-Acido.

e) Lavar.

f) Agregar azul de metileno y dejar 1’

g) Lavar y secar.

EVALUACIÓN DE LOS CULTIVOS POR TINCIÓN GRAM

C. Técnica de Siembra

a) Siembra por agotamiento y estriado en

placas de agar.

Con un asa estéril coger una gota de cultivo y estriar agotando

la muestra en un lado de la placa y luego estriar mas separada

sobre toda la superficie del medio.

Esterilizar nuevamente el asa bacteriológica.

Llevar a incubación en condiciones aeróbicas durante 24 horas.

Staphylococcus aureus

Cocos GRAM positivos.

Racimos irregulares.

Inmóviles. No esporulados.

E. coli

Cocobacilos cortos GRAM negativos.

No esporulados. Motil, se mueve por medio de

flagelos peritricos. Puede presentar plásmido o

sobrevivir sin él. Se encuentra en el intestino

de hombre y por ende en las aguas negras

1000X 1000X

Describir las características de las colonias desarrollado en el

medio.

PRÁCTICA Nº2

Estudio Microbiológico del Género

Staphylococcus aureus

I. OBJETIVOS

Conocer la morfología y características de cultivo..


Microorganismo ampliamente distribuido en el ambiente, coloniza al hombre y animales. El

hombre es portador asintomático entre un 20 y un 40% de los adultos sanos y forma parte de la

flora normal de muchos sitios del organismo como piel y nasofaringe y tracto gastrointestinal,

causando diversas manifestaciones clínicas.Al Gram se evidencia como una cocácea Gram

positiva de 1um dispuesta en racimos, aunque también se le puede evidenciar en cadenas cortas

o diplococos. Es inmóvil y no forma esporas. Es anaerobio facultativo y crece bien en agar

sangre a 37ºC. Es habitual encontrar una colonia mediana, a veces B-hemolítica, de bordes

definidos, blanca o en ocasiones dorada, conociéndose también como el Staphylococcus dorado.

Se identifica con las pruebas de la coagulosa, manitol y termonucleasa, para las cuales es

positivo. Algunas pruebas se basan en su susceptibilidad a algunos virus bacteriófagos

específicos, mediante los cuales se puede clasificar. Es reconocido por su gran capacidad para

producir productos extracelulares.Es uno de los microorganismos más resistentes conocidos,

incluso pese a que no forma esporas. Puede mantenerse viable por 6 – 14 semanas en pus y se

necesitan 15 minutos de exposición al alcohol de 70º para su eliminación. La tintura de yodo es

mucho más activa y requiere solo 1 minuto.

Factores de Virulencia

Los factores de virulencia que presenta S. aureus, pueden ser productos extracelulares o propios

de la célula bacteriana.

Coagulasa. Es una enzima que le da la cualidad de coagular el plasma humano. Existe una

coagulasa libre, que es una proteína secretada con múltiples formas antigénicas, la cual se

puede evidenciar en un tubo de ensayo con plasma humano o de conejo, resultando un coágulo

de fibrina. Aparte, existe una coagulasa unida a la pared bacteriana que actúa como factor de la

agregación plaquetaria.

Hemolisinas. Proteínas, de las cuales alfa y delta son significativas para el hombre. Alfa es

termolábil, pero produce lisis de eritrocitos y toxicidad para otras líneas celulares.

III. MATERIALES

- Cultivo de Stafilococcus.

- Muestra clínica.

- Placas con Agar Sangre

- Tubos con Agar Manitol Salado

- Tubos con Caldo Nutriente y Glucosado

- Plasma sanguíneo

- Batería GRAM

- Laminas portaobjetos

- Mecheros

- Reactivo de catalasa

- Asas bacteriologicas

- Aceite de inmersión

- Microscopio

IV. PROCEDIMIENTO

A. Estudio de las características morfológicas.

Coloración GRAM del cultivo

Observar y dibujar.

B. Estudio de las características culturales.

a) Crecimiento en placas agar sangre.

b) Producción de hemolisina: medio de cultivo (Agar Sangre)

c) Crecimiento en medio hipertónico: medio de cultivo agar manitol salado-

Rojo de Fenol 75% de NaCl.

C. Estudio de las características fisiológicas.

1) Prueba de la catalasa: Reactivo H2O

2) Prueba de fermentación de la Glucosa

Medio de cultivo: clado glucosado.

Indicador: Rojo de Fenol

3) Prueba de Fermentación del Manitol.

Medio de cultivo:Agar Manitol Salado.

4) Prueba de Coagulasa

Plasma sanguíneo.

Sepa de S. aureus.

V. RESULTADOS

PRACTICA Nº3

Estudio Microbiológico De Streptococcus Pyogenes

I. OBJETIVOS

Conocer la morfología, las características culturales y fisiológicas de Streptococcus pyogenes


Los aislamientos de S. Pyogenes son cocos esféricos de 0,5 a 1,0 mm que forman cadenas

cortas en las muestras clínicas y cadenas más largas cuando crecen en medio de cultivo. El

crecimiento es óptimo en un medio de agar sangre enriquecido, pero se inhibe si el medio

contiene una concentración elevada de glucosa. Después de 24 horas de incubación se

observan colonias blancas de 1 a 2 mm con grandes zonas de Beta hemólisis. Las cepas

encapsuladas pueden presentar una apariencia mucoide en los medios recién preparados pero

pueden estar arrugadas en los medios secos. Las colonias no encapsuladas son pequeñas y

brillantes.La estructura antigénica de S. Pyogenes ha sido estudiada. El marco estructural básico

de la pared celular es la capa de peptidoglicanos, que tiene una composición parecida a las de

las bacterias grampositivas. Dentro de la pared celular están los antígenos específicos de grupo

y de tipo.

III. MATERIALES

Placas de Agar Sangre

Tubos con Caldo glucosa y lactosa

Tubos con Caldo Tripticasa Soya

Peróxido de Hidrógeno

Discos de bacitracina

Batería GRAM

Aceite de inmersión

Microscopio

IV. PROCEDIMIENTO

A. Estudio de Morfología celular

Realizar tinción GRAM del cultivo en Caldo Tripticasa Soya.

Observar la morfología típica.

B. Estudios de las Características culturales

Observar el crecimiento deStreptococcus pyogenesen placas de Agar Sangre.

Descripción de la colonia: tamaño, forma, color, aspecto, bordes, reacción hemolítica.

Observar las características de crecimiento en tubos con Caldo Tripticasa Soya.

C. Estudio de las Características fisiológicas

a) Prueba de Catalasa

En un porta a partir de una colonia de Agar Sangre.

b) Prueba de Fermentación de Carbohidratos: glucosa y lactosa

Observar la fermentación de la glucosa y lactosa en medio líquido.

c) Prueba de susceptibilidad de bacitracina

Observar la susceptibilidad en placas de Agar Sangre.

V. RESULTADOS

Prueba de Catalasa

Bacterias que viven en ambientes aerobios requieren de catalasa para convertir el

peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno molecular.Es positiva la prueba cuando se

ponen en contacto una bacteria con actividad catalasa con H2O2 3% y se producen

burbujas de oxígeno.Se emplea para diferenciar el género Staphylococcus (catalasa

positivo) del género Streptococcus (catalasa negativo).

PRUEBA DE FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS

PRACTICA Nº4

ESTUDIO MICROBIOLÓGICO DE Neisseria

I. OBJETIVOS

Conocer las características morfológicas culturales y fisiológicas de Neisseria


El género Neisseria incluye bacterias con morfología de diplococcos Gram-negativos con

unareacción positiva a las pruebas de oxidasa y catalasa. Conjuntamente con los géneros

Moraxella (incluyendo Branhamella catarrhalis , actualmente Moraxella catarrhalis), yKingella

conforman lafamilia Neisseriaceae. En el géneroNeisseria, el cual tiene la mayor importancia

clínica dentro de la familiaNeisseriaceae, se incluyen las siguientes especies:N. gonorrhoeae, N.

meningitidis, N. lactamica, N. cinérea, N. polysaccharea, N. subflava,N. sicca, N. mucosa.Los

diplococos Gram negativos del géneroNeisseriase asemejan a granos de café yalgunos

producen cápsula. Las especies deNeisseriase caracterizan por ser demetabolismo aerobio y el

crecimiento de las especies patógenas se ve favorecido medianteincubación en una atmósfera

altamente húmeda y enriquecida a5-8%de CO2.Su temperatura de crecimiento es óptima entre

los 35-37oC y tienen requerimientosnutricionales complejos. Algunas especies son capaces de

degradar unos pocoscarbohidratos, mientras que otras son completamente incapaces de

hacerlo, mientras que lasespecies saprófitas, especialmente, producen pigmentos

carotenoides.Las especies patógenas primarias para el ser humano sonN.

gonorrhoeaeYN.meningitidis.N. gonorrhoeaees nutricionalmente mucho más exigente queN.

meningitidis,de manera tal que puede crecer únicamente en medios enriquecidos como agar

chocolate,pero no puede crecer en agar sangre, mientras queN. meningitidispuede crecer tanto

enagar sangre como en agar chocolate.

III. MATERIALES

Placas de Agar Chocolate

Tubos con Caldo glucosa, maltosa,

sacarosa

Tubos con Caldo Tripticasa Soya

Peróxido de Hidrógeno

Reactivo de Oxidasa

Batería GRAM


Microscopio

IV. PROCEDIMIENTO

A. Estudio de Morfología celular

Realizar tinción GRAM del cultivo en Caldo Tripticasa Soya.

Observar la morfología típica.


Observar el crecimiento de Neisseriasp. en placas de Agar Chocolate.

Descripción de la colonia: tamaño, forma, color, aspecto, bordes.

Observar las características de crecimiento en tubos con Caldo Tripticasa Soya.

C. Estudio de las características fisiológicas

a) Prueba de Catalasa

En un porta a partir de una colonia de Agar Chocolate.

b) Prueba de fermentación de carbohidratos: glucosa, maltosa, sacarosa.

Observar la fermentación en medio líquido.

c) Prueba de Oxidasa

Coger una colonia de Agar Chocolate y colocarla sobre el Reactivo de Oxidasa.

V. RESULTADOS

PRACTICA Nº5

Estudio Microbiológico De Enterobacterias

I. OBJETIVOS

Sembrar, leer e interpretar las características morfológicas culturales y fisiológicas de

Enterobacterias mediantealgunas pruebas bioquímicas útiles en la identificación.


Las pruebas bioquímicas se basan en la determinación de la presencia o ausencia de diferentes

enzimas codificadas por el material genético del cromosoma bacteriano. Estas enzimas

(catalasas, coagulasas, decarboxilasas, desaminasas, ureasas, peroxidasas, etc) involucradas

en el metabolismo bacteriano, pueden ser evidenciadas en medios de cultivo especiales que

contienen los substratos (DNA, hidratos de carbono, aminoácidos, etc) sobre los cuales ellas

actúan, junto con un sistema indicador que va a poner de manifiesto la degradación del substrato

o la presencia de un metabolito específico (ácido fórmico, ácido láctico, ácido succínico, indol,

etc).Las pruebas bioquímicas también evalúan: la capacidad de reducir ciertos iones (ferroso a

férrico), la presencia o ausencia de flagelos (prueba de movilidad), la producción o no de

hemolisinas, el requerimiento o no de algunos factores especiales (proteínas séricas), la

producción o no de algunas toxinas con capacidad virulenta (toxina diftérica, toxina botulínica).

III. MATERIALES

Cultivos microbianos en agar

MacConkey

Cultivosmicrobianos en medio

diferenciales

TSI

LIA

Agar Citrato de Simons

Caldo Peptona

Caldo Rojo de Metilo

Reactivo de

KOVAC`S

Rojo de Metilo

Láminas


Mecheros

Aceite de inmersión Microscopios

IV. PROCEDIMIENTO

A. EstudioMorfológico

Realizar un frotis de cada uno de los cultivos y teñir con la técnica de GRAM.

Observar y establecer diferencias y semejanzas.


Observar y evaluar el crecimiento de las cepas de Agar Mac Conkey.

Dibujar y establecer diferencias.


a) Prueba de fermentación de carbohidratos

Medio de cultivo: Agar Hierro con Triple Azúcar (TSI – Lac./Sac./Gluc.)

Observar el crecimiento de cada uno de las cepas de estudio en Agar TSI.

Explicar el fundamento de la prueba y establecer las diferencias.

Dibujar.

b) Prueba de Descarboxilaciónde Lisina

Medio de cultivo: Agar Hierro con Lisina

Observar el crecimiento de cada uno de las cepas de estudio en medio LIA.


Dibujar.

c) Producción de Indol

Medio de cultivo: Caldo Peptonado

Reactivo KOVAC`S

Agregar al cultivo bacteriano unas gotas de reactivo de KOVAC`S.

Observar la reacción de cada uno de las cepas.


Dibujar.

d) Prueba del Rojo de Metilo

Medio de cultivo: Caldo Rojo de Metilo – VogesProskawer

Reactivo Rojo de Metilo

Agregar al cultivo bacteriano unas gotas del reactivo.



Dibujar.

e) Prueba de citrato

Medio de cultivo: Agar Citrato de Simons

Observar el crecimiento de cada uno de las cepas de estudio en Agar Citrato de

Simons.


Dibujar.

V. RESULTADOS

PRACTICA N 7

Estudio microbiológico de citrobacter y proteus

I. OBJETIVOS

II. MATERIALES

Cultivos microbianos en agar Mac

Conkey

Cultivos microbianos en medio

diferenciales

TSI

LIA


Caldo Peptona


Reactivo de

KOVAC`S

Rojo de Metilo

Láminas


Mecheros


Microscopios

III. PROCEDIMIENTO

A. Estudio de Morfológico











Dibujar.

b) Prueba de Descarboxilación de Lisina




Dibujar.



Reactivo KOVAC`S




Dibujar.







Dibujar.




Simons.


Dibujar.

PRACTICA Nº 8

Estudio Microbiológico De V. Cholerae Y P.

Auriginosa

I. OBJETIVOS

II. MATERIALES

Cultivos microbianos en agar Mac

Conkey

Cultivos microbianos en medio

diferenciales

TSI

LIA


Caldo Peptona


Reactivo de

KOVAC`S

Rojo de Metilo

Láminas


Mecheros


Microscopios

III. PROCEDIMIENTO

A. Estudio de Morfológico











Dibujar.

b) Prueba de Descarboxilación de Lisina




Dibujar.



Reactivo KOVAC`S




Dibujar.







Dibujar.




Simons.


Dibujar.

PRACTICA Nº9

Estudio Microbiológico De Bacillus anthracis.

I. OBJETIVOS

- Conocer la morfología y la disposición de Bacillus anthracis.

II. MARCO TEORICO:

Bacillus anthracis es inmóvil y capsulada. La endospora característica

de Bacillus es de forma redondeada y de situación central, sin deformar la

célula. Cada célula mide entre 1 y 6 μm. Las esporas son muy resistentes a la

temperatura y a los desinfectantes químicos, aunque se muestran muy

sensibles a la penicilina. Es frecuente encontrar esporas en productos

derivados de animales como lana o pienso. El proceso de esporulación se

realiza siempre fuera del animal infectado. Las esporas se transforman en la

forma vegetativa en medios favorables como la sangre y

otros tejidos biológicos, ya sea animales o humanos, en particular ricos

en aminoácidos, nucleótidos y en glucosa. El Bacillus anthracis es un

organismo aerobio.

Las esporas suelen encontrarse en suelos alcalinos, y se cree que la

germinación está relacionada con cambios bruscos de temperatura. Las

bacterias penetran a través de heridas (carbunco cutáneo), vía oral (carbunco

gastrointestinal) o por inhalación (carbunco inhalatorio), y éste último es el más

grave. Una vez dentro del huésped, las bacterias se difunden y se multiplican

en los ganglios linfáticos hasta que alcanzan el torrente sanguíneo.

III. MATERIAL

Cultivos de Bacillus anthracis.

Placas con agar nutriente.

Tubos con caldo nutriente.

Tubos con agar almidón.

Batería gran.

Laminas portaobjetos.

Asas bacteriológicas.

Microscopios

Aceite de inmersión.

Reactivo: lugol

IV. RESULTADOS:

http://es.wikipedia.org/wiki/Ganglio_linf%C3%A1tico

http://es.wikipedia.org/wiki/Hu%C3%A9sped_(biolog%C3%ADa)

http://es.wikipedia.org/wiki/Organismo_aerobio

http://es.wikipedia.org/wiki/Glucosa

http://es.wikipedia.org/wiki/Nucle%C3%B3tido

http://es.wikipedia.org/wiki/Amino%C3%A1cido

http://es.wikipedia.org/wiki/Tejido_(biolog%C3%ADa)

http://es.wikipedia.org/wiki/Esporulaci%C3%B3n

http://es.wikipedia.org/wiki/Pienso_compuesto

http://es.wikipedia.org/wiki/Lana

http://es.wikipedia.org/wiki/Espora

http://es.wikipedia.org/wiki/Penicilina

http://es.wikipedia.org/wiki/Micr%C3%B3metro_(unidad_de_longitud)

http://es.wikipedia.org/wiki/Endospora

PRACTICA Microbiologia Humana- UNPRG

Documents

Transcript of PRACTICA Microbiologia Humana- UNPRG