Prctica 6: Purificacin de ADN plasmdico, digestin y electroforesis en gel de agarosaAutores:

Ana Luca Contreras Gonzlez

al702071Ana Sofa Piera Morales

al688741Pedro Gonzalez Castro

iq687093Fecha de realizacin de prctica: 18 de abril de 2015

Fecha de realizacin de reporte: 25 de abril de 2015ResultadosLB/CB = Este medio de cultivo en forma liquida de color tendiendo a caf fue usado para la inoculacin del medio de E. Coli y para el mantenimiento de este, para que creciera y poder extraer ADN de este.

Para la preparacin del Miniprep (mtodo utilizado para el aislamiento del ADN plasmdico) realizado en tubos de Eppendorf esterilizados, se obtuvieron los siguientes resultados: 1) La solucin de lisis Tens: esta solucin fue usada para la desnaturalizacin del ADN plasmdico y el ADN cromosomal. Como esta solucin contena NaOH y el detergente SDS provoc la lisis celular, la desnaturalizacin del ADN cromosmico, de las protenas y la liberacin de los plsmidos. 2) El acetato de amonio utilizado en esta prctica fue utilizado para precipitar las protenas. Tras haber centrifugado con esta solucin se obtuvo de precipitado las protenas y el ADN cromosmico y el sobrenadante era el ADN plasmdico. 3) El ADN plasmdico (sobrenadante) se le agreg isopropanol fro que sirvi para precipitar el ADN plasmdico y posteriormente se le agreg etanol para que se purificara correctamente, se us para la digestin. Para la digestin se us el tubo que ms precipitado contena (ADN plasmdico).Para la digestin del ADN plasmdico se utilizaron 2 diferentes enzimas de restriccin (B14 y D4 (1microlitro respectivamente)), 2 microlitros de Buffer, 4 microlitros del ADN obtenido en el paso anterior y 13 microlitros de H2O.Enzimas de restriccin: Tambin conocidas como endonucleasas, cortan los enlaces fosfodiester del material gentico a partir de una secuencia que reconocen. Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrmicas.

Reactivos utilizados para a elaboracin del gel:

EDTA 0.5M pH 8 = sustancia que puede servir como agente quelante que puede crear complejos con un metal que tenga una estructura de coordinacin octadrica.

TPE 10X 100 ml = esta solucin fue compuesta por estos diferentes reactivos:

Tris base (10.8gr) = solucin tampn

cido fosfrico (1.55ml)

EDTA 0.5M pH 8

Gel de agarosa = 0.3 g (agarosa) / 25 ml de TPE 1XElectroforesis: separacin de biomoleculas en disolucin que fueron sometidas a un campo elctrico. Cuando molculas cargadas son colocadas en un campo elctrico, estas migran hacia el polo positivo (nodo) o polo negativo (ctodo) de acuerdo a su carga.

Tras 40 minutos de corrimiento con carga se obtuvo el siguiente resultado:Discusina) Qu hay que tomar en cuenta para la preparacin de los reactivos?

Para la preparacin de los reactivos se necesita primordialmente de que sola una persona prepare los reactivos, porque si se preparan ms de dos personas existe una tendencia a que ya no haya una buena precisin al estar midiendo los volmenes. Tambin de comprobar que los reactivos no estn contaminados, junto con el material que se vaya a usar para la prctica.

Por ltimo, dejarlos en un lugar que no vaya a ser contaminado y/o peligroso que pueda daarse tanto qumicamente como fsicamente.b) Qu parmetros crticos existen para obtener un resultado ptimo? Los cultivos en medio LB deberan ser crecidos hasta 1-1.5 A600 unidades/ml o 1 x 109 clulas/ml. Existen varios parmetros crticos para obtener un resultado ptimo. Los cultivos en medio LB deberan ser crecidos hasta 1-15 A600 unidades/ml o 1 x 109 clulas/ml. Las columnas no deben ser sobrecargadas con DNA plasmdico, para ello deben de usarse los volmenes de cultivo que se indican. (Repullo, 2015)c) Por qu no se vieron bandas en los dems carriles?Puede haber varias razones, una de ellas puede ser la concentracin de gel de agarosa para electroforesis, este es un instrumento que permite visualizar la integridad de DNA genmica para poder determinar la presencia de diferentes especies de RNA. Segn (genomica, 2008) este gel no es desnaturalizante los fragmentos pequeos se mueven ms fcil a travs de los poros del gel de agarosa, en cambio los fragmentos grandes tienen mayor resistencia a la movilidad de los cidos nucleicos y permite una mayor resolucin, por lo tanto; a mayor concentracin, mayor compactacin y por ende menor velocidad de migracin. Otra de las posibles razones pudo haber sido una mala extraccin del ADN, a la hora de verter el sobrenadante se pudo haber tirado el pellet que es lo que nos interesaba de las muestras. Por ltimo no se pudo observar claramente en los carriles porque se pudo haber obtenido ADN cromosomal no plasmdico que es el que se observa en el gel.

d) Las bandas observadas corresponde al tamao en pb del ADN plasmdico para B y D? si o no y por qu?plsmido D=5393pb (Scientific, 2008)plsmido B= 5420pb (Scientific, 2008)obtenido:

plsmidos B= 8306pb; no concuerda existe una diferencia de pb porque no fue la concentracin correcta de ADN plasmdico o no fue correcta la medicin.e) Las bandas que corresponde al ADN plsmido se pueden apreciar a la misma distancia que aquellas del ruler o marcador de peso molculas? A qu tamao corresponden?

f) Que haras para mejorar los resultados de la practica?

Pesar el adn

Utilizar bromuro de etidio

Considerando que la purificacin del ADN se realiz correctamente, se piensa que para mejorar los resultados en la practica se debi tener mas cuidado en el procedimiento para realizar la electroforesis, principalmente en la aplicacin del SYBR (que fue el sustituto de BrEt) ya que debido a la metodologa que se utilizo, no se tomo en cuenta la cantidad de ADN, por lo tanto es probable que la cantidad de SYBR no fue suficiente para visualizar los resultados, o en su defecto, el colorante no era el indicado para la cantidad de ADN.

g) Hubo o no hubo digestin del ADN plasmdico?

Conclusin

1) En esta prctica no se logr el objetivo ya que no se pudo observar claramente el ADN plasmdico.

2) A la hora de revisar los resultados en el gel de agarosa solo 2 carriles presentaron digestin de ADN plasmdico.

3) Estos resultados podran ser gracias a la baja concentracin de ADN plasmdico.

4) La precisin de los resultados pudo tener varianza gracias a la calidad de la preparacin de los reactivos y a la inoculacin de la bacteria E. Coli.BibliografaScientific, T. (2008). Thermo Scientific. Obtenido de www.thermoscientific.com/onebiogenomica. (2008). genomica uaslp. Obtenido de protocolos: www.genomica.uaslp.mx/protocolos

Repullo, J. L. (2015). Purifiacion de ADN plasmidico y electroforesis del mismo gel de agarosa. Obtenido de uco.es: www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/38%20PURIFICACI%C3%93N%20DNA%20PL%C3%81SMIDO.pdf

Figura 1. Enzimas utilizadas para la digestin de ADN plasmdico. B14 y D4

Figura 2. Gel de agarosa cargado con colorante SBRY y la muestra del paso anterior (electroforesis).

Figura 3. Corrimiento del ADN plasmdico tras 40 min de corrimiento.

3000 70 14

3000 70 14

8000 30 6 bp. (Scientific, 2008)

El ADN cromosmico se puede observar a la misma distancia que el ruler, por lo tanto se puede calcular el nmero de pares de bases.

3000 70 14

3000 70 14

En dos carriles no hubo digestin del ADN plasmdico, esto puede se puede saber ya que los carriles no se ven. (genomica, 2008)

3000 70 14