Laboratorio de Analisis instrumentalPRCTICA 1INTRODUCCIN A LA ESPECTROSCOPA UV-VisibleDeterminacin de la longitud de onda ptima para el anlisis cuantitativo.

Alejandro Carvajal Restrepo.Departamente de Ingenieria QuimicaUniversidad de AntioquiaMayo 06 de 2013

1. Marco tericoDesde hace muchos aos se ha usado el color como ayuda para reconocer las sustancias qumicas; al reemplazar el ojo humano por otros detectores de radiacin se puede estudiar la absorcin de sustancias, no solamente en la zona del espectro visible, sino tambin en ultravioleta e infrarrojo.El anlisis de la luz emitida o absorbida por los tomos de un gas nos informa sobre su composicin, temperatura y la densidad del gas. El anlisis de la luz en sus diferentes longitudes de onda constituye el dominio de la espectroscopia.La teora ondulatoria de la luz propone la idea de que un haz de luz es un flujo de cuantos de energa llamados fotones; la luz de una cierta longitud de onda est asociada con los fotones, cada uno de los cuales posee una cantidad definida de energa. [1]La espectroscopia visible es una de las tcnicas frecuentemente empleadas en el anlisis qumico. Para que una substancia sea activa en el visible debe ser colorida: absorbe ciertas frecuencias o longitudes de onda del espectro visible y transmite otras. Por ejemplo: una solucin es amarilla debido a que dentro de la regin visible absorbe radiacin en el rango de 435 a 480 nm. En este rango de longitud de onda se encuentra el color azul del visible, por lo que este compuesto absorbe el color azul y transmite los colores complementarios que dan origen al color amarillo de la solucin mencionada.El rango visible se considera de los 380 a los 750 nm. El rango del Ultravioleta cercano es de 190 a 380 nm. La base de la espectroscopia Visible y Ultravioleta consiste en medir la intensidad del color (o de la radiacin absorbida en UV) a una longitud de onda especfica comparndola con otras soluciones de concentracin conocida (soluciones estndar) que contengan la misma especie absorbente. Para obtener esta relacin se emplea la Ley de Beer, que establece que para una misma especie absorbente en una celda de espesor constante, la absorbancia es directamente proporcional a la concentracin.La coloracin de la solucin se debe a la especie absorbente y esta coloracin puede ser natural o inducida. La coloracin natural puede ser la base de la cuantificacin de una especie, como por ejemplo: la clorofila en ciertas plantas, los complejos metlicos que se encuentran presentes en solucin acuosa, como son los iones de Cobre (II), Manganeso (VII), Cobalto (III), etc. [2]

2. ObjetivosObjetivo general: Determinacin de la longitud de onda ptima para el anlisis cuantitativo.Objetivos especificos: Conocer las partes que conforman un espectrofotmetro de absorcin ultravioleta visible. Determinar el espectro de absorcin UV-Vis de diferentes compuestos. Aprender a seleccionar la longitud de onda ms adecuada para efectuar anlisis cuantitativo.

3. Tratamiento de los datosSegn los resultados experimentales que se obtuvieron de la prctica:Tabla 1.0 Datos experimentales de absorbancia versus longitud de onda y el respectivo porcentaje de transmitancia calculado para las sustancias analizadas.NARANJA DE METILOAZUL DE METILENO

nmA%TnmA%T

296-0.80702.2412300-0.35401.4248

297-0.62901.8757301-0.30701.3593

298-0.50601.6586302-0.27001.3100

299-0.41901.5204303-0.23801.2687

300-0.35401.4248304-0.20801.2312

301-0.30701.3593305-0.18801.2068

302-0.27001.3100306-0.16801.1829

303-0.23801.2687307-0.15101.1630

304-0.20801.2312308-0.13901.1491

305-0.18801.2068309-0.13001.1388

306-0.16801.1829310-0.11801.1252

307-0.15101.1630311-0.11201.1185

308-0.13901.1491312-0.10401.1096

309-0.13001.1388313-0.09501.0997

310-0.11801.1252314-0.09001.0942

311-0.11201.1185315-0.08401.0876

312-0.10401.1096316-0.07801.0811

313-0.09501.0997317-0.07401.0768

314-0.09001.0942318-0.07001.0725

315-0.08401.0876319-0.06201.0640

316-0.07801.0811320-0.06101.0629

317-0.07401.0768321-0.05801.0597

318-0.07001.0725322-0.05601.0576

319-0.06201.0640323-0.05501.0565

320-0.06101.0629324-0.05101.0523

321-0.05801.0597325-0.05301.0544

322-0.05601.0576326-0.05301.0544

323-0.05501.0565327-0.04901.0502

324-0.05101.0523328-0.04701.0481

325-0.05301.0544329-0.04901.0502

326-0.05301.0544330-0.04801.0492

327-0.04901.0502331-0.04401.0450

328-0.04701.0481332-0.04301.0439

329-0.04901.0502333-0.04001.0408

330-0.04801.0492334-0.04101.0419

331-0.04401.0450335-0.04001.0408

332-0.04301.0439336-0.03801.0387

333-0.04001.0408337-0.03801.0387

334-0.04101.0419338-0.03301.0336

335-0.04001.0408339-0.03001.0305

336-0.03801.0387340-0.02501.0253

337-0.03801.0387341-0.02301.0233

338-0.03301.0336342-0.01701.0171

339-0.03001.0305343-0.01701.0171

340-0.02501.0253344-0.01101.0111

341-0.02301.0233345-0.00801.0080

342-0.01701.0171346-0.00401.0040

343-0.01701.01713470.00100.9990

344-0.01101.01113480.01000.9900

345-0.00801.00803490.01300.9871

346-0.00401.00403500.01900.9812

3470.00100.99903510.02600.9743

3480.01000.99003520.03200.9685

3490.01300.98713530.03700.9637

3500.01900.98123540.04600.9550

3510.02600.97433550.05000.9512

3520.03200.96853560.05800.9436

3530.03700.96373570.06700.9352

3540.04600.95503580.07200.9305

3550.05000.95123590.07900.9240

3560.05800.94363600.08900.9148

3570.06700.93523610.09500.9094

3580.07200.93053620.10200.9030

3590.07900.92403630.11600.8905

3600.08900.91483640.12000.8869

3610.09500.90943650.12900.8790

3620.10200.90303660.14000.8694

3630.11600.89053670.14900.8616

3640.12000.88693680.15700.8547

3650.12900.87903690.16700.8462

3660.14000.86943700.17600.8386

3670.14900.86163710.18500.8311

3680.15700.85473720.19400.8237

3690.16700.84623730.20500.8146

3700.17600.83863740.21600.8057

3710.18500.83113750.22700.7969

3720.19400.82373760.23900.7874

3730.20500.81463770.24900.7796

3740.21600.80573780.25800.7726

3750.22700.79693790.26800.7649

3760.23900.78743800.27900.7565

3770.24900.77963810.29300.7460

3780.25800.77263820.30100.7401

3790.26800.76493830.31400.7305

3800.27900.75653840.32400.7233

3810.29300.74603850.33400.7161

3820.30100.74013860.34500.7082

3830.31400.73053870.35400.7019

3840.32400.72333880.36700.6928

3850.33400.71613890.37700.6859

3860.34500.70823900.38800.6784

3870.35400.70193910.40000.6703

3880.36700.69283920.40800.6650

3890.37700.68593930.42200.6557

3900.38800.67843940.42900.6512

3910.40000.67033950.43700.6460

3920.40800.66503960.45000.6376

3930.42200.65573970.46100.6307

3940.42900.65123980.47100.6244

3950.43700.64603990.48300.6169

3960.45000.63764000.49200.6114

3970.46100.63074010.50100.6059

3980.47100.62444020.51100.5999

3990.48300.61694030.51700.5963

4000.49200.61144040.52800.5898

4010.50100.60594050.53800.5839

4020.51100.59994060.54800.5781

4030.51700.59634070.55300.5752

4040.52800.58984080.56500.5684

4050.53800.58394090.57200.5644

4060.54800.57814100.58000.5599

4070.55300.57524110.58900.5549

4080.56500.56844120.59700.5505

4090.57200.56444130.60700.5450

4100.58000.55994140.61400.5412

4110.58900.55494150.62100.5374

4120.59700.55054160.62800.5337

4130.60700.54504170.63600.5294

4140.61400.54124180.64600.5241

4150.62100.53744190.65300.5205

4160.62800.53374200.66000.5169

4170.63600.52944210.66700.5132

4180.64600.52414220.67400.5097

4190.65300.52054230.68200.5056

4200.66000.51694240.68900.5021

4210.66700.51324250.69500.4991

4220.67400.50974260.70400.4946

4230.68200.50564270.71600.4887

4240.68900.50214280.71500.4892

4250.69500.49914290.72400.4848

4260.70400.49464300.73000.4819

4270.71600.48874310.73700.4785

4280.71500.48924320.74400.4752

4290.72400.48484330.75400.4705

4300.73000.48194340.75800.4686

4310.73700.47854350.76300.4663

4320.74400.47524360.77200.4621

4330.75400.47054370.77600.4602

4340.75800.46864380.78000.4584

4350.76300.46634390.78900.4543

4360.77200.46214400.79400.4520

4370.77600.46024410.80100.4489

4380.78000.45844420.80500.4471

4390.78900.45434430.81200.4440

4400.79400.45204440.82100.4400

4410.80100.44894450.82500.4382

4420.80500.44714460.83000.4360

4430.81200.44404470.83900.4321

4440.82100.44004480.84000.4317

4450.82500.43824490.84500.4296

4460.83000.43604500.85400.4257

4470.83900.43214510.85800.4240

4480.84000.43174520.86300.4219

4490.84500.42964530.86600.4206

4500.85400.42574540.87200.4181

4510.85800.42404550.87500.4169

4520.86300.42194560.87700.4160

4530.86600.42064570.88200.4140

4540.87200.41814580.88500.4127

4550.87500.41694590.88600.4123

4560.87700.41604600.88900.4111

4570.88200.41404610.89100.4102

4580.88500.41274620.89500.4086

4590.88600.41234630.89400.4090

4600.88900.41114640.89500.4086

4610.89100.41024650.89400.4090

4620.89500.40864660.89200.4098

4630.89400.40904670.89000.4107

4640.89500.40864680.88900.4111

4650.89400.40904690.88800.4115

4660.89200.40984700.88800.4115

4670.89000.41074710.88200.4140

4680.88900.41114720.87800.4156

4690.88800.41154730.87500.4169

4700.88800.41154740.87000.4190

4710.88200.41404750.86300.4219

4720.87800.41564760.85600.4249

4730.87500.41694770.85200.4266

4740.87000.41904780.84700.4287

4750.86300.42194790.83700.4330

4760.85600.42494800.83100.4356

4770.85200.42664810.82400.4387

4780.84700.42874820.81300.4435

4790.83700.43304830.80200.4484

4800.83100.43564840.79300.4525

4810.82400.43874850.78200.4575

4820.81300.44354860.77100.4626

4830.80200.44844870.76100.4672

4840.79300.45254880.74900.4728

4850.78200.45754890.73700.4785

4860.77100.46264900.72600.4838

4870.76100.46724910.71100.4912

4880.74900.47284920.69900.4971

4890.73700.47854930.68500.5041

4900.72600.48384940.67100.5112

4910.71100.49124950.65800.5179

4920.69900.49714960.64300.5257

4930.68500.50414970.62600.5347

4940.67100.51124980.61100.5428

4950.65800.51794990.59600.5510

4960.64300.52575000.58300.5582

4970.62600.53475010.56700.5672

4980.61100.54285020.55000.5769

4990.59600.55105030.53400.5863

5000.58300.55825040.51800.5957

5010.56700.56725050.50400.6041

5020.55000.57695060.49000.6126

5030.53400.58635070.47500.6219

5040.51800.59575080.45600.6338

5050.50400.60415090.44200.6427

5060.49000.61265100.42600.6531

5070.47500.62195110.40900.6643

5080.45600.63385120.39500.6737

5090.44200.64275130.37900.6845

5100.42600.65315140.36700.6928

5110.40900.66435150.35100.7040

5120.39500.67375160.33500.7153

5130.37900.68455170.32200.7247

5140.36700.69285180.30800.7349

5150.35100.70405190.29200.7468

5160.33500.71535200.28000.7558

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749-0.00901.0090753-0.00801.0080

750-0.00901.0090754-0.01201.0121

751-0.01001.0101755-0.00701.0070

752-0.00901.0090756-0.00901.0090

753-0.00801.0080757-0.01101.0111

754-0.01201.0121758-0.01001.0101

755-0.00701.0070759-0.00801.0080

756-0.00901.0090760-0.00901.0090

757-0.01101.0111761-0.00901.0090

758-0.01001.0101762-0.00801.0080

759-0.00801.0080763-0.00501.0050

760-0.00901.0090764-0.00901.0090

761-0.00901.0090765-0.00801.0080

762-0.00801.0080766-0.00801.0080

763-0.00501.0050767-0.00801.0080

764-0.00901.0090768-0.01001.0101

765-0.00801.0080769-0.00801.0080

766-0.00801.0080770-0.00701.0070

767-0.00801.0080771-0.00701.0070

768-0.01001.0101772-0.00701.0070

769-0.00801.0080773-0.00801.0080

770-0.00701.0070774-0.01001.0101

771-0.00701.0070775-0.00601.0060

772-0.00701.0070776-0.01001.0101

773-0.00801.0080777-0.00801.0080

774-0.01001.0101778-0.01001.0101

775-0.00601.0060779-0.00801.0080

776-0.01001.0101780-0.00901.0090

777-0.00801.0080781-0.00801.0080

778-0.01001.0101782-0.00901.0090

779-0.00801.0080783-0.00601.0060

780-0.00901.0090784-0.00801.0080

781-0.00801.0080785-0.00901.0090

782-0.00901.0090786-0.00601.0060

783-0.00601.0060787-0.01001.0101

784-0.00801.0080788-0.01001.0101

785-0.00901.0090789-0.00801.0080

786-0.00601.0060790-0.00801.0080

787-0.01001.0101791-0.00501.0050

788-0.01001.0101792-0.00901.0090

789-0.00801.0080793-0.01001.0101

790-0.00801.0080794-0.00701.0070

791-0.00501.0050795-0.00601.0060

792-0.00901.0090796-0.00801.0080

793-0.01001.0101797-0.00901.0090

794-0.00701.0070798-0.01001.0101

795-0.00601.0060799-0.01101.0111

796-0.00801.0080800-0.00601.0060

797-0.00901.0090

798-0.01001.0101

799-0.01101.0111

800-0.00601.0060

7980.00001.0000

7990.00001.0000

8000.00400.9960

Segn los valores tabulados en la tabla 1.0 se realizaron las siguientes graficas de absorbancia versus longitud de onda para las dos sustancias que se analizaron, las cuales fueron naranja de metilo y azul de metileno.

Grafica 1.0 Absorbancia versus longitud de onda del naranja de metilo

Grafica 1.1 Porcentaje de transmitancia versus longitud de onda del naranja de metilo

Tomando en cuenta la relacin entre absorbancia y transmitancia:

Se realizaron las siguientes graficas de porcentaje de transmitancia versus longitud de onda para cada una de las sustancias analizadas:

Grafica 2.0 Absorbancia versus longitud de onda del azul de metileno

Grafica 2.1 Porcentaje de transmitancia versus longitud de onda del azul de metileno

4. Respuesta a las preguntas Defina absorbancia y transmitancia. [2]La transmitancia se define como la cantidad de energa que atraviesa un cuerpo; resulta como consecuencia de la interaccin entre los fotones y los tomos o las molculas absorbentes, la potencia del rayo se atena desde Po a P. Se define como:

Y con frecuencia de la siguiente manera:

Laabsorbancia es la cantidad de intensidad de luz que absorbe una muestra. Est definida como:

Cuando no se absorbe luz P=Po, y como consecuencia A=0, y la transmitancia es del 100% indicando que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda. Qu relacin existe entre la absorcin de luz y la concentracin de un compuesto colorido?[3]

LEY DE BEER-LAMBERT: Cuando se pasa un rayo de luz monocromtica de intensidad inicial I0 a travs de una solucin en un recipiente transparente, parte de la luz es absorbida de manera que la intensidad de la luz transmitida I es mayor que I0. Ocurre alguna disminucin en la intensidad de la luz por la dispersin de las partculas o reflexin en las interfases, pero principalmente por la absorcin de la solucin. La relacin entre I e I0 depende de la longitud del medio absorbente I, y de la concentracin de la solucin absorbente, c. Estos factores se hallan relacionados en la Ley de Lambert y Beer.Ley de Lambert: Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la longitud del medio absorbente aumenta.

Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la concentracin del medio absorbente aumenta.

Estas dos leyes se combinan en la ley de Beer-Lambert:

Figura 1.0. Absorcin de la luz por una solucin.

El cociente de las intensidades se conoce como la transmitancia y se expresa como un porcentaje:

Sacando logaritmos:

La expresin se conoce como la extincin E, o la absorbancia. Por lo tanto:E=kclSi se sigue la Ley de Beer-Lambert y l se mantiene constante, un grfico de la extincin en funcin de la concentracin de una lnea recta que pasa por el origen; en tanto que un grfico del porcentaje de transmitancia en funcin de la concentracin da una curva negativa exponencial.Algunos colormetros y espectrofotmetros tienen dos escalas, una lineal de porcentaje de transmitancia y otra logartmica de extincin. Esta ltima escala es la que est linealmente relacionada con la concentracin y se usa en las curvas patrones de concentracin de una muestra problema conociendo su extincin.

Figura 2.0. Relacin entre la absorcin de la luz y la concentracin de una solucin absorbente.

Qu consideraciones se deben tomar en cuenta para elegir un disolvente en la espectroscopia UV? [4]

Las consideraciones que se tienen que hacer al elegir un disolvente no solo con respecto a su transparencia, sino tambin respecto a sus posibles efectos sobre el sistema absorbente. Normalmente, los disolventes polares tales como el agua, alcoholes, steres y cetonas tienden a eliminar la estructura fina del espectro como resultado de los efectos vibracionales. Se observan ms fcilmente en disolventes no polares como los hidrocarburos. Adems, las posiciones de los mximos de absorbancia estn afectados por la naturaleza del disolvente. Entre los disolventes comunes para espectroscopia UV se incluyen el agua, el etanol del 95%, el ciclohexano y el 1,4 dioxano.El disolvente no debe absorber radiacin en las bandas de estudio, de ah la importancia de conocer las transiciones electrnicas de un disolvente.

Sobre el espectro de absorcin del naranja de metilo, bosqueje los espectros que se obtendran si se trabajara con soluciones de mayor y de menor concentracin a la trabajada en esta prctica. [2]Segn la ley de Beer (A=bc) la absorbancia de una sustancia es directamente proporcional a la concentracin de la misma. De esta manera, si se tiene una mayor concentracin de Naranja de metilo en la muestra se obtendr un espectro con una absorbancia mayor ya que habr mayor cantidad de electrones que absorban dicha radiacin, mientras que si se trabaja con una concentracin menor se tendr una absorbancia menor. Lo anterior ocurrir para todas las longitudes de onda trabajadas, por lo cual la curva de la concentracin menor estar por debajo de la curva de la concentracin trabajada, mientras que la curva de la concentracin mayor estar por encima de la curva de concentracin trabajada en la prctica. Si por ejemplo la concentracin mayor es 1.3 veces la concentracin trabajada, como b= cte y para cada longitud de onda c=cte, entonces la absorbancia para cada longitud de onda ser 1.3 veces mayor que la absorbancia obtenida originalmente. Algo similar ocurre a menores concentraciones. Cabe aclarar que estas variaciones de la concentracin deben hacerse en un nivel razonable, de tal manera que la linealidad predicha por la ley de Beer se cumpla en la realidad, es decir, que la absorbancia es proporcional a la concentracin, con constante para un determinado, y as la pendiente (b) es constante, por lo cual se tendra una lnea recta para un especfico , lo cual es vlido slo en cierto rango. Las desviaciones a la ley de Beer ocurren sobre todo para concentraciones altas. Como se est trabajando con partes por milln (ppm), este no es el caso. La situacin explicada se ilustra con la siguiente grfica:

Figura 3.0. Curva de absorbancia en funcin de la longitud de onda para diferentes concentraciones de naranja de metilo.

Las sustancias analizadas en la presente prctica absorben igualmente todas las longitudes de onda? Explique.

No, prueba de ello es que las vemos de diferente color. Los colores que son caractersticos se explican porque las sustancias absorben ciertas longitudes de onda de la luz que incide sobre ellas, y slo vemos aquellas longitudes de onda que no fueron absorbidas, y obviamente estas longitudes de onda transmitidas son diferentes para cada sustancia trabajada en la prctica. Ya que tienen colores muy distintos. Esto es debido a la distribucin electrnica de cada uno de las sustancias evaluadas en esta prctica (Naranja de metilo y Azul de metileno), la cual caracteriza las transiciones electrnicas de la radiacin electromagntica captada por los electrones, que requieren de una cantidad de energa para absorber dicha radiacin y esta vara segn los tipos de enlace que posee cada molcula.

5. ConclusionesConstruir curvas de absorbancia versus longitud de onda para una sustancia en particular permite encontrar la longitud de onda ms apropiada para un anlisis espectroscpico, que generalmente es aquella longitud de onda a la cual se presenta la mayor absorbancia, siempre y cuando en dicha longitud no hayan seales ruidosas ni haya interferencias por parte de otros solutos, entre otras condiciones.A travs de la tcnica de la espectroscopa UV visible es posible caracterizar diferentes sustancias de acuerdo a la radiacin que absorben a ciertas longitudes de onda. Lo anterior nos muestra que puede ser posible identificar sustancias presentes en una muestra a travs de esta tcnica, pero mucho ms til que esto es saber que es factible determinar la concentracin de un soluto en una muestra problema conociendo una curva de calibracin de absorbancia vs concentracin para la longitud de onda ms adecuada en el caso del soluto de inters. Mientras ms alta sea la concentracin de un soluto, ms alta ser la absorbancia de la solucin problema a la longitud de onda apropiada. Esta simple relacin es la base del mtodo espectroscpico en UV visible.Los valores negativos observados en las grficas de absorbancia se pensara que son anormales, pero dichos valores se presentan por la referencia (blanco) tomado, la referencia es tomado como un cero, as que cualquier absorbancia por debajo de la absorbancia referencia es tomado como un valor negativo. La misma explicacin aplica para las grficas de transmitancia, donde se observan valores anormales por encima de 1. Estas anomalas tambin pueden deberse a otras causas como celdas desajustadas o sucias, desviaciones instrumentales, ruidos instrumentales, entre otros.Fue posible comprobar en el laboratorio que el naranja de metilo presenta una longitud de absorbancia ptima muy diferente de la del azul de metilo, corroborndose los valores sugeridos en la gua de la prctica.

6. Bibliografa[1] Consultada: 4 de Mayo de 2013[2] Notas del curso Analisis intrumental. Profesor: Biviana Llano. Gua de laboratorio 2013.[3] Plummer David T. INTRODUCCIN A LA BIOQUMICA PRCTICA. Capitulo 4. Consultado en: < http://www.bioquimica.dogsleep.net/Laboratorio/Plummer/> Mayo 04 de 2013

[4] SKOOG, D.A.; Leary J.J., Holler F. James; PRINCIPIOS DE ANLISIS INSTRUMENTAL, 5ed.; Ed. McGraw-Hill (1998), pgs. 353-367.