UNIVERSIDAD PARTICULAR DE CHICLAYOFACULTAD DE MEDICINA HUMANAASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA

PRACTICA Nº 04 : TÉCNICAS DE SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

I. INTRODUCCION:Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que permiten cultivarlos bajo

condiciones artificiales. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de microbiología consiste en

transferir una muestra microbiológica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que

permite obtener cultivos microbianos.

LA SIEMBRA es el paso inicial en el estudio de las propiedades culturales de un germen. Es el procedimiento por el cual

se pone en contacto el microorganismo con un medio de cultivo, para que en condiciones óptimas de temperatura y

tiempo de incubación pueda desarrollarse y multiplicarse in vitro. La siembra se efectúa utilizando el asa bacteriológica,

que permite una diseminación de los gérmenes en el medio de aislamiento, cuando este es sólido, la misma que deberá

esterilizarse previamente. El fin perseguido es el de conseguir que un germen quede aislado de otro en la superficie del

medio, donde se reproducirá hasta el punto de dar una colonia, cuyos componentes en ultimo termino descienden de

un solo germen (o de un acumulo de gérmenes de un solo tipo).

Esta forma de aislamiento fue un aporte fundamental a la técnica bacteriológica y se debe a Roberto Koch. También

se puede utilizar medios líquidos para cultivos primarios, sobre todo cuando se trate de aislar anaerobios, debiendo

anotarse que en este último caso, no siempre es posible conseguir un cultivo puro.

La práctica pretende dar al estudiante la manualidad necesaria para sembrar muestras en diversos medios y comprender que la meta del trabajo es el aislamiento de los gérmenes.

MODALIDADES DE SIEMBRAS:

Para la diseminación de los microorganismos es necesaria una amplia superficie de medio nutritivo, ésta se logra en las

placas de Petri y en menor medida en el agar inclinado.

La técnica de la siembra en si, consiste en pasar sobre toda la superficie del medio, el instrumento portador del inóculo;

en esta modalidad es recomendada evitar dañar la superficie del medio.

Los tubos y placas petri donde se hará la siembre, se marcan con un lápiz para vidrio poniendo nombre o numero de

registro, fecha u otro dato importante.

Siempre debe trabajarse cerca del mechero para flamear la boca del tubo o la placa Petri con el medio, antes y después de sembrar para evitar contaminaciones.

INCUBACIÓN: Después de la siembra, las placas Petri deben quedar en la incubadora con la tapa hacia abajo, para que el agua de condensación (Desprendida por el calor de la estufa) no malogre la siembra.

LECTURA DE LA SIEMBRA: Esta se realiza entre las 12 y 24 horas tiempo en que aparecen por lo común las primeras

colonias y es cuando comienzan la observación del cultivo.

En las colonias se estudia la forma, tamaño, contorno, coloración, emulsionabilidad, grado de opacidad, superficie y

consistencia.

En

los medios líquidos se observa el grado de turbidez o la formación de una película sobre el medio.

Uno de los caracteres fundamentales en una colonia es el referente a su contorno y superficie. Las colonias de contorno regular y superficie lisa, se llaman colonias S (de la palabra inglesa Smooth que significa suave - liso). Las de contorno y superficie irregulares, se llaman colonias R (de Rouge que significa rugoso). Estos aspectos tienen relación con la virulencia de algunos gérmenes.

TRANSPLANTE O RESIEMBRA:El estudio macroscópico de las colonias se completa con un estudio microscópico que se realiza emulsionando una

fracción de la colonia en una pequeña gota de suero fisiológico cuidando que la extensión sobre la lámina sea fina. Se

fija, se colorea y se observa con aceite inmersión.

Luego se procederá al trasplante o resiembra que consiste en tomar con el asa la fracción de la colonia elegida (repicaje

de colonias) y llevar este inóculo a otro medio liquido o sólido en el que se obtendrá el desarrollo de una sola especie de

gérmenes, lo cual constituye la fase final del proceso de aislamiento. El germen aislado en estado de pureza constituye

una cepa,

Los procedimientos de siembra en los trasplantes varían según el medio que se va a usar.

Si el medio es liquido, bastará tocar la superficie de este con el inoculo.

Si el medio es sólido varia la forma de siembra siendo en unos casos por estría, o sea pasando el inóculo en zig-zag sobre

la superficie del medio inclinado, y en otros por punción o picadura, que consiste en introducir la aguja hasta el fondo o

a poca profundidad según la naturaleza del medio.

El asa se esteriliza al rojo antes y después de su empleo.

II. COMPETENCIAS:

- Al término de la practica el alumno debe:

- Adquirir la manualidad y destreza en la siembra de microorganismos que le permitan la obtención de cultivos puros.

- Obtiene cultivos puros mediante trasplante en caldo, Agar inclinado y agar por picadura.

III MATERIAL:

- Material Biológico: Muestras de Orina y Heces

- Asa bacteriológica en anillo y en punta,

- Mechero.

- Tubos con suspensión bacteriana

- Placas de Agar Nutritivo

- Placas con Agar Mc Conkey

- Placas con Agar XLD

- Placas con Agar SS

- Tubos con Caldo Nutritivo estéril.

- Tubos con Agar TSI

- Tubos con Agar LIA

- Tubos con Agar SIM

- Tubos con Agar Citrato

- Tubos con Agar Urea

IV. PROCEDIMIENTOS :

a. MÉTODO DE AISLAMIENTO .-

AISLAMIENTO POR DISEMINACIÓN (método en superficie).

Muestra: Orina

- Esterilizar un asa bacteriológica y dejar enfriar por 5 seg.

- Introduzca el asa bacteriológica y retire una asada de la suspensión bacteriana.

- Flamear los bordes de una placa de agar Mc Conkey. Levante la tapa de la placa justamente lo necesario para

introducir el asa bacteriológica cuya carga es diseminada por la superficie del agar mediante el proceso de

“estriación por agotamiento”. Según esto la primera estriación contendrá más cultivo que la segunda, esta más que

la tercera y así sucesivamente de modo que en las últimas estará suficientemente agotado para dar colonias

aisladas.

- Marcar las placas sembradas, con plumón indeleble, a fin de que permitan su identificación posterior.

- Incubar las placas en posición invertida a 37ºC por 24 hs.

- Realizar el “estudio de las colonias” y/o realice el “Transplante” de las colonias para obtener cultivos puros.

Para sembrar en placa Petri es importante que la superficie del medio este completamente seca, para conseguir esto las placas deben quedar en reposo durante 2 reposo.

AISLAMIENTO POR DISEMINACIÓN (método en superficie).

Muestra: Heces

- Esterilizar un asa bacteriológica y dejar enfriar por 5 seg.

- Introduzca el asa bacteriológica y retire una asada de la suspensión bacteriana.

- Flamear los bordes de una placa de agar XLD. Levante la tapa de la placa justamente lo necesario para introducir el

asa bacteriológica cuya carga es diseminada por la superficie del agar mediante el proceso de “estriación por

agotamiento”. Según esto la primera estriación contendrá más cultivo que la segunda, está más que la tercera y así

sucesivamente de modo que en las últimas estará suficientemente agotado para dar colonias aisladas.

- Marcar las placas sembradas, con plumón indeleble, a fin de que permitan su identificación posterior.

- Incubar las placas en posición invertida a 37ºC por 24 hs.

- Realizar el “estudio de las colonias” y/o realice el “Transplante” de las colonias para obtener cultivos puros.

b. MÉTODOS DE TRANSPLANTE:

SIEMBRA POR ESTRÍAS EN AGAR INCLINADO:

- Esterilizar una aguja bacteriológica. Dejar enfriar 5sg.

- Tomar con la mano izquierda un tubo con suspensión bacteriana en desarrollo, y homogenizar.

- Tomar un tubo con agar inclinado (citrato): con el dedo meñique de la mano derecha quite el tapón de algodón;

flamee la boca del tubo; introduzca la aguja bacteriológica que contiene la colonia y realice la siembra por “estrías

sobre la superficie del agar inclinado”

- Retire la aguja bacteriológica, vuelva a flamear el tubo por sus bordes y coloque de nuevo el tapón de algodón.

Deje el tubo en la gradilla.

- Marcar los tubos a fin de identificarlos posteriormente.

- Incubar los tubos sembrados a 37ºC durante 24 hs.

- Realice el estudio de las características del cultivo.

SIEMBRA EN SUPERFICIE Y PICADURA:

El inóculo es introducido con el asa recta hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado en hacer el mismo trayecto de entrada que de salida, se retira hacia la superficie inclinada del agar haciendo suavemente una estría ondulada. Debe flamearse la boca del tubo antes y después de la siembra.

SIEMBRA EN AGAR POR PICADURA:

- El inóculo es introducido con el asa recta hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado en

hacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Debe flamearse la boca del tubo antes y después de la siembra

- Esterilizar una aguja bacteriológica. Dejar enfriar 5sg.

- Tomar con la mano izquierda una placa con colonias en desarrollo

- Coger una asada de la colonia sospechosa con una asa en punta

- Tomar un tubo con agar no inclinado y con el dedo meñique de la mano derecha quite el tapón de algodón; flamee

la boca del tubo; introduzca la aguja bacteriológica que contiene la colonia y realice la siembra por “picadura en el

agar profundo”.

- Retire la aguja bacteriológica; vuelva a flamear el tubo por sus bordes y coloque de nuevo el tapón de algodón deje

el tubo en la gradilla.

- Marcar los tubos a fin de identificarlos posteriormente.

- Incubar los tubos sembrados a 37ºC durante 24 horas.

- Realice el estudio de las características del cultivo.

SIEMBRA EN CALDO

- Esterilizar una aguja bacteriológica. Dejar enfriar 5 seg.

- Tomar con la mano izquierda una placa con las colonias en desarrollo, flamee los bordes de la plazca y

levante justamente lo necesario para introducir la aguja bacteriológica y extraer una colonia.

- Tomar un tubo con caldo nutritivo; con el dedo meñique de la mano derecha quite el tapón de

algodón, flamee la boca del tubo, introduzca la aguja bacteriológica que contiene la colonia y realice la

siembra por “suspensión en el medio liquido”.

- Retire la aguja bacteriológica; vuelva a flamear el tubo por sus bordes y coloque de nuevo el tapón de

algodón. Deje el tubo en la gradilla.

- Marcar los tubos a fin de identificarlos posteriormente.

- Incubar los tubos sembrados a 37ºC durante 24 horas.

- Realice el estudio de las características del cultivo.

- Anotar los resultados

CUESTIONARIO:

1. Qué diferencias hay entre siembra por difusión y siembra por diseminación-

2. Cuál es el objetivo de la siembra de microorganismos

3. Qué métodos utilizaría para cultivar y aislar microorganismos anaerobios

4. A qué se llama unidad formadora de colonia

5. DEFINIR: SIEMBRA BACTERIANA

Concepto de siembra:

En Microbiología se entiende como siembra el proceso mediante elcual se deposita una pequeña

cantidad de microorganismos(inóculo) en un medio de cultivo estéril. El inóculo puede procederde

una muestra o de un cultivo previo. (al crecimiento demicroorganismos obtenido, se le denomina

cultivo)La finalidad de la siembra es permitir la multiplicación de losmicroorganismos, al

proporcionarles las condiciones óptimas parasu desarrollo, dentro de las cuales, se debe

considerar:temperatura, nutrientes, pH, disponibilidad de oxígeno, entre otros.La siembra de

microorganismos debe llevarse a cabo coninstrumentos y medios previamente esterilizados

trabajandosiempre bajo condiciones de asepsia, lograda por medio de unmechero Bunsen que,

debido a las corrientes de convecciónverticales que genera, es capaz de crear un ambiente

estéril en lazona inmediatamente alrededor y debajo de la llama

Siembra Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo)

en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y

multiplicación. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura

adecuada para el crecimiento. Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:

Que se efectúen asépticamente Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar

estén esterilizados Que se realicen solo los manipuleos indispensables Que se trabaje

fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un mechero o bien Flujo laminar.

Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los requerimientos del

microorganismo a estudiar.

6. Cuáles son los requerimientos indispensables para el desarrollo in vitro de los microorganismos

7. Esquematice y explique la curva de crecimiento bacteriano