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AISLAMIENTO DE ARN EN LEVADURAS

1. OBJETIVOS1.1 Aislar ARN a partir de levadura Saccharomyces cerevisae seca

2. INTRODUCCION El ARN, a diferencia del ADN, se distribuye en toda la clula. La mayora del ARN se encuentra en el citoplasma como ARN soluble ribosomal, pero aproximadamente el 10% se encuentra en el ncleo y un poco cantidad se halla en las mitocondrias. Para que le ADN y ARN pueda ser analizados y estudiados por los diferentes mtodos propuestos, es necesario que previamente stas macromolculas sean aisladas de la estructura celular.Segn el mtodo de extraccin, el mtodo PLUMMER, el ARN se obtiene de un homogenizado de clulas de levaduras al cual se le agregar una solucin de fenol concentrada. Esta solucin de fenol concentrada rompe los enlaces de hidrgeno en la macromolcula, causando desnaturalizacin de la protena. La suspensin turbia se centrifuga y aparecen dos fases: la fase inferior de fenol contiene ADN y la superior acuosa contiene carbohidratos y ARN. La protena desnaturalizada se halla presente en ambas fases y puede removerse por centrifugacin. El ARN se precipita luego con etanol. El producto obtenido no contiene ADN pero generalmente est contaminado con polisacridos. Se puede obtener mayor purificacin tratando esta preparacin con amilasa.Para determinar la presencia de ARN extrado se puede utilizar mtodos espectrofotomtricos como la absorcin ultravioleta (basado en el gran poder de absorcin de los cidos nucleicos en la regin UV del espectro), mtodos qumicos colormetros (basados en la capacidad de determinados compuestos para formar complejos carnognicos al reaccionar con los cidos nucleicos).La presente experiencia de laboratorio tiene como finalidad extraer o aislar ARN de clulas de Saccharomyces cerevisae levadura de pan o vino. El reactivo de orcinol, en presencia de cloruro frrico como catalizador, reacciona con furfural, formado por calentamiento de la pentosa con HCLcc, para dar un color verde3. MATERIAL METODOS3.1 Material Biologico:Levadura Saccharomyces cerevisae (10g de levadura seca)

3.2. Reactivos y solucionesSolucin concentrada de fenolAcetato de potasio al 20%Alcohol etlico comercialMezcla etanol:agua (3:1)Reactivo orcinolAgua destilada

3.3. Material y equipos de laboratorioBalanza y centrifugaBagueta y gotero de punta finaVaso de PPPipetasTubos de ensayosBao mara

4. PROCEDIMIENTO:4.1. AISLAMIENTO DE ARN Suspender 10g de levadura seca activa en 40 ml de agua destilada a 37C e incubar por 15 minuto a esta temperatura Retira el beaker, agregar 5oml de solucin concentrada de fenol (muy corrosivo) y agitar mecnicamente la suspensin durante 30 minutos a T ambiente Centrifugar en frio a 4000 rpm durante 10 minutos para romper la emulsin Con una pipeta de punta fina trasvasar cuidadosamente la capa superior acuosa a un tubo de ensayo y centrifugar en frio a 4000 rpm durante 10 minutos ms para separar la protena desnaturalizada Medir el volumen de sobrenadante obtenido, trasvasar a un beaker de 100 ml y agregar acetato de potasio al 20% hasta obtener una concentracin final de 2% (20g/L) de la sal Precipitar el ARN aadiendo dos volmenes de alcoholo etlico comercial. Lugo, colocar el sistema en hielo y dejarlo all por una hora (este tiempo estar en funcin de una franca y mayor precipitacin del ARN) Separar el precipitado por centrifugacin en frio a 3500 rpm por 5 minutos. Opcionalmente, se puede eliminar por decantacin una cantidad prudencial del volumen total antes de centrifugar Lavar el precipitado con 8ml de una mezcla etanol:agua (3:1), disolviendo con una bagueta y centrifugar a 3500 rpm por 5 minutos Lavar el precipitado con 8ml de etanol, centrifugar a 3500 rpm por 5 minutos y eliminar el sobrenadante, el precipitado es ARN

4.2. EVALUACION DEL AISLAMIENTO DE ARN (REACCION DE ORCINOL)COMPONENTES (ml) Y PROCESOSISTEMA (Tubos)

12

Agua destilada11

Precipitado (ARN)pizca------

Reactivo orcinol 11

Calentar en bao de agua de ebullicin por 5-10 minutos. Retirar los tubos y enfriar

Agua destilada22

Mezclar y observar una coloracin verde la cual indica presencia de ARN

La intensidad del color verde estar expresada que tanto se ha aislado el ARN5. ESQUEMA.

6. RESULTADO

7. DISCUSION.

8. CONCLUSION.

9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.

10. CUESTIONARIO.1. Cul es el efecto del fenol sobre las levaduras?2. Porqu se utiliza el acetato de potasio en la extraccin del ARN?3. Cul es el efecto del etanol en el proceso de extraccin del ARN?4. Cules son los constituyentes del ARN?5. Porqu se emplea el reactivo de orcinol?6. Qu tipos de ARN conoces? Seale las caractersticas de cada uno de ellas 7. Todos los organismos vivos presentan ARN? 8. Cul es el papel biolgico del ARN?9. en qu se diferencia las molculas de ARN de la ADN?10. A qu se debe la coloracin verde luego de adiciona el reactivo de orcinol?