Universidad Industrial de Santander- Facultad de SaludEscuela de Bacteriología y Laboratorio Clínico

Programa de Microbiología y BioanálisisAsignatura: Biología molecular

TALLER No 2: EL USO DE LAS MICROPIPETAS

En el laboratorio, la habilidad para medir de manera exacta y reproducible y transferir volúmenes pequeños de líquidos son críticos para obtener resultados útiles. Para los volúmenes menores de 1 mL, el método más común para medir líquidos requiere el uso de un dispositivo conocido como micropipeta.

PAUTAS GENERALES Revisar la pipeta al inicio del día de trabajo para retirar suciedad y polvo Ajustar el volumen en el rango especificado para la pipeta. No Trate de colocar la

micropipeta para volúmenes mayores que el máximo, o para volúmenes menores del cero, esto descalibrará y dañará la micropipeta.

Sujetar la pipeta de forma que el reposamanos de la pipeta descanse sobre el dedo índice

Para maximizar exactitud, la pipeta, la punta y el líquido deben estar a la misma temperatura. La temperatura de los líquidos debe estar entre 15 y 40 º C.

Comprobar que las puntas son las adecuadas para la pipeta y que está correctamente ajustada. Toda micropipeta utiliza puntas desechables. Usar las puntas una sola vez

No volver la pipeta del revés, de forma que el líquido de la punta afecte al interior de la pipeta.

No utilizar la micropipeta con líquidos que atacan el polipropileno. No utilizar líquidos que estén emitiendo vapores. Evitar contaminaciones de las puntas usando el eyector y los guantes Si es usada inadecuadamente, la micropipeta transferirá volúmenes inexactos. Calibrar las pipetas de forma regular, al menos una vez al año

TÉCNICAS DE PIPETEO

Características de las micropipetas usadas en biología molecular, mecanismo de acción.1: posición normal; 2: primer tope; 3: segundo tope

1 2 3

Pipeteo Normal: Recomendada para soluciones acuosas como tampones, ácidos diluidos y bases.

Pipeteo Reverso: Esta técnica se usa para pipetear soluciones con una gran viscosidad o tendencia a formar espuma. Sólo se puede realizar con pipetas de desplazamiento de aire. Para soluciones de alta viscosidad el llenado y la expulsión deben ser más lentas.

Pipeteo Repetitivo: Esta técnica está especialmente indicada para pipeteo repetido del mismo volumen.

Pipeteo de muestras heterogéneas: Esta técnica está especialmente indicada para pipeteo de muestras viscosas en las que no se puede lavar previamente la punta con la muestra y se necesita pipetear el volumen total disponible. Por ejemplo, sangre o suero

METODO DE CALIBRACIÓN DE LA MICROPIPETAS POR GRAVIMETRIA

Evalúa el estado de precisión y exactitud que presentan las micropipetas, utilizadas en los laboratorios de biología molecular, basado en la determinación del método gravimétrico:

La densidad del agua es 1 g/mL a 25 º C, por lo tanto un volumen de 1 mL corresponde aproximadamente a una masa de 1 g, 300 µL a 0.3 g, 200 µL a 0.2 g, 60 µL a 0.06 g, 10 µL a 0.01 g y 3 µL a 0.003 g.

Entonces en teoría cada μl de agua deberá pesar 0.001g.

De esta manera, mediante la determinación del peso de cada volumen medido con una pipeta, podríamos correlacionar el valor teórico contra el valor medido por gravimetría y evaluar el porcentaje de inexactitud y de imprecisión.

Realice N mediciones seriadas a 100, 50 y 20% del volumen nominal medible por la pipeta dado el caso de que sea con volumen ajustable.

Pipeteo Normal: S/n acuosas

Pipeteo Reverso : S/n viscosa o espumosa

Pipeteo Repetitivo Pipeteo de muestras heterogéneas

MODELO%

VOLUMEN TEORICO

VOLUMEN GRAVIMETRICO

 

100         

50         

20      

   Exactitud: Es el grado en que el valor medido se aproxima al valor correcto. Usualmente se expresa en porcentaje de error.

… Determine el porcentaje de inexactitud, para la pipeta utilizada

% Exactitud = Valor obtenido – Valor gravimétrico *100 Valor gravimétrico

… Determine la precisión con que trabaja la pipeta utilizada

1- Calcular la media:

(X1 + X2 + X3 + X… Xn) / n

2- Calcular la varianza:

Suma (X1 - Media)2 / n – 1

3- Desviación estándar

Raíz al cuadrado de la Varianza.

La desviación estándar nos permite determinar el grado de dispersión que podrían tener los datos medidos con respecto a la media, estos datos no deberán ser mayores a dos desviaciones estándar para contener un 95% de reproducibilidad.

TALLER DE REPASO N° 3: MUESTRAS USADAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR

Para el desarrollo práctico de Biología Molecular y cualquier proceso analítico se han determinado 3 fases claves:

PREANALITICA ANALITICA POSANALITICA

Para las cuales se ha definido y sintetizado un: “Esquema unificado del proceso analítico que sufre una muestra”

El proceso de análisis en Biología Molecular está basado en la evaluación de tres moléculas fundamentales obtenidas a partir de muestras que deben poseer características especiales:

Proteína

…1. Seleccione un tipo de muestra y describa sus características necesarias para ser usada en Biología Molecular?

2. Las diversas muestras utilizadas en biología molecular para el diagnóstico clínico requieren de extracción y análisis de ADN/ARN, proteínas y/o macromolecular. Como en todo proceso analítico se desarrollan 3 fases, la preanalitica, analítica y post analítica. Escoja una muestra biológica y ejemplifique con ella las tres fases.

3. Nombre 3 variables que pueden afectar la muestra en la fase preanalitica. Explique.

4. Con el avance de la tecnlogia hoy en día es posible hacer un diagnostico temprano de anormalidades fetales. Para ello se utilizan diferentes ripos celulares u tejido embrionario. Cuáles células/tejido pueden ser usados. Descríbalos y explique su uso.

5. Se necesita realizar extracción de ADN con el fin de hacer la identificación de un cuerpo encontrado en la escena de un crimen. Al parecer lleva más de dos días sin vida

MUESTRA

STEJID

OSSUSPENSIÓNDISOCIA

CIÓN SEPARACIÓN SEGÚN TIPOS

VIABILIDAD Y CARACTERIZACIÓNLISISFRACCIONA

MIENTO

TRAT. ADICIONAL

ESEXTRACCIÓN

CONSERVACIÓN ANÁLIS

IS

ADN

ARN

con lo cual una muestra de sangre periférica no sería adecuada. De mayor a menor concentración de ADN enliste los tejidos que podrían ser utilizados para extraer ADN.

“Tras la obtención de una muestra ideal y para el desarrollo de un proceso analítico óptimo, es indispensable el manejo y estudio adecuado de cada uno de los componentes,

materiales y equipos que serán utilizados”

Uno de los equipos más influyentes, con mayor utilidad y determinantes durante ensayos que requieren mucha precisión, son “la pipetas” y/o “micropipetas”.

…2. Cuáles son los tipos de pipetas, sus usos y aplicaciones en la Biología Molecular?