UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCAFACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

Escuela Acadmico Profesional De Ingeniera En Industrias Alimentarias

INFORME DE PRACTICA N4: Factores Fsico-Qumicos Que Modifican La Velocidad De Las Reacciones Enzimticas

CURSO: Bioqumica-Practica

ALUMNO: Chamay Cuzco Luis Miguel

PROFESOR: Urrugarra Abanto Salomn

CICLO: 2014-III

Cajamarca, Mayo del 2014

FACTORES FSICO-QUMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMTICAS

I. RESUMEN:Se realiz el anlisis de la dependencia de la velocidad de reaccin en funcin de la cantidad enzimtica (composicin), de la temperatura y del pH. As mismo se analiz la especificidad de la accin enzimtica, empleando la presencia de amilasa salival solucin de almidn. Los resultados obtenidos demostraron que la velocidad enzimtica se ve influenciada por la cantidad de enzima presente en solucin. Las grficas que se producen nos muestran el porcentaje de la velocidad de reaccin con los factores fsico-qumicos (iones activadores, pH, concentracin de enzima, concentracin de sustrato, tiempo y temperatura), lo cual permite pensar que con la cantidad de concentracin de la enzima el tiempo de que se necesita para transformar el sustrato en producto es menor o mayor en la actividad enzimtica. Estos ltimos resultados son consistentes por el hecho que las enzimas son catalizadores biolgicos de una reaccin. As mismo se demostr que latemperatura tiene un efecto importante enla velocidad enzimtica. Si la temperatura aumenta considerablemente la reaccin puede no producirse debido a la desnaturalizacin de la enzima. Si la temperatura esalta y propicia se obtienen los productosde la accin enzimtica sobre el sustrato, siendo 38 a 37C la temperatura ptima para la accin enzimtica del almidn. De igual forma se pudo observar que la reaccin enzimtica tambin se ve influenciada por el cambio del pH del medio hasta alcanzar un pH ptimo, el cual para amilasa salival est alrededor de 5 a 9 cerca del pH neutro lo que no sucede con un pH muy bsico o muy acido ya que estas condiciones pueden desnaturalizar a la enzima. Estos resultados son consistentes pues en el ser humano la enzima amilasa salival as como muchas enzimas ubicadas en los tejidos sensitivos por lo general actan en pH neutro. Este resultado puede ser ubicado en lapunta de la campana. Finalmente se pudo comprobar la especificidad enzimtica de la amilasa salival el almidn, en la descomposicin del almidn en maltosa y glucosa.II. INTRODUCCIN:La temperatura la concentracin de sustrato, enzima y la concentracin de iones hidrogeniones son algunos de los factores que actan directamente sobre la actividad enzimtica, produciendo consecuencias particulares segn el efecto que tienen sobre la enzima, ya sea favoreciendo, retardando o impidiendo su actividad.El efecto que produce estos factores sobre las enzimas es diferente en cada una de ellas, pues dependen de gran parte de las condiciones en las que se realiza dicha reaccin.Para estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros permanezcan constantes, de tal manera que la investigacin del factor variable no se vea afectado por las variaciones que pudieran sufrir los otros.La finalidad de estos experimentos es observar el efecto de iones activadores, pH, concentracin de enzima, concentracin de sustrato, tiempo y temperatura sobre la velocidad de una reaccin enzimtica, tomando como ejemplo la hidrolisis enzimtica del almidn y evaluando las variaciones del sustrato transformado y de los productos de la reaccin enzimtica. A. OBJETIVOS:Objetivo general: Armado el sistema amilasa salival + almidn, de acuerdo a las especificaciones, se demostrara las modificaciones de las reacciones enzimticas por accin de diversos agentes fsico-qumicos a travs dela determinacin de sustrato residual (solucin yodada) y de los productos (solucin cprico-alcalina y solucin fosfomolbdica); cuyos cambios de color sern valorados en relacin a un tubo patrn. Objetivos especficos: Demostrar la importancia de la coenzima en el Sistema Enzimtico para la velocidad de la reaccin. Verificar que la reaccin enzimtica es lenta en un medio acido o en un medio bsico. Comprobar que a una temperatura muy alta la enzima se desnaturaliza o muy baja, la enzima se inhibe.

B. MARCO TERICO Coenzima Adems del componente proteico, muchas enzimas requieren constituyentes no proteicos para su funcin como catalizadores. Estas sustancias accesorias reciben diversos nombres, como grupo prosttico, cofactor o coenzimas. El grupo prottico es cualquier porcin no aminoacdica de una protena que confiere a esta alguna propiedad especial. Los cofactores son pequeas molculas esenciales para la catlisis. El termino coenzima se aplica a molculas orgnicas, derivadas a menudo de una vitamina, y que son esenciales para la actividad de una enzima. Algunas coenzimas se hallan estrechamente unidas a la porcin proteica de una determinada enzima; esta puede desnaturalizarse si se intenta separar la coenzima. En otras ocasiones, la coenzima est unida de forma tan dbil que la simple dilisis la separa de la coenzima. Las coenzimas s participan en la actividad cataltica.La teora cintica conocida tambin como teora de colisiones como de la cintica qumica establece que para que dos molculas reaccionen deben; deben aproximarse entre s a la distancia de formacin del enlace, o bien, chocar; y deben poseer suficiente energa cintica para superar la barrera de energa y alcanzar el estado de transicin. Por lo tanto, se deduce que cualquier cosa que incrementa la frecuencia o energa de colisin entre los sustratos aumenta la velocidad de la reaccin en la que participa. Estos factores son:a. Concentracin del in hidrogeno (pH):

La velocidad de casi todas las reacciones catalizadas por enzimas depende de manera importante de la concentracin del in hidrogeno. La mayor parte de las enzimas intracelulares muestran actividad ptima a valores de pH entre 5 y 9. La relacin entre la actividad y la concentracin del in hidrogeno refleja el equilibrio entre la desnaturalizacin de la enzima a pH alto o bajo y los efectos en el estado cargado de la enzima, de los sustratos, o de ambos.

Para las enzimas cuyo mecanismo tiene que ver con la catlisis cido-bsica, los residuos que intervienen deben estar en el estado apropiado de protonacin para que proceda la reaccin. La ganancia o prdida de grupos importantes con carga afecta de manera adversa la unin del sustrato y, por consiguiente, retarda o anula la catlisis. b. Concentracin de sustrato:

Cuando la concentracin de la enzima se mantiene constante y se va incrementando la concentracin del sustrato, se obtiene una grfica hiperblica. Inicialmente, la velocidad de la reaccin vara proporcionalmente a la concentracin de sustrato obtenindose una lnea recta (reaccin de primer orden). Luego el incremento de la velocidad de la reaccin va disminuyendo al incrementarse la concentracin de sustrato, llegando un momento en que no hay incremento y la velocidad se hace constante. Michaelis Menten describieron esto como una transicin de la velocidad de una fase dependiente del sustrato a otra que es independiente. La concentracin de sustratos que corresponde a la mitad de la velocidad mxima, la que es una constante recibe el nombre de Km o constante de Michaelis Menten. Esta contante mide la afinidad de la enzima por el sustrato: cuanto menor es la contante, es mayor la afinidad de la enzima por el sustrato.

Cintica de Michaelis-Menten.

Las reacciones enzimticas se caracterizan porque aunque se aumente la concentracin de sustrato la velocidad no aumenta linealmente, aparece un efecto de saturacin. La saturacin se debe a que todos los centros activos estn ocupados. La velocidad depende de la cantidad de enzima con sustrato suficiente. Consideraremos solo la velocidad inicial de las reacciones para cada concentracin de sustrato cuando se construya una grfica, evitando el error introducido por el deterioro de la enzima. Como en el primer momento no hay producto no consideraremos la reaccin contraria.

V

La velocidad depende de una contante de velocidad K y de su inversa. c. Temperatura:En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones qumicas: por cada 10C de incremento, la velocidad de reaccin se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser protenas, a partir de cierta temperatura, se empieza a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad cataltica es mxima se llama temperatura ptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de la velocidad de reaccin debido a la temperatura es contrarrestado por la prdida de la actividad cataltica debida a la desnaturalizacin trmica, y la actividad enzimtica decrece rpidamente hasta anularse. Velocidad Mxima Temperatura ptimaEfecto de la Temperatura Velocidad de ReaccinTemperatura

III. MATERIALES Y MTODOS: A. Materiales: Gradilla 6 de ensayo Incubadora para Bao Mara a 37C Cocina elctrica

B. Reactivos a utilizar: Solucin de Almidn 1% Buffer fosfato 0.1 M pH 6.6 Buffer acetato 0.1 M pH 3.6 Buffer fosfato 0.1 M pH 10.0 Solucin Cloruro de Sodio al 2% Amilasa cido Clorhdrico al 0.05N Solucin Yodada (yoduro de potasio) Solucin cprico alcalina Solucin fosfomolbdica Agua destilada

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:Armar el siguiente sistema:ETAPA A:COMPONENTESSISTEMA

IIIIIIIVVVIVIIVIII

Solucin de almidn al 1% 1.01.02.01.01.01.01.01.0

Buffer acetato 0.1 M pH 3.6--5.0----

Buffer fosfato 0.1 M pH 6.65.05.05.0-5.0-5.05.0

Buffer fosfato 0.1 M pH 10.0-----5.0--

Solucin cloruro de sodio al 2%1.41.41.41.41.41.41.4

Agua destilada2.63.01.61.61.61.60.61.6

Preparado enzimtico1.01.01.01.01.0-1.0

Preparado enzimtico hervido ------1.0-

Mesclar y colocar los tubos del I al VII a Bao Mara 37, por 30 minutos para el equilibrio de la temperatura. El tubo VIII en agua helada entre 0 y 4 durante 30 minutos. Mezclar y continuar la incubacin. Los controles de la actividad enzimtica. Por el sustrato residual, se realiza en toda la serie de tubos del I al VIII a los 30 minutos de incubacin. CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL.El control del sustrato no transformado se realizara por la accin del yodo, de la siguiente manera:Cumplidos los 30 minutos de la incubacin, sacar los tubos del Bao Mara de la etapa A (de las temperaturas correspondientes) y luego armar una serie paralela de tubos marcados del I al VIII, agregando a cada tubo marcado 01 ml del incubado de su correspondiente tubo. ETAPA B:COMPONENTES SISTEMA

IIIIIIIVVVIVIIVIII

Incubado correspondiente de cada uno de los tubos 1.01.01.01.01.01.01.01.0

cido clorhdrico 0.05N 5.05.05.05.05.05.05.05.0

Solucin yodada 0.50.50.50.50.50.50.50.5

Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos, valorando los cambios de coloracin.CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS.El control de los productos formados se har en base a la capacidad reductora de estos (glucosa, maltosa) de la siguiente manera:Armar el siguiente sistema:ETAPA C:IIIV

Incubado correspondiente a los tubos III y V de la Etapa A1.01.0

Solucin cprico alcalina 1.01.0

Mezclar y poner en BAO MARA HIRVIENDO, sacar los tubos y enfriar con agua corriente. Agregar:IIIV

Solucin fosfomolbdica1.01.0

Agua destilada 5.05.0

Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos valorando los cambios de coloracin.

IV. CUESTIONARIO:1. Identifique en cada uno de los tubos el factor fsico-qumico que interviene modificando la velocidad enzimtica?

En el tubo I el factor fsico-qumico es la falta de concentracin de enzima (amilasa salival) para que se produzca la actividad enzimtica.

En el tubo II y VI hay intervencin del factor de la temperatura, pH, concentracin de sustrato en niveles ptimos para la velocidad de reaccin.

En el tubo III el factor que interviene es la concentracin de sustrato (concentracin de sustrato elevada), disminuyendo la velocidad de reaccin.

En los tubos IV y VI el factor que interviene es el pH (en el tubo IV muy bsico y en tubo VI muy acido), disminuyendo la velocidad de la reaccin.

En el tubo VII el factor que interviene es la temperatura (temperatura elevada), produciendo una desnaturalizacin de la enzima y no habiendo actividad enzimtica.

En el tubo VIII el factor que interviene es la temperatura (baja temperatura), produciendo la inactivacin de la enzima.

2. Explique usted que finalidad tiene la utilizacin de la solucin yodada.

La finalidad de la solucin yodada es de identificar si ha habido actividad enzimtica en la reaccin, produciendo un color azul (caracterstico del yodo) al contacto con sustrato mas no con el producto formado.

3. Explique usted que finalidad tiene la utilizacin de la solucin cprica alcalina.

La finalidad de la solucin cprica al igual que el Benedict es identificar la presencia de azucares reductores como la maltosa y glucosa en las reacciones desarrolladas, que precipita de la solucin alcalina comoCu2Ode color rojo-naranja, lo cual nos dice si es que hay actividad enzimtica en la reaccin.

4. Explique usted que finalidad tiene la utilizacin de la solucin fosfomolbdica.

No se logro determinar por la causa de los factores externos en la reaccin.

5. Explique los resultados obtenidos.

Los resultados obtenidos en cada sistema explican la relacin que existe entre los factores fsico-qumicos (iones activadores, pH, concentracin de enzima, concentracin de sustrato, tiempo y temperatura) con la velocidad de la actividad enzimtica, por ejemplo los colores como el azul es caracterstico de que no hubo actividad enzimtica, el color marrn muestra una actividad enzimtica lenta, el color amarillo muestra una actividad enzimtica acelerada, estos resultados son producidos por los factores antes mencionados que se explicara en los resultados.

6. Diga usted cuales son los componentes estructurales del almidn.

El almidn es la principal molcula de almacenamiento en los vegetales. Es un polisacrido compuesto de largas cadenas de subunidades de glucosa. En los animales el exceso de glucosa se almacena tambin como glucgeno, tambin carbohidrato; glucosa; glucgeno. Las molculas del almidn son de dos tipos. En el primero, la amilosa, que constituye el 20% del almidn ordinario, los grupos C6H10O5 estn dispuestos en forma de cadena continua y rizada, semejante a un rollo de cuerda; en el segundo tipo, la amilopectina, se produce una importante ramificacin lateral de la molcula.

7. Diga usted a que se llama amilasa salival dializada y cul es su accin sobre el almidn.

La amilasa salival dializada es la enzima diluida en agua pura para poder acelerar la actividad enzimtica, ya que ayuda a romper los enlaces qumicos existentes entre los monosacridos.Podemos analizar que cuando la enzima es calentada previamente esta pierde su actividad enzimtica, ya que al ser hervida esta se desnaturaliza por lo cual no puede actuar sobre el almidn para hidrolizarlo y por eso se presenta el color azul, lo que sucede es que la -amilasa salival del almidn se disuelve en agua y de esta manera adquiere una estructura secundaria caracterstica de forma helicoidal, en la que cada vuelta de hlice comprende seis unidades glucosa y los grupos hidroxilo quedan hacia afuera, esta estructura secundaria es la que permite que el yodo penetre en el interior del helicoide y esto a la ves es lo que le da el color azul a la solucin, lo cual permite la identificacin del almidn. V. EVALUACIN DE RESULTADOS:Al realizar la practica obtenemos las grficas que estn en relacin entre la velocidad de reaccin (%) y los factores fsico-qumicos (pH, temperatura, concentracin de sustrato y ion cloruro de sodio).Los valores mostrados en las tablas no son valores reales, sino que son dados para dar una explicacin a cada factor en relacin a la velocidad de las reacciones enzimticas.

Grafica N1: en esta grafica se muestra que la velocidad de la reaccin enzimtica es alterada por los niveles de pH ya que tiene que estar en pH ptimo entre 5 a 9.

Grafica N2: la siguiente grafica muestra la alteracin que sufre la velocidad de reaccin y actividad enzimtica al ser sometida a diferentes temperaturas lo que produce que la enzima se pueda inhibir, reaccionar adecuadamente o desnaturalizarse.

Grafica N3: En esta grafica identificamos que la alta concentracin de sustrato al igual que los dems factores afecta la velocidad de la reaccin enzimtica, este factor produce que la reaccin sea ms lenta.

Grafica N3: Con este grafico comprobamos que la presencia de aniones como el cloro aumenta la velocidad de reaccin enzimtica.

VI. DISCUSIN DE RESULTADOS:Al analizar los resultados de cada factor del pH, obtenemos que al utilizar un pH bsico, no hay actividad enzimtica, esto se debe a que la enzima al someterla a un pH muy bsico (3.6) se desnaturaliza; utilizando un medio de pH optimo (6.6) la enzima va a desarrollar una velocidad de reaccin enzimtica alta y al someterla a un medio de pH muy acido (10) al igual que con el pH bsico la enzima se va a desnaturalizar. En los casos de pH de 3.6 y 10.0, al hacerlo reaccionar con los indicadores como el Benedict y la solucin yodada en la etapa B dan un color azul que es la indicacin de que no hay actividad enzimtica por lo que no hay velocidad de reaccin; lo contrario sucede con el de pH 6.6 que muestra un color marrn oscuro, lo que indica que hay actividad enzimtica (muy lenta en relacin a mis resultados y muy rpida en relacin a otro grupo de practica)Al medir el efecto de la temperatura se mide la actividad enzimtica en la amilasa salival a los 4C y no se presentaron cambios de color significativos, es decir que el color nunca desapareci. Por lo tanto, se podra decir que la amilasa no actu. A diferencia de las otras temperaturas, en la temperatura de 37C s se presentaron cambios, porque la amilasa salival al igual que las otras enzimas tienen su propio rango de temperatura optima, al encontrarse en el cuerpo siempre tiene una temperatura de 37C y en esta temperatura ocurre una velocidad alta en las reacciones enzimticas.Por el contrario, al aumentar la temperatura a 89 C en la etapa C, se presenta un color azul indicador de que no hay actividad enzimtica debido a la desnaturalizacin de la enzima.Los resultados obtenidos en relacin al factor de la concentracin de sustrato muestran que la enzima al reaccionar con menor concentracin como 1ml de almidn, la velocidad de la actividad enzimtica es alta lo que no sucede con una concentracin de almidn elevada, ya que al haber ms sustrato (almidn) la enzima va entra a un estado de saturacin, lo que provoca la disminucin de la velocidad en la actividad enzimtica.En el estudio del factor del ion cloro, los resultados muestran que la enzima al estar en contacto con aniones como cloro, bromo, yodo o cationes como calcio, magnesio, cobre, cobalto, sodio, nquel, potasio, manganeso, hierro y cinc aceleran la velocidad de las reacciones enzimticas.Analizando los colores de las reacciones obtenemos, que el color azul es dado por la solucin yodada al interactuar con el almidn e indica que no hay actividad enzimtica ya sea por inactivacin, desnaturalizacin, concentracin de la enzima; el color marrn oscuro es producido por la solucin cprica o de Benedict que reacciono con los azucares reductores (aquellos que tienen su OH libre del C anomrico) como glucosa, maltosa, celobiosa y lactosa, los cuales actan sobre el cobre reducindolo.Estos resultados obtenidos nos muestran la estrecha relacin que existe entre los factores fsico-qumicos con la velocidad de reaccin enzimtica. Los la interpretacin de los resultados obtenidos estn dados en comparacin de las muestra de los otros grupos de practica ya que en nuestras reacciones hubo una variacin mnima debido al error humano (no siguiendo la secuencia de la prctica, un mal manejo de los instrumentos, y reactivos). VII. CONCLUSIONES

La amilasa salival tiene un pH y una temperatura ptima para que no sufra inhibicin, desnaturalizacin o disminucin en la velocidad de la actividad enzimtica. Para que la amilasa salival no sufra variaciones en velocidad de reaccin necesita una concentracin de sustrato en relacin a la concentracin de la enzima para poder desarrollar la actividad enzimtica de una manera rpida. Existen aniones como el cloro que aumentan la velocidad de las reacciones enzimticas al estar en contacto con la enzima.

VIII. BIBLIOGRAFA:

Doran, P. (1998). principios de ingeniera de los bioprocesos. Editorial acribia SA. Zaragoza. Colegio de Ciencias y Humanidades Plantel Sur UNAMB Diccionario de medicina/Ocano Mosby www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz1.htm Enciclopedia Temtica Auto evaluativa/Lexus/Bioqumica www.pucmmsti.edu.do/cienciasfisiologicas/BQMA-SIB2.PDF