PRACTICA 10 ARCO 5
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PRACTICA Nº 10: PRUEBAS IMUNOLÓGICAS EN EL DIAGNOSTCO DE PARASITOSIS. ♦ PRUEBA DE DOBLE DIFUSION ARCO 5 (DD5) El diagnostico serologico de la Echinococosis quistica (EQ) durante los últimos años se enfoco a mejorara la sensibilidad y la especificidad de los métodos de diagnostico utilizados, que van a va ria r de acue rdo a la nat ura lez a, pu reza y ca lid ad de los ant igenos emple ados, la sensibilidad y especificidad intrínseca de las técnicas serologicas y de las respuesta del huésped. La fuente mas importante de antígeno para el diagnostico de esta parasitosis ha sido el liquido hidatídico (LH). El estudio por SDS PAGE del LH total demuestra que se trata de un mosaico antigénico donde se destacan más de 10 antígenos parasitarias derivados del metabolismo del parásito y del huésped intermediario, algunos de los cuales son comunes con otras enfermedades parasitarias. Entre estos componentes se destacan dos antígenos mayoritarios el antígeno 5; lipoproteina termolabil de 400 kDa y el antígeno B; lipoproteina termoestable de 150 kDa. En condiciones de no reducción estas lipoproteínas presentan bandas 55-65 kDa y 8-12-16 kDa respectivamente.La lipoproteina de aproximadamente 65 kDa tiene asociada la Fosforilcolina, hapteno muy común en la naturaleza y responsable de numerosas reacciones cruzadas. La técnica mas empleada en los últimos años para el diagnostico de EQ es la doble difusión 5 (DD5). Sin embargo esta técnica tiene limitaciones en cuanto a su sensibilidad que es de 50 a 80% para el caso de localización hepática. En 1978, Coltorti y Varela- Díaz describieron la reacción de doble difusión en agar con detección del arco 50. (DDS). Con esta prueba se logró confirmar inmunológicamente la infección hidatíd ica. La tecnolo gía simple de la DD5 permite que laboratorio s de hospit ales periféricos o de zonas endémicas cuenten con un examen de fácil ejecución. El rendimiento de la DD5 está influido por factores dependientes del huésped y el parásito; entre ellos, la localización y número de los quistes y, posiblemente, la presencia de diferentes especies y cepas. En la práctica, la aplicación de la DD5 al diagnóstico serológico rutinario de la hid atid osis per mite cont ar con una pru eba de elev ada esp ecif icid ad; es dec ir, los res ulta dos positiv os confirmarían la prese ncia de la infecció n.
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PRACTICA Nº 10: PRUEBAS IMUNOLÓGICAS EN EL DIAGNOSTCO DEPARASITOSIS.
♦ PRUEBA DE DOBLE DIFUSION ARCO 5 (DD5)
El diagnostico serologico de la Echinococosis quistica (EQ) durante los últimos años se
enfoco a mejorara la sensibilidad y la especificidad de los métodos de diagnostico utilizados, que
van a variar de acuerdo a la naturaleza, pureza y calidad de los antigenos empleados, lasensibilidad y especificidad intrínseca de las técnicas serologicas y de las respuesta del huésped.
La fuente mas importante de antígeno para el diagnostico de esta parasitosis ha sido el
liquido hidatídico (LH).
El estudio por SDS PAGE del LH total demuestra que se trata de un mosaico antigénico
donde se destacan más de 10 antígenos parasitarias derivados del metabolismo del parásito y del
huésped intermediario, algunos de los cuales son comunes con otras enfermedades parasitarias.
Entre estos componentes se destacan dos antígenos mayoritarios el antígeno 5; lipoproteina
termolabil de 400 kDa y el antígeno B; lipoproteina termoestable de 150 kDa. En condiciones de
no reducción estas lipoproteínas presentan bandas 55-65 kDa y 8-12-16 kDa respectivamente.La
lipoproteina de aproximadamente 65 kDa tiene asociada la Fosforilcolina, hapteno muy común enla naturaleza y responsable de numerosas reacciones cruzadas.
La técnica mas empleada en los últimos años para el diagnostico de EQ es la doble difusión
5 (DD5). Sin embargo esta técnica tiene limitaciones en cuanto a su sensibilidad que es de 50 a
80% para el caso de localización hepática.
En 1978, Coltorti y Varela- Díaz describieron la reacción de doble difusión en agar con
detección del arco 50. (DDS). Con esta prueba se logró confirmar inmunológicamente la infección
hidatídica. La tecnología simple de la DD5 permite que laboratorios de hospitales periféricos o de
zonas endémicas cuenten con un examen de fácil ejecución.
El rendimiento de la DD5 está influido por factores dependientes del huésped y el parásito;
entre ellos, la localización y número de los quistes y, posiblemente, la presencia de diferentesespecies y cepas. En la práctica, la aplicación de la DD5 al diagnóstico serológico rutinario de la
hidatidosis permite contar con una prueba de elevada especificidad; es decir, los resultados
positivos confirmarían la presencia de la infección.
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En cambio, los resultados negativos no invalidan la existencia de quistes hidatídicos en el
paciente, sobre todo en los casos pulmonares, donde la sensibilidad de la DD5 fue baja. Doble
difusión (DD) Es una técnica que consiste básicamente en colocar en un gel, al cual se le han
hecho perforaciones, el antígeno, un suero testigo y el suero que se va a analizar. Las muestras van
a difundirse en forma concéntrica y los anticuerpos van a unirse con los antígenos
correspondientes, formando bandas de precipitación.
Cuando las concentraciones del antígeno y del anticuerpo son equivalentes y sus pesos
moleculares similares, las bandas de precipitación tienen forma recta y se encuentran equidistantes
de los reservorios del antígeno y del suero.
Cuando no existe equivalencia en la concentración, los sistemas precipitantes se forman
más cerca del reactivo de menor concentración.Es de fácil separación del resto de las fracciones
por tener una doble incurvación, se conoce actualmente con el nombre de arco 5”. El arco 5” es
específico para el E. granulosus.
Diferentes antígenos de helmintos, no producen el arco 5”. Incluso el E. multilocularis no produce esa banda de precipitación, lo cual confirma la especificidad antigénica del arco 5”.
PROCEDIMIENTO:
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♦ En una lamina portaobjetos limpia y seca, distribuir 3.5 ml utilizando una pipeta de agar
previamente fundido y dejarlo solidificar a temperatura ambiente.
♦ Colocar sobre el diagrama y cortar el agar en orificios para el antigeno, el suero control y el
suero en estudio.
♦ El suero en estudio se coloca en el orificio de 10 mm de diámetro; el suero control en el de
6 mm y el antigeno en el de 1 mm. Estos orificios contienen aproximadamente un volumen de 150
ul, 50 ul y 30ul, respectivamente.
A TIGE O
SUEROCONTROL
SUEROPROBLEMA
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♦ El orificio del antigeno llenarlo con una pipeta Pasteur.
♦ Una vez llenados los orificios, llevar la lámina a una cámara húmeda y dejar difundir a
temperatura ambiente durante 40 – 48 horas.
NOTA: La práctica no se concluyo pero el objetivo era conocer y realizar parte del procedimiento.
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