Practica 1 de Inmunologia Basica
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Pedro Soto Briones Matricula: 289705 Practica 1 PURIFICACION DE GAMMA GLOBULINA POR PRECIPITACION CON SULFATO DE AMONIO INTRODUCCION -Tiseluis y Kabat -actividad de anticuerpos principalmente presente en la fracción gamma de las proteínas del suero. Los anticuerpos pueden purificarse por métodos específicos e inespecíficos. Los métodos específicos : se basan en la propiedad que tienen los anticuerpos para reaccionar con sus antígenos. Las separaciones inespecíficas : están basadas en las propiedades fisicoquímicas de los anticuerpos. Uno de los métodos inespecíficos más empleados de purificación de gamma globulina es la precipitación con sulfato de amonio a una concentración final de 33%. La precipitación de la gamma globulina por este método se debe al fenómeno conocido como salting out, el cual consiste en que las moléculas de agua que solvatan a la molécula anticuerpo son desplazadas por los iones sulfato y amonio, que además neutralizan los grupos cargados de la proteína, con lo que se insobuliza y precipita. OBJETIVO El alumno será capaz de purificar gamma globulina por precipitación con sulfato de amonio a partir de un suero humano. La gamma globulina obtenida en esta práctica se utilizara posteriormente para inmunizar conejos. Material por grupo
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Pedro Soto Briones Matricula: 289705
Practica 1
PURIFICACION DE GAMMA GLOBULINA POR PRECIPITACION CON SULFATO DE AMONIO
INTRODUCCION
-Tiseluis y Kabat -actividad de anticuerpos principalmente presente en la fracción gamma de las proteínas del suero.
Los anticuerpos pueden purificarse por métodos específicos e inespecíficos.
Los métodos específicos: se basan en la propiedad que tienen los anticuerpos para reaccionar con sus antígenos.
Las separaciones inespecíficas: están basadas en las propiedades fisicoquímicas de los anticuerpos.
Uno de los métodos inespecíficos más empleados de purificación de gamma globulina es la precipitación con sulfato de amonio a una concentración final de 33%.
La precipitación de la gamma globulina por este método se debe al fenómeno conocido como salting out, el cual consiste en que las moléculas de agua que solvatan a la molécula anticuerpo son desplazadas por los iones sulfato y amonio, que además neutralizan los grupos cargados de la proteína, con lo que se insobuliza y precipita.
OBJETIVO
El alumno será capaz de purificar gamma globulina por precipitación con sulfato de amonio a partir de un suero humano. La gamma globulina obtenida en esta práctica se utilizara posteriormente para inmunizar conejos.
Material por grupo
1 centrifuga clínica 20 L de solución salina-regulador de boratos (SSRB) 0.1 M, pH 7.8.
1 matraz Erlenmeyer de 2L. 5 mL de cloruro de bario al 10%.
1 agitador magnético. 10 mL de solución de timerosal al 1%.
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Material por equipo.
10 ml de suero Tubo para diálisis.
20 ml de sln. Saturada de sulfato de amonio. 10 cm de hilo grueso.
5 ml de NaOH 2N. 4 aplicadores de madera.
50 mL de solución salina al 0.85% (SS), pH 7.8. 2 tubos cónicos de 15 mL, graduados.
10 mL de SSRB. 2 tubos de ensaye de 13 X 100 mm
Papel indicador de pH. 4 tubos de ensaye de 15 X 125 mm
2 pipetas serológicas de 5.0 mL. 1 pipeta serológica de 1.0 mL.
2 pipetas Pasteur y bulbo de hule 1 matraz Erlenmeyer de 25 mL
1 vaso de precipitación de 250 mL. 1 gradilla para tubos de ensaye de 15 mm de diámetro.
Método
1. Ajustar a 7.8 el pH de la solución saturada de sulfato de amonio, con NaOH 2N.
2. Adicionar a un volumen de suero, contenido en un tubo cónico, medio volumen de la solución saturada de sulfato de amonio, LENTAMENTE Y CON AGITACION CONSTANTE. De esta forma, el sulfato que amonio queda a una saturación final de 3%.
3. Continuar con la agitación durante 10 – 15 min después de terminar la adición del sulfato de amonio.
4. Centrifugar los tubos, a temperatura ambiente, a 3,500 rpm durante 15 min.
5. Disolver el sedimento en SS pH 7.8 hasta alcanzar el volumen original del suero.
6. Repetir los pasos 2, 3, 4 y 5.
7. Repetir nuevamente los pasos 2, 3, y 4.
8. Disolver en SSRB el sedimento original del suero.
9. Dializar contra SSRB en frio (4°C) y con agitación, durante 3 -5 días, realizando dos cambios diarios de solución de diálisis hasta eliminar completamente al sulfato de amonio. Para saber si efectivamente se elimino al sulfato de bario al 5.0 mL de la solución de diálisis se le agregan unas gotas de cloruro de bario al 10%. Las diálisis se considera completa si ya no se observa la formación de un precipitado blanco de sulfato de bario.
Pedro Soto Briones Matricula: 289705
10. Transferir la gamma globulina dializada a un tubo y centrifugar en frio a 2,500 rpm durante 10 min para eliminar el precipitado que se hubiera formado.
11. Determinar la concentración de proteínas por colorimetría o espectrofotometría.
12. Agregar a la preparación de gamma globulina, timerosal hasta una concentración final de 0.01%, y conservarla en refrigeración o congelación.
13. Comprobar la pureza del producto por inmunoelectroforesis.
Resultados y Conclusiones:
Se inoculara un conejo con la gammaglobulina obtenida en la práctica.
Nos servirá para comprender como reaccionan algunos animales a la gama globulina, principalmente los anticuerpos en este caso del conejo.
REFERANCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Campbell, D.H.,; Garvey, J.S.; Cremmer, N.E. and Sussdorf, D.H. 1970. Methods in Immunology. 2ª ed. W.A. Benjamín, Inc Editores. New York.
2. Kabat, E.A. y Mayer, M.M. 1068. Inmunoquímica Experimental. 1ª ed. La Prensa Médica Mexicana. México.
