Practica 1 EXTRACCIÓN Y ANÁLISIS ADN genómico de suelo

Introducción• Extracción de DNA

En general, dada su complejidad macromolecular, los ácidos nucleicos son difíciles de separa de los componente de membrana , proteína residual o añadida (tales como las enzimas de restricción) y otras moléculas solubles (polisacáridos). Loa métodos drásticos alteran sus estructuras y sus características. De ahí que sean muchos métodos suaves elaborados para eliminar la impureza de las preparaciones , todos ellos basado en las propiedades físico-químicas del acido nucleico. Para la eliminación de proteínas asociadas se utilizan enzimas proteolíticas , como la proteinasa K

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Introducción

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El protocolo básico consiste en el tratamiento del homogeneado con disolventes organicos (fenol, cloroformo o ambos)

Introducción

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• Purificación de Ácidos nucleicos por precipitación salina diferencial

Procedimiento alternativo al anterior , basado en las diferencias de solubilidad de DNA y ARN en función de la concentración de sales : Tanto en DNA como RNA son solubles en disolución salina concentrada , mientras que a baja concentración de sales solo es soluble en RNA

Para esta precipitación salina se suele utilizar NaCl, pero puede también emplearse acetato sódico saturado, en combinación con alcoholes orgánicos, conduciendo a resultados incluso mejor que con fenol y cloroformo , sobre todo para cantidades pequeñas de DNA

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• Recogida y conservación de las muestrasUna vez separados y extraídos, los ácidos nucleicos deben ser conservados adecuadamente. El precipitado seco de ácidos nucleicos o el “ovillo” de fibras de DNA obtenidos , pueden disolverse en disolución amortiguadora (alcalina , en el caso de DNA) y conservarse a 4 ºC , o disolverse en agua y mantenerse congelados para posteriores manipulaciones enzimáticas. El DNA genómico en disolución no se debe congelar, para evitar la rotura de las moléculas por las fuerzas de cizalla provocadas al solidificarse el hielo y al descongelarse. Por el contrario, el RNA se puede conservarse congelado a -70 º C en disolución acuosa, cuidando de añadir un inhibidor de Rnasas.

Introducción

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• Electroforesis

Esta técnica se basa en la capacidad de las macromoléculas cargadas para desplazarse en un campo eléctrico , con velocidad proporcional a su carga e inversamente proporcional a su tamaño. Las moléculas de DNA poseen, al pH alcalino habitual, una carga negativa uniforme por unidad de masa , lo que hace que su movilidad hacia en ánodo (+) solo venga determinada por el tamaño de la molécula (numero de pares de bases, si es lineal). Debe destacarse que los cromosomas eucariotas son demasiado grandes para ser identificadas por este tipo de análisis , por lo que comúnmente se aplica sobre DNA fragmentado con nucleasas

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Introducción

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Introducción • ADN genómico

Es el conjunto de ADN que comprende el genoma de un organismo, es el ADN cromosómico nuclear que ha sido aislado directamente de células o tejidos.

• ADN plasmídico

Las cadenas de ADN plasmídico adoptan una conformación tipo doble hélice al igual que el ADN de los cromosomas , aunque se encuentran fuera de los mismos. No contienen información escencial, si no que confieren ventajas al hopedador en condiciones de crecimiento determinadas.

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Objetivos Objetivo general

• Extracción de ADN genómico de suelo

Objetivos específicos

• Determinación la calidad del material genético extraído mediante una electroforesis en gel de agarosa

• Estimación de la concentración y pureza del mismo.

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Metodología

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Fundamentos • Método de extracción y purificación con CTAB

El protocolo del método del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) fue elaborado por Murray y Thompson en 1980. El método es adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y alimentos derivados de vegetales y está especialmente indicado para eliminar los polisacáridos y los compuestos polifenólicos, que, de otro modo, alterarían la pureza del ADN y, por tanto, su calidad.

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Metodología para la extracción de ADN genómico de suelo.

1• Pesar 300-400 mg de suelo en un tubo centrífuga

de 15 ml.• +9 ml de CTAB (65°) - mezclar

2• Incubar durante 40 min (65°) y Enfriar por 4-5 min.• +4.5 ml (cloroformo/isopropanol, 24:1) • Mezclar 5-10 min

3• Centrifugar 10 min a 3200 rpm (T amb)• Transferir la fase acuosa a tubo de 15 ml• +4.5 ml de cloroformo/isopropanol. Mezclar 5-10

min.

4• Centrifugar 10 min a 3200 rpm• Transferir a tubo de 15 ml con 30 μL de RNAsa • Mezclar e Incubar por 30 min T amb.

Metodología de extracción con Fenol para obtener ADN de alta pureza

1• Colocar ADN en microtubo eppendorf de

2 ml con 1 ml de agua Mq.• Disolver toda una noche

2• Añadir 1 vol. De fenol/cloroformo 1:1• Centrifugar a 3200 rpm x 10 min

3

• Transferir fase acuosa a tubo eppendorf nuevo.

• Extraer ADN con 1 ml de cloroformo/octanol.

• Centrifugar a 3200 rpmx 10 min.

4• Transferir fase acuosa a nuevo tubo

eppendorf de 2ml

Precipitación con Etanol y Lavados de la Pastilla

1

• Precipitar ADN añadiendo 50μL de NaCl 5M • +1 ml EtOH, mezclar por inversión• Centrifugar a 12000 rpm 1 min

2

• Recuperar pastilla• + 2 ml de solución de lavado• Agitación suave por 10-20 min

3

• Centrifugar a 12000 rpm 1 min. Para recuperar pastilla

• Adicionar solución de lavado 2 y dejar secar la pastilla

4

• Decantar solución de lavado 2. Secar pastilla.

• +0.3-0.5 ml de TE al tubo eppendorf• Tapar y dejar disolver ADN a TA toda la

noche

Electroforesis en gel de agarosa

1

• Pesar 1g de agarosa + Buffer TAE 1x a 100 ml• Fundir en horno de microondas + 5μL de BrET• Depositar en carro con peine para gel

2

• Solidificar en campana de extracción.• Colocar en cámara de corrimiento con Buffer TAE

1x

3

• 5μL de ADN + gota de Buffer de carga en cuadro de parafilm• Mezclar y cargar en el gel

4

• Conectar fuente de poder y correr gel a 70-90 V• Separación ¾ partes del gel• Observar en Transiluminador con UV.

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Fundamentos• Principios del método del CTAB: lisis, extracción y

precipitación

Las células vegetales pueden lisarse con el detergente iónico bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB), que forma un complejo insoluble con los ácidos nucleicos en medio hiposalino. De ese modo, los polisacáridos, los compuestos fenólicos y los demás contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden eliminarse por lavado. El complejo de ADN se solubiliza aumentando la concentración salina y se precipita con etanol o isopropanol.

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Fundamentos• Lisis de la membrana celular

La primera etapa de la extracción del ADN es la rotura de la membrana celular y nuclear, para lo cual la muestra homogeneizada se trata primero con el tampón de extracción, que contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB. Todas las membranas biológicas presentan la misma estructura general, integrada por moléculas de lípidos y de proteínas, unidas por interacciones no covalentes.

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Fundamentos• Extracción

En esta etapa, se separan los complejos formados por los ácidos nucleicos y el CTAB de los polisacáridos, los compuestos fenólicos, las proteínas y los demás lisados celulares disueltos en la solución acuosa. Es especialmente importante eliminar los polisacáridos y los compuestos fenólicos, pues pueden inhibir numerosas reacciones enzimáticas. El cloroformo desnaturaliza las proteínas y facilita la separación de las fases acuosa y orgánica. La fase acuosa suele constituir la fase superior. La extracción con cloroformo se realizará dos o tres veces, con objeto de eliminar por completo las impurezas de la capa acuosa. Para perfeccionar la extracción de los ácidos nucleicos, puede retroextraerse la fase orgánica con una solución acuosa, que se añade a continuación al extracto anterior. Una vez purificados los complejos de ácidos nucleicos, puede procederse a la precipitación, última etapa del procedimiento.

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Fundamentos• Precipitación

En esta última etapa se separan los ácidos nucleicos del detergente, para lo cual la solución acuosa se trata primero con una solución de precipitación compuesta por una mezcla de CTAB y NaCl en concentración elevada (NaCl > 0,8 M). Una alta concentración salina es necesaria para que se forme un precipitado de ácidos nucleicos. Puede ser preferible emplear acetato de sodio en lugar de NaCl por su capacidad tampón. En estas condiciones, el detergente, que es más soluble en alcohol que en agua, puede eliminarse por lavado, mientras que los ácidos nucleicos precipitan. El posterior tratamiento con etanol al 70 % permite una mayor purificación o elución de los ácidos nucleicos de la sal residual.

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Fundamentos

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Fundamentos• Cuantificación del ADN mediante espectrofotometría

El ADN, el ARN, los oligonucleótidos e incluso los mononucleótidos pueden cuantificarse directamente en soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir, midiendo la absorbancia A (o densidad óptica, DO) de luz ultravioleta (también puede hacerse en el intervalo visible). Si la muestra es pura, es decir, no contiene cantidades significativas de contaminantes como proteínas, fenol o agarosa, la medición espectrofotométrica de la irradiación ultravioleta absorbida por las bases es sencilla y exacta.

La concentración de ácidos nucleicos suele determinarse midiendo a 260 nm y comparando con un blanco. La interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un «cociente». Dado que las proteínas absorben a 280 nm, se emplea el cociente A260/A280 para calcular la pureza de los ácidos nucleicos

Cuando la cantidad disponible de ácidos nucleicos es escasa, puede emplearse el método de la placa de agarosa con bromuro de etidio. Permite calcular la cantidad de ácidos nucleicos a partir de la intensidad de la fluorescencia emitida por el bromuro de etidio irradiado con luz UV, comparándola con unos patrones de concentración.

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Resultados y análisis de resultados A) Discute los resultados obtenidos en tu práctica:

• Obtención de ADN

• Electroforesis en gel (FOTO GEL con ubicación de tu carril de corrimiento)

• Espectrofotometría (Concentración y pureza del ADN)

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Análisis de Resultados. • Se obtuvo una absorbancia a 260 nm de 0.310, por lo que la

concentración de ADN obtenida es:

Sin embargo ese valor no representa la concentración de ADN puro, debido a interferencia proteica en la densidad óptica de la muestra.

Relación de Absorbancia 260/280 nm

• Un ADN de pureza óptima se encuentra entre 1.8 y 2.0

La relación de nuestra muestra es 1.35, lo que indica prioritariamente que hay presencia de proteínas, por lo que es conveniente realizar un nuevo proceso de extracción.

Aunque un pH ácido puede modificar el resultado, solo disminuye entre 0.2 a 0.3 unidades el índice. Por lo que se descarta esta posibilidad.

La composición de los nucleótidos libres también es capaz de modificar el índice.

Se sospecha que la principal causa de la baja pureza en la muestra es la presencia de proteínas debido a una mala separación de la muestra de ADN.

También es probable que el lavado de la muestra no retiró todos los contaminantes.

Además un tiempo de procesamiento prolongado, y no realizar el procedimiento en un área estéril representa un incremento en la posibilidad de cometer errores durante la extracción de ADN.

Análisis de resultados obtenidos en la electroforesis• No se logró obtener bandas definidas en la prueba de

electroforesis, se aprecia un efecto “Smear” en el gel.

• Lo que podría indicar una posible contaminación de la muestra por nucleasas y la posible degradación del ADN.

• Si el método hubiese funcionado correctamente, se hubiesen presentado bandas bien definidas y de grosor considerable, pues se manejó ADN genómico, el cual migra más lentamente debido a su alto peso molecular.

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Resultados y análisis de resultados B) Elabore un dibujo de la cámara de electroforesis donde muestras el corrimiento de tu gel y las características de la corrida.

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Foto electroforesis obtenida por el transluminador

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DNA genómico

DNA genómico

Material genético de bajo peso molecular

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Conclusiones • La extracción de ADN debe realizarse en un espacio con las

condiciones que asegure la esterilidad del medio y con las medidas de seguridad adecuadas (microfiltros, cubrebocas, guantes, sin corrientes de aire, etc.)

• El proceso se tiene que hacer sin distracciones y asegurando el tiempo mínimo entre cada operación para evitar la contaminación y la degradación.

• El lavado de la muestra es parte crucial este procedimiento debería de repetirse bajo condiciones estándar tantas veces fuera necesario para asegurar que la muestra quede libre de proteínas compuestos fenólicos, polisacáridos , y demás material que pueda participar en la degradación de la muestra.

• La colocación de la muestra d ADN en el posillo se debe de realizar con extrema pericia para evitar que se quede en el fondo y no sea capaz de salir de el pero también que no quede fuera del pozo y se disperse.July 22, 2012

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• La electroforesis en gel es una técnica de suma importancia en la biotecnología ambiental ya que nos permite conocer el la cantidad de pares de bases de la muestra.

• La calidad del ADN y su grado de pureza se ven directamente afectados por la calidad del proceso de extracción de ADN.

• La cantidad total de AND en la muestra depende de dos factores principalmente e primero la extracción como se menciono anteriormente y en segundo lugar las características fisicoquímicas del suelo donde se tomo la muestra ya que pueden contribuir a su degradación.

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Conclusiones

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Bibliografía

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• Hupfer, C., Hotzel, H., Sachse, K. y Engel, K.H. (1998). Detection of the genetic modification in heat-treated products of Bt maize by polymerase chain reaction.

• Manual de laboratorio de biotecnologia ambiental • Luque , Herraez. Biología molecular e ingeniería genética (2008)

ELSEVIER. Madrid , España