PRCTICA 2

Prctica 1Determinacin del efecto de la concentracin de sal en la fermentacin lctica de hortalizas encurtidas

Introduccin

El procedimiento de encurtir los vegetales con sal tiene como objetivo principal la conservacin de la calidad nutritiva del producto. Los alimentos pierden agua al establecerse un equilibrio osmtico con la salmuera. Simultneamente, penetra la sal a los tejidos celulares y salen carbohidratos, compuestos nitrogenados, minerales y otras sustancias que son utilizadas durante la fermentacin (Prescott y Dunn,1959). En la salmuera se desarrolla una flora microbiana mixta, predominando las bacterias lcticas. stas acidifican el medio y bajan el pH lo suficiente para prevenir el desarrollo de microorganismos patgenos y de los que deterioran al vegetal. El tratamiento se completa sustituyendo la salmuera de fermentacin con la de cobertura, a la cual se le aaden vinagre y condimentos (Escamilla et al., 1987; Fuselli et al., 1992; Pederson, 1979; Prescott y Dunn,1959). Durante el proceso hay cambios de sabor, textura y color en la hortaliza, modificando ligeramente sus propiedades nutritivas (Belatsouras et al., 1983; Ruz y Jimnez, 1994, Weinberg et al., 1993).

Existen tres grupos microbianos que pueden aparecer en el proceso fermentativo (Carr, 1975; Fernndez et al., 1993; Pederson y Albury, 1969; Prescott y Dunn,1959):

Bacterias lcticas. Generalmente prevalecen desde el inicio sobre otros grupos microbianos. Este grupo puede fortalecerse con una apropiada inoculacin.

Enterobacterias. Estas provienen de la tierra y del agua. Se observan en baja concentracin al inicio de la fermentacin.

Levaduras. En la ltima etapa del proceso aparecen bajas concentraciones de levaduras fermentativas. Las levaduras aerobias son indeseables porque forman pelculas en la superficie, disminuyen la acidez y deterioran el producto. Se evita su desarrollo cubriendo la superficie de la salmuera con plstico.

Para preparar los encurtidos vegetales se aade sal directamente a las hortalizas foliares (col, brcoli, etc.) en una concentracin entre 2.5 -3%, y se espera a que se libere agua de ellas para formar una salmuera. Si las hortalizas son frutos, races o tallos, stas se sumergen en una salmuera preparada con antelacin, en un rango de concentracin de NaCl que flucta entre 7 - 16%, y considerando generalmente una relacin en peso entre NaCl/hortaliza de 9:100. Para expresar la concentracin de NaCl en la salmuera se usan los GRADOS SALINOS, considerando la siguiente equivalencia (Carr, 1975; Prescott y Dunn, 1959):

1o S = 0.265 % de NaCl, a 20o C

Las hortalizas duras pueden ser sometidas a un pre-tratamiento con cal para ablandar los tejidos. Cuando el vegetal no aporte el nivel apropiado de carbohidratos a la fermentacin puede aadirse azcar a la salmuera. En ocasiones se aade un poco de cido actico al inicio del proceso para disminuir el pH y favorecer el desarrollo de las bacterias lcticas (Carr, 1975; Pederson, 1979; Prescott y Dunn,1959; Ruz y Jimnez, 1994).

Objetivo

Determinar el nivel apropiado de concentracin de sal en la salmuera que favorezcan la fermentacin lctica y la conservacin de las hortalizas.

Materiales y reactivos (por equipo)

1 asa bacteriolgica

1 barra de agitacin magntica

1 charola profunda

2 esptulas pequeas de acero inoxidable

4 frasco de 120 ml de capacidad nominal con tapa de rosca

1 frasco de vidrio de 3.5 l (1 galn), con tapn de rosca.

1 mechero fisher con manguera

1 mechero bunsen con manguera

1 piceta

1 pinzas para crisol

2 pipetas graduadas de 1 ml

5 pipetas graduadas de 10 ml

1 probeta de 250 ml

1 probeta de 2000 ml

1 recipiente metlico de 15-20 cm de altitud y 18-22 cm de dimetro

1 salmetro

4 tubos de cultivo medianos con tapn roscado

1 tubo en T de vidrio con manguera

2 vasos de precipitados de 50 ml

1 vaso de precipitados de 2000 ml

Algodn, bata, cerillos o encendedor, cinta adhesiva tipo masking, cuaderno de registros, cubrebocas, detergente, papel aluminio, papel sanitario, papel estraza, plstico (pelcula de polietileno), pluma, plumn marcador negro, reloj, tela paalina o gasa, tijeras, toallita para las manos y trapo de franela.

Reactivos:

cido actico concentrado

H2O destilada o desionizada

Glucosa

NaCl

Soluciones amortiguadoras de referencia, pH 4.0 y 7.0

Solucin de fenol al 1 % *

Solucin de fenol al 5 % *

Solucin de H2SO4 al 10 % *

Solucin de NaOH al 10 % *

Un tubo con cultivo axnico de 48 h de una cepa de Lactobacillus plantarum, en medio complejo slido.

Hortalizas

(*) Preparadas previamente segn el ANEXO A.

Para anlisis:

Se deben considerar los materiales, reactivos y equipo necesarios para realizar los anlisis, segn las indicaciones de los ANEXOS A, B y C.

Equipo (para el grupo):

Autoclave, balanza granataria digital, balanza con capacidad para 2 Kg, campana de flujo laminar, parrillas de agitacin y calentamiento electrorregulables, potencimetro, refrigerador, salmetro.

Diseo de la prctica

Se evaluarn dos niveles de concentracin de sal en la fermentacin lctica dentro del rango normal que se utilice en la industria de elaboracin de hortalizas encurtidas. Cada equipo de alumnos preparar su salmuera, sus vegetales y el inculo. Despus, llevar a cabo una fermentacin de 3 4 semanas, muestreando y realizando los anlisis semanalmente. Despus realizar los clculos, se compararn los resultados de dos equipos, cada uno con la misma hortaliza y con un nivel diferente de concentracin de salmuera. Cada equipo presentar un informe con los resultados de ambos equipos y su discusin. Los resultados se discutirn en una sesin global.

Se proponen dos niveles para evaluar el efecto de la concentracin de sal en esta fermentacin lctica con Lactobacillus plantarum, de acuerdo al Cuadro 2.1. Los parmetros evaluados sern los cambios en la concentracin de cido lctico y pH. Adems, se observar cules grupos microbianos predominan en las diferentes etapas del cultivo.

CUADRO 2.1 Niveles de concentracin de sal para la

fermentacin lctica de hortalizas encurtidas

_____________________________________________________________________________________

No. Fermentador Conc. inicial de sal* Conc. final de sal*

(oS )

(oS )

_____________________________________________________________________________________

1

15

30

2

30

60

_____________________________________________________________________________________

* 1 grado salino (S) = 0.265 % NaCl

La concentracin de sal en la salmuera se incrementa a 1.5 veces la concentracin inicial a la primera semana, para favorecer la actividad de Lactobacillus plantarum durante la ltima semana. Una semana antes del trmino de la fermentacin, la concentracin ser el doble del valor inicial. Durante el reposo de 2 semanas, la salmuera se diluye porque la hortaliza libera agua. Cada semana debe medirse la concentracin salina y ajustarla al nivel deseado.

Cultivo del inculo

Preparacin de

materiales de muestreo

Preparacin de la

salmuera

Preparacin de

hortalizas

Fermentacin

Muestreo

Ajuste de sal

Anlisis de la

fermentacin

Informe de resultados

Figura 2.1 Diagrama de actividades para el desarrollo de la prctica. Determinacin del efecto de la concentracin de sal en la fermentacin lctica de hortalizas encurtidas.

1a Actividad: Cultivo del inculo

Estructura

Se verifica la pureza de la cepa de Lactobacillus plantarum que se ha desarrollado previamente en un tubo con agar inclinado, realizando un frotis teido con la tcnica de Gram (ANEXOS A y C). El caldo de M.R.S. se inocula con una asada de la bacteria en condiciones aspticas y se incuba durante 48 h, a 30oC, con agitacin.

2a Actividad: Preparacin de materiales de muestreo

Estructura

Estas actividades se realiza antes de la fermentacin principal.

Se envuelven con papel estraza 4 pipetas graduadas de 10 ml. Se prepara en un matraz erlenmeyer caldo M.R.S., siguiendo el procedimiento indicado en el ANEXO B, y se esterilizan en autoclave a 121oC, durante 15 min.

En casa se hierven en bao mara los frascos de muestreo (120 ml), durante 30 min. Despus se retiran del agua con precaucin, se escurren, se cierran y se dejan enfriar lentamente. En el laboratorio se lava cuidadosamente un frasco de vidrio de 3.5 L con su tapa, dando un ltimo enjuague con agua destilada, se deja secar y se cierra.

3a Actividad: Preparacin de la salmuera

Estructura

La base de clculo para todos los componentes de la salmuera indicados en el Cuadro 2.2 ser un volumen de 1500 ml. Se vierten aproximadamente 1200 ml de agua destilada en un vaso de precipitados de 2 L. Se aaden la sal de mesa y la glucosa, calculadas para 1500 ml. Las soluciones se mezclan con un agitador magntico sobre una parrilla elctrica. El pH de la salmuera se ajusta a 5.0 con soluciones de H2SO4 o NaOH al 10%, con ayuda de un potencimetro, calibrado previamente. Se mide el volumen de la salmuera con una probeta, se ajusta con agua destilada a un volumen de 1470 ml y se regresa al vaso. Esta salmuera debe prepararse el mismo da de la fermentacin.

Cuadro 2.2 Componentes de la salmuera para la

fermentacin lctica de hortalizas encurtidas

ComponentesConcentracin inicialAjuste de concentracin a la 1 semana

NaCl (S)15 3022.5 45

Glucosa (%)0.5

Inculo (%)2.0

4a Actividad: Preparacin de las hortalizas

Estructura

Se utiliza un solo tipo de hortaliza para dos equipos. De un peso inicial de 1.5 Kg se seleccionan los mejores ejemplares maduros y frescos. Pueden emplearse chiles jalapeos, calabacitas, cebollas de cambray, etc. Las hortalizas se preparan dependiendo de lo que requieran. A los chiles, calabacitas y cebollas se les cortan los pednculos con un cuchillo; los nopales se hierven. Despus se lavan las hortalizas en un escurridor de plstico. Para cada fermentador se utilizan 1.2 Kg de hortalizas preparadas.

5a Actividad: Fermentacin y muestreo

Estructura

Se verifica la pureza del inculo de Lactobacillus plantarum por medio de la observacin al microscopio de un frotis teido con la tcnica de Gram (ANEXOS A y C), se adiciona el inculo (2% de 1500 ml) a la salmuera que est en el vaso en una zona estril, utilizando una pipeta estril, se mezcla con un agitador magntico. Las hortalizas (1.2 Kg) se acomodan en el interior del frasco sin salmuera, se adicionan los 1500 ml de salmuera inoculada al frasco fermentador sobre las hortalizas. Inmediatamente despus se toma una alcuota de 15 ml con otra pipeta estril, en condiciones aspticas, la cual se van a analizar el mismo da. Se debe anotar la fecha y hora del inicio de la fermentacin.

Se corta un crculo de una pelcula de polietileno, cuyo permetro exceda aproximadamente 10 cm al permetro del frasco. Con l se cubre la superficie del lquido, tocndola y sin dejar burbujas de aire. Sobre el plstico se colocan de 8 a 10 canicas de vidrio, a fin de garantizar que sta no se levante con el gas que se formar posteriormente. La superficie del lquido nunca debe quedar expuesta al aire porque ah se formarn natas. Despus se tapa el frasco con la tapa de rosca, sin apretar. Los fermentadores se mantienen a temperatura ambiente durante un perodo de 2 semanas.

Se toma una muestra cada semana para lo cual se transporta el fermentador con cuidado a una zona limpia; ah se abre el frasco, se retira la pelcula plstica y se lava. Si se observa una nata superficial, sta se retira con una esptula limpia y se realiza un frotis. Despus, se vaca la salmuera en una probeta de 2 litros para medir el volumen y se regresa al vaso de 2 L. Se retira una alcuota de 15 ml con una pipeta estril, para realizar los anlisis el mismo da. Posteriormente, se vierten 250 ml de salmuera a una probeta de vidrio de esa capacidad, se introduce un salmetro y se sigue el procedimiento indicado en el ANEXO C para la medicin del grado salino. El contenido de esa probeta se regresa luego al vaso de precipitados que contiene el resto de la salmuera.

Se aade la cantidad de sal calculada para incrementar el grado salino al valor que le corresponda. La sal se mezcla con un agitador magntico y una parrilla elctrica. Despus se regresa la salmuera al fermentador, y se colocan la pelcula plstica limpia y las canicas recin lavadas en la superficie. Finalmente, se tapa el frasco y se deja en reposo.

6a Actividad: Anlisis de la fermentacin

Estructura

Los siguientes anlisis se realizan en las muestras de 15 ml de salmuera el mismo da de cada muestreo: observacin de la morfologa de los diversos grupos microbianos con tincin de Gram de frotis elaborados de la salmuera y de la nata superficial (si se form), medicin de pH y determinacin de acidez titulable con NaOH 0.05N. Los anlisis se realizan de acuerdo a las tcnicas que se presentan en el ANEXO C, pero considerando la acidez como cido lctico.

7a Actividad: Informe de resultados

Estructura

El informe debe constar de una cartula con los datos de la prctica y del equipo. En la segunda pgina se escribe el objetivo de la prctica y la seccin de Mtodos, en donde se indican las concentraciones de sal asignadas a cada equipo que se reporta as como el vegetal que se someti. Tambin debe incluirse en esta seccin cualquier actividad que haya sido realizada de manera diferente a lo indicado en el protocolo. Despus vienen las secciones de Resultados, Discusin y Conclusiones, los cuales se detallan ms adelante. Para terminar se incluye la Bibliografa.

Cuadros de resultados

En cada cuadro se escribir el ttulo con el nmero correspondiente, los parmetros que se presentan, el factor que se estudia, el microorganismo y el tipo de medio. Cada fila y columna quedarn bien identificadas y con unidades.

Cuadros de resultados No. 1 y 2. Se cuentan los vegetales de cada condicin de cultivo (S) que est reportando. Cada lote se clasifica en 3 categoras: buenos, regulares y malos, anotando el porcentaje correspondiente de cada categora, con respecto al total del lote. Posteriormente se describe la apariencia de los mismos (cambio de color, firmeza, etc.).

Cuadros de resultados No. 3 y 4. Anotar la morfologa microscpica de los diversos grupos microbianos observados en las muestras de salmuera y las de nata de cada fermentador. Tambin se mencionar en otra columna el orden de abundancia de cada grupo microbiano. Presentar dibujos.

Cuadros de resultados No. 5 y 6. Para cada fermentador se presentan los resultados de los anlisis fsicos y qumicos directos del fermentador: volmenes medidos de salmuera; grado salino medido y grado salino ajustado (despus de aadir la sal); alcuotas y gastos de la determinacin de acidez titulable en cada muestra. Es importante no anotar en este cuadro ningn dato calculado.

Cuadro de resultados No. 7 y 8. Anotar los datos calculados para cada muestra de los dos fermentadores con diferente nivel de sal: pH y acidez titulable en dos tipos de unidades: a) concentracin de cido lctico en la salmuera, en % (p/v), y b) acidez, en gAc.Lac./Kghort. Este valor se calcula considerando el peso del cido lctico (g) que hay en el volumen total de la salmuera en el fermentador de cada semana, dividiendo entre el peso inicial de las hortalizas (1.2 Kg).

Cuadro de resultados No.9. Anotar los resultados de la degustacin de sus vegetales encurtidos en comparacin con productos comerciales.

Grficas

Utilizando los datos calculados de los Cuadros de resultados No. 7 y 8 se realizarn las grficas indicadas en los siguientes incisos, con ayuda del programa de computacin Excel, para graficar los datos. El formato ser de dispersin x y, con puntos y lneas suavizadas, una grfica por pgina.

En cada figura se escribir el titulo con el nmero correspondiente, los parmetros que se presentan, el factor que se estudia (S), el microorganismo y el tipo de medio. Cada curva y coordenada quedar bien identificado y con unidades.

Grficas por fermentador: En las Figuras 1 y 2 se presentan las grficas de cada fermentacin. En la abcisas se indica el tiempo en das; y en las ordenadas, el volumen de la salmuera, el pH y la relacin entre c. Lc./ Peso Hort., en g/Kg.

Grfica de cido lctico: En la Figura 3 se presentan las curvas de la relacin entre c. Lc./ Peso Hort., en g/Kg de los dos fermentadores, contra el tiempo, en das.

Grficas de pH: De manera similar, en la Figura No. 4, se grafican los datos de pH contra el tiempo de los dos fermentadores.

Parmetros de velocidad del proceso

Con los datos que corresponden a la acidez de la tropofase de cada cultivo, Grfica 3 y los Cuadros de resultados No. 7 y 8, se calculan los valores de productividad mxima y productividad total de cido lctico. Los datos utilizados en los clculos, y los parmetros resultantes se escribirn en el Cuadro No. 10 (Pc.Lac. = gc.Lac./KgHort.*h).

Discusin

De acuerdo a los resultados obtenidos en los Cuadros 1 y 2 se puede analizar cual es el mejor S para ese vegetal, considerando sus caractersticas deseables as como su porcentaje de conservacin.

Se analizan los resultados de los Cuadros No. 7 y 8 y de las Figs. 1 y 2 para diferenciar las diferentes etapas en la fermentacin, identificando en qu fase se presentan las mayores actividades de la fermentacin lctica y la deshidratacin de las hortalizas.

Analizando las Figuras 3 y 4 y los parmetros cinticos del Cuadro ) se puede determinar el efecto de la concentracin de sal en la velocidad y rendimiento del cido lctico y en el cambio de pH. Al comparar estos datos con las observaciones de los grupos microbianos predominantes (Cuadros 3 y 4), se deber deducir y explicar la contribucin de cada uno de ellos en las distintas etapas de la fermentacin, reforzando estos conceptos con la informacin de la bibliografa.

Adems, se comparan todos los resultados experimentales con los de la bibliografa.

Conclusin

Declare brevemente si se cumplieron los objetivos planteados al inicio de este protocolo y los aspectos ms importantes aprendidos en esta prctica.

Bibliografa

Belatsouras, G.; Tsibri, A.; Dalles, T. y Doutsias, G. 1993. Effect of fermentation and its control on the sensory characteristics of conservolea variety green olives. Appl. Environm. Microbiol. 46 (1): 68-74.

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L. plantarum en caldo MRS, cultivo a 30C, 48 h, 200 rpm.

Pipetas, frascos de muestreo y frasco fermentador.

Ajustar sal en base al Cuadro 2.1 (15 o 30S) y ajustar a pH 5.

Lavar, cortar pednculo o pelar o hervir.

Acomodar de hortalizas, inocular con 30 ml del inculo de 48 h e incubar a temperatura ambiente por 2 semanas.

Se muestrea en el t = 0 das y cada semana, tomando 15 ml.

Adicin de sal en la primera semana.

Morfologa microbiana, pH y acidez.

Clculos, grficas, tablas y dibujos; discusin y conclusin.