1

Leches fermentadas: actividad biológica de la fracción no bacteriana.

Analía G AbrahamCentro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos 

Área Bioquímica y Control de Alimentos.Facultadde Ciencias Exactas UNLP‐ CONICET.  La Plata. Argentina

CIDCA

Posgrado Alimentos funcionales.

Alimento funcional:

Un alimento puede ser considerado funcional si logra demostrar científicamente que posee efectos beneficiosos para la salud sobre una o más funciones del organismo, más allá de sus propiedades nutricionales habituales, de modo tal que mejore el estado general de salud o reduzca elriesgo de alguna enfermedad o ambas cosas (Definición operativa FUFOSE 1999: UE⁷ ILSIEurope).

2

un ingrediente alimentario microbianovivo que, al ser ingerido en cantidades suficientes, ejerce efectos benéficos sobre la salud de quien lo consume”.(Salminen et al 1998)

Suplemento alimentario con microorganismos vivos que son beneficioso para la salud mediante la modificación de la microbiota intestinal

3

Microorganismos probióticos viables

ácidos orgánicos

etanol, CO2

otros compuestos del metabolismo bacteriano

Productos bioactivos generados por acción de microorganismos

Leche fermentadas con microorganismos probióticos

Componentes de la fracciComponentes de la fraccióón no bacteriana con n no bacteriana con actividad actividad biologicabiologica

ÁÁcidos orgcidos orgáánicosnicos

ExopolisacExopolisacááridos ridos

ProteProteíínasnas

PPééptidos bioactivos ptidos bioactivos

4

Polisacáridos bacterianos

Proteínas

péptidos bioactivos

sistema digestivo

Actividad sobre

antimicrobiana,antihipertensiva

Sistema inmune.

Componentes de la fracciComponentes de la fraccióón no bacteriana con n no bacteriana con actividad biolactividad biolóógicagica

ExopolisacaridosExopolisacaridos

ProteProteíínas de superficienas de superficie

PeptidosPeptidos bioactivos bioactivos

5

Características del polisacárido de kefir

Kefiran

O

H

HO

H

HO

H

OH

OHHH

OH

O

OH

H

H

HO

H

OH

OHHH

OH

glucosa

galactosa

Micheli et al 1999

Polisacárido de kefir

¿Efecto prebiótico?

Polisacáridos y alimentos funcionales

6

QuQuéé es un prebies un prebióóticotico

FAO Technical Meeting onPREBIOTICS 2007

Un prebiUn prebióótico es un componente de los tico es un componente de los alimentos que confiere al hospedador un alimentos que confiere al hospedador un efecto benefecto benééfico asociado con la fico asociado con la modulacimodulacióón de la n de la microbiotamicrobiota

MetodologMetodologíías para analizar el efecto de losas para analizar el efecto de losexopolisacexopolisacááridosridos sobre la sobre la microbiotamicrobiota fecalfecal

MMéétodos in todos in vitrovitro

MMéétodos in vivotodos in vivo

Factibilidad del EPS de ser Factibilidad del EPS de ser fermentado por fermentado por LactobacillosLactobacillos o o bifidobacteriasbifidobacterias probiprobióóticasticas

FermentaciFermentacióón del EPS por n del EPS por homogeinatoshomogeinatos fecales yfecales yananáálisis de la lisis de la microbiotamicrobiota

AdministraciAdministracióón del EPS o n del EPS o alimento que contiene por valimento que contiene por víía a oral y anoral y anáálisis de cambios en lisis de cambios en la la microbiotamicrobiota fecalfecal

7

Con Kefiran de leche fermentada

Con kefiran de gránulo

Con polisacárido de microorganismos aislados de kefir

Control positivo: Glucosa

Control positivo de prebiótico: Inulina

Materia fecal de voluntarios sanos

Medio base sin azúcar0.3% de carbohidratos5% Materia fecal

Bifidobacterium

Reacción de la Polimerasa en cadena

en tiempo real

(RT-PCR)

Efecto Prebiótico

Incubación: anaerobiosis 37°C-24 h.

7,2

7,7

8,2

8,7

9,2

9,7

to

contro

l sin

Hde

C

gluco

sa

Inulin

aAGK1

Lech

e fer

men

tada

L ke

firan

ofacie

ns

L pla

ntar

um

7,2

7,7

8,2

8,7

9,2

to

contr

ol sin

HdeC

gluco

saInu

lina

AGK1

Lech

e ferm

entada

L kefira

nofac

iens

L plan

tarum

Individuo A

Individuo C

Significativamente diferente P ≤0.05

Log UFC/ml

Log UFC/ml

8

PolisacPolisacáárido de grrido de gráánulonulo

0 10 20 30 40 50 60

-1

0

1

2

3

4

5

Tiempo de retención

0 10 20 30 40 50 60

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

tiempo de retencion

B

PolisacPolisacáárido de leche fermentadarido de leche fermentada

PolisacPolisacáárido de L rido de L plantarumplantarum y y L kefiranofaciens L kefiranofaciens

0 10 20 30 40 50 60-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

tiempo de retencion XB

B Legend

1*107

1*107

Microbiota fecal de raton analizada por DGGE (Denaturing Gradient Gel Elecrophoresis)

Withoutkefiran With kefiran

Changes infaecal microbiota

prebiotic

9

DGGE

Agregado del gel de stacking Lavado de las calles

Montaje en portageles Siembra de las muestras

Kefiran

¿protección de la acción de microorganismos patógenos

sobre epitelio ?

Polisacáridos y alimentos funcionales

10

Bacillus Bacillus cereuscereus

Bacilo G (+), mBacilo G (+), móóvil, vil, esporuladoesporulado..Contaminante frecuente de alimentos.Contaminante frecuente de alimentos.SSííndrome emndrome eméético: tico: cereulidecereulide (toxina preformada en (toxina preformada en el alimento, termoestable).el alimento, termoestable).SSííndrome diarreico: Ingestindrome diarreico: Ingestióón de esporas, n de esporas, germinacigerminacióón en el tracto gastrointestinal, n en el tracto gastrointestinal, producciproduccióón de factores extracelulares (n de factores extracelulares (cereolisinacereolisinaO, O, fosfolipasasfosfolipasas, hemolisinas, , hemolisinas, etcetc).).

B. cereus: Factores de virulencia

CELULAS VEGETATIVAS FACTORES EXTRACELULARES

Efectos citopáticosMecanismos de adhesióne invasión

Daños en los enterocitos

11

Caco-2 confluentes y diferenciadas

Bacillus cereus

Kefiran

Efecto de la presencia de Bacillus cereus sobre células Caco 2

Cultivos bacterianos de 3 hs

Dosis de infección

Asociación de B. cereus (lavados) a Caco-2

1x105

2x105

4x105

6x105

8x105

1x106

0,5 0,4 0,25 0,125

Dosis de infección

Bac

teria

s ad

herid

as

(ufc

/ml)

5 x 107 4 x 107 2,5 x 107 1,25 x 107

** *

**

Asociación de B. cereus (lavados) a Caco-2Control de infecciónInfección + kefiranPreincubación e Infección

1x105

2x105

3 x105

4x105

5 x 107 2,5 x 107 1,25E+07

Dosis de infección

Bac

teria

s ad

herid

as(u

fc/m

l)

1,25 x 107

Asociación de B. cereus (sin lavar) a Caco-2

El kefiran disminuyó significativamente el número de bacterias asociadas a las células intestinales.

AsociaciAsociacióón de B n de B cereuscereus

12

BCaco-2 AB. cereus

El kefiran es capaz de interactuar con la superficie de los enterocitos y de las bacterias.

Interacción entre kefiran, células Caco-2 y B. cereus

Citometría de flujo

13

Ultrasonic Transducer

488nm Formard Light Scatter Detector

Collimated Light Path Through Dichroic and Band Pass Filters

SS FL2FL1

FL4

FL3

Pulse Height (0-10Volts)

Time(useconds)

Pressurized 1X PBS(Sheath)

Pressurized CellSample

Analog Data

PMTs

Flow Cytometry and sorting

Flow Cytometry DataFlow Cytometry Data

Larger Region includes all cells

Smaller Region, Live cells mostly

tamaño

complejidad

14

2 Parameter Histogram2 Parameter Histogram

FITC FL

PE FL

Negative Population

Single Positive FITC Population

Single Positive PI Population

Double Positive Population

Citometría de flujo

1 Parameter Histogram1 Parameter Histogram

1 2 3 4 6 7 150 160 170 .. 190

Channel Number

Positive

Negative

BrighterDimmerCount

1

4

6

Fluorescence picked up from the FITC PMT

15

May GMay Güünnwaldwald--GiemsaGiemsa

TinciTincióón del n del citoesqueletocitoesqueleto con con faloidinafaloidina--FITCFITC

MicroscopMicroscopíía electra electróónica de barridonica de barrido

Alteraciones morfológicas

CONTROL B. cereus

Preincubación,Infección con B.cereus

B. cereus + kefiran

Los tratamientos con kefiran fueron capaces de preservar la morfología de las células.

16

Sin kefiran

Con kefiran

Faloidinadina- FITC

Efecto de Bacillus cereus sobre células Caco 2

Control

Medrano et al 2009Medrano et al 2009

Bacillus cereus sobre Caco 2:

Caco 2 preincubadas con kefiran

Efecto de Bacillus cereus sobre células Caco 2

Microscopia electrónica de barrido Medrano et al 2009Medrano et al 2009

17

30

1 107 bacilos/ml

Sin kefiran Pretratadas con kefiran

30,

60,

Efecto de Bacillus cereus sobre células Caco 2

0102030405060708090

100

5.00E+07 2.50E+07

Dose of infection

%At

ache

dce

lls

* *

% C

é lul

as a

dher

idas

Dosis de Infecci ón

0102030405060708090

100

5.00E+07 2.50E+07

Dose of infection

%At

ache

dce

lls

* *

0102030405060708090

100

5 x 107 2.5 x 107

Dose of infection

%At

ache

dce

lls

* *

% C

élul

as a

dher

idas

Dosis de infección

El tratamiento de preincubación de los enterocitos con kefiran preservólas células del desprendimiento.

Control de infecciónInfección + kefiranPreincubación e Infección

Desprendimiento celular

18

Caco-2 confluentes y diferenciadas

Toxinas

Kefiran

Efecto de sobrenadantes de Bacillus cereus sobre células Caco 2

Medrano et al 2008Medrano et al 2008

Sin kefiran

Microscopia electrónica de barrido

Tinción con Ioduro de propidio

Efecto de sobrenadantes de Bacillus cereus sobre células Caco 2

Con kefiran

19

Interacción del kefiran con células epiteliales y toxinas

Control Con kefiran

Sin kefiran

Células Caco 2-Tinción con cristal violeta

0 200 400 600 800 1000

4550556065707580859095

100

Atta

ched

Cel

ls (%

)

Kefiran Concentration (mg/L)

** *

* *

Kefiran ( mg/L

Cél

ulas

adh

erid

as (%

)

Medrano et al 2009Medrano et al 2009

RuasRuas MadiedoMadiedo et al et al

Interacción del polisacáridos de Bifidobacterium con células epiteliales y toxinas

BifidobacteriumBifidobacterium animalisanimalis subspsubsp lactislactis

20

4.7x103

(63%)3.2x104 (9%)3.7x106

(28%)2.6IPLA-R1

5.2x103

(85%)2.9x104 (15%)-3.1A1

Cepa Cepa MMMM

FracciFraccióón de PMn de PM

altoalto mediomedio bajobajo

CaracterCaracteríísticas de los EPS de sticas de los EPS de BifidobacteriumBifidobacterium

R1 produce EPS de alto PM y A1 de bajo PMR1 produce EPS de alto PM y A1 de bajo PMRuasRuas madiedomadiedo et al 2010et al 2010

Ruas Madiedo et al Journal of Dairy Science Vol. 89 No. 7, 2006

Villian: eps de la leche fermentada villi

21

DUODENUM

COLON

ILEUM

CholesterolLIVER

Conjugated bile salts

OH

Amino acid

OHPrimary bile

salts

Enterohepaticcirculation

GALL BLADDER

Feces

EPS(Not digested fiber)

OH

Conjugated bile salts

OH

Primary bile salts

Hydrolases(probiotics)

Amino acid

Secondarybile salts

OH7-α-deshidroxilation

EPS

EPS(prebiotic)

(“entrapping”agent)

DUODENUM

COLON

ILEUM

DUODENUM

COLON

ILEUM

COLON

ILEUMILEUM

CholesterolCholesterolLIVER

Conjugated bile salts

OH

Conjugated bile salts

OHOHOH

Amino acidAmino acid

OHPrimary bile

saltsOHOHPrimary bile

salts

Enterohepaticcirculation

GALL BLADDER

GALL BLADDER

Feces

EPS(Not digested fiber)

Feces

EPS(Not digested fiber)

OH

Conjugated bile salts

OHOHOH

Conjugated bile salts

OH

Primary bile salts

Hydrolases(probiotics)

Amino acid

OH

Primary bile salts

OHOH

Primary bile salts

Hydrolases(probiotics)

Amino acid

Hydrolases(probiotics)

Amino acidAmino acid

Secondarybile salts

OH7-α-deshidroxilation

Secondarybile salts

Secondarybile salts

OH7-α-deshidroxilation OH7-α-deshidroxilation

EPS

EPS(prebiotic)

(“entrapping”agent)

Efecto de EPS en el metabolismo del colesterol Efecto de EPS en el metabolismo del colesterol

Inhibe absorciInhibe absorcióón por captura n por captura

Favorece el transito Favorece el transito (absorbe agua)(absorbe agua)

PrebiPrebióóticotico

RuasRuas MadiedoMadiedo et al 2008et al 2008

EPS que producen efecto EPS que producen efecto hipocolesterolhipocolesteroléémicomico

VillianVillian producido por producido por L L lactislactis supspsupsp cremoriscremoris SBT0495SBT0495Menor nivel de colesterol sMenor nivel de colesterol sééricoricomayor relacimayor relacióón entre Col HDL /Col totaln entre Col HDL /Col total

Kefiran producido por Kefiran producido por LactobacillusLactobacillus kefiranofacienskefiranofaciensReduce colesterol total y TG sReduce colesterol total y TG sééricos ricos Reduce presiReduce presióón sangun sanguíínea nea y disminuye la deposiciy disminuye la deposicióón de ln de líípidos en la aortapidos en la aorta

MaedaMaeda et al 2004et al 2004

Nakajima et al 1992

22

Vinderola et al. / Cytokine 36 (2006) 254–260

Kefiran y sistema inmuneKefiran y sistema inmune

Vinderola et al. / Cytokine 36 (2006) 254–260

23

% C

élul

as Ig

A+/1

0 ca

mpo

s050100150200250300350400

Control

*

2 días EPS Control 7 días EPS

La administración oral de kefiran en ratones a los 2 y 7 días indujo un

incremento significativo en el número de células IgA+ en lamina propria

comparado con los grupos control2 días 7 días

*

Estudio de células IgA+ en lamina propria

La administración oral de kefiran en ratones indujo un incremento en las células caliciformes productoras de mucus. El aumento en la producción de mucus puede relacionarse con mecanismos de reparación de epitelio.

0

10

20

30

40

50

1

*

*

60

11

Num

ero

de c

élul

as c

alic

iform

es

/10

vello

sida

des

Control 2 días 7 días

Células productoras de mucus

24

Teruya et al Cytotechnology 40: 107–116, 2002.

Kefiran y captaciKefiran y captacióón de glucosa en n de glucosa en miocitosmiocitos

Kefiran Kefiran

Efecto Efecto inunomoduladorinunomodulador

ProtecciProteccióón de n de epitelioepitelio InteracciInteraccióón n

con patcon patóógenosgenos

Efecto Efecto anticolesterolanticolesteroléémicomico

diabetesdiabetes

prebiprebióóticotico