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166/2014 Laboratorio Veterinario Avedila

CONSEJO DE REDACCIÓN

EDITOR:Marta Eulalia García Sá[email protected]

VOCALES:

Ramón Juste

Concepción Caballero Galván

Carmina Nogareda Burch

Josep Carrera Mauri

José-Marín Sánchez Murillo

Lourdes Porquet

Virginia Vigo LópezEva Monleón MoscardóMariano Morales Amella

REDACCIÓN:

Secretaría de AVEDILA

Parque Tecnológico de Bizkaia, 812

Berreaga, 1

48160 Derio - Bizkaia

Página web: www.avedila.com

EDITA:

PRODIVE, S.A. para AVEDILA

PUBLICIDAD:

PRODIVE S.A

Valle de Pinares Llanos, 34

Edif. D - 5º D

280035 MADRID

Tel: 91 563 60 02 - Fax: 91 564 09 40

DISEÑO Y MAQUETACIÓN:

PRODIVE, S.A.

FOTO PORTADA:

Resultado de un antibiograma por la técnica de E-test.

PUBLICACIÓN DE LA ASOCIACIÓN DE

VETERINARIOS ESPECIALISTAS EN

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

Dep. Legal: M-42157-1997

ISSN 1697 – 8099

Los indicadores macroeconómicos parecen señala que la crisis

económica que tanto hemos sufrido está pasando. Esperemos que

esto se traduzca pronto en la denominada microeconomía, es

decir, en nuestra vida diaria. Será entonces el momento de pedir a

nuestros gobernantes que parte de los tremendos esfuerzos que

hemos realizado se vean de alguna forma recompensados, si no

con una vuelta a la situación que vivíamos en 2008, sí con una

disminución clara de los recortes en el estado del bienestar que

hemos sufrido. Y esta situación que todos vivimos a nivel

particular, debería también reflejarse en aspectos de gran

importancia para un país, como puedan ser las inversiones en

Investigación y Desarrollo, así como en Sanidad. Y recordemos

hablando de Sanidad que esta no se refiere únicamente a los

gastos directamente relacionados con la Salud Humana, sino

también con la Sanidad Animal. No olvidemos que en la vida

actual, donde el concepto “Un mundo, una salud” se hace cada

vez más presente, el poder tener un buen estado sanitario animal

se va a traducir inexorablemente en una mejora evidente de la

Salud Humana.

Nuestra Asociación ha podido superar la crisis como en el fondo

ha sucedido con España: con el sacrificio y la responsabilidad de

todos nosotros, en nuestro caso particular, de nuestros Asociados.

Gracias a ellos, y muy especialmente a las Empresas

patrocinadoras (a las que nunca podremos agradecer lo suficiente

la ayuda de estos años), hemos conseguido ir celebrando nuestras

reuniones científicas anuales, superándonos de edición en edición

tanto en el aspecto científico como en el social.

En el próximo número de la revista esperamos poder publicar

aspectos concretos de la que será nuestra XIX edición en la ciudad

de Zaragoza. Una reunión que tendrá que ser la del optimismo, la

del adiós a la crisis, y como han sido las 18 anteriores, la del

trabajo, la del esfuerzo, la del empeño y la vocación por conseguir

una mejora de la Sanidad Animal.

La Junta Directiva

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RESUMEN

La importancia de la agalaxia contagiosa en ganadocaprino de aptitud láctea ha generado la necesidadde elaborar programas de control basado en técni-cas de diagnóstico que permitan la detección de losagentes causales de esta enfermedad en muestras deleche. El objetivo del presente estudio fue estudiarlos parámetros de validez y el umbral de detecciónde tres protocolos de PCR, así como la influenciaque ejerce el uso de diferentes métodos de extrac-ción del ADN sobre dicha técnica. Para ello, se em-plearon 5 muestras de leche de cabra a las que seles adicionaron diferentes concentraciones deMycoplasma agalactiae, para posteriormente apli-car sobre cada una de ellas los dos métodos de ex-tracción de ADN y las 3 técnicas de PCR a compa-rar. Los resultados mostraron que el uso de diferen-tes protocolos de PCR no modificó la detección deM. agalactiae en muestras de leche de cabra. Por elcontrario, la utilización de métodos de extracciónde ADN que incorporan proteinasa redujo el límitede detección de la técnica y aumentó la sensibilidad

de la misma para la detección de M. agalactiae enmuestras de leche de cabra.

INTRODUCCIÓN

Mycoplasma agalactiae es el principal agente cau-sal de la agalaxia contagiosa (AC) en España. Estaenfermedad, de distribución mundial, se presentade forma endémica en algunas regiones como lacuenca mediterránea, originando pérdidas econó-micas en rebaños ovinos y caprinos de aptitudláctea (Corrales et al., 2007). Por ello, con el finde conocer la situación epidemiológica de las ex-plotaciones y realizar el diagnóstico de enferme-dad en rebaños crónicamente afectados, se reco-mienda llevar a cabo programas de control basa-dos en la toma de muestras procedentes demamitis clínica y tanque de leche (Amores et al.,2012).

Dentro de estos programas de control, se llevan acabo técnicas de diagnóstico directo como el culti-vo, aislamiento e identificación bacteriana y las de


LÍMITES DE DETECCIÓN DE PROTOCOLOS DE

PCR PARA EL DIAGNÓSTICO DE MYCOPLASMA

AGALACTIAE EN MUESTRAS DE LECHE DE CABRA

Tatay-Dualde, J.; Amores, J.; Prats-van der Ham, M.; Gómez-Martín, A.; Paterna, A.; Corrales, J.C.;Contreras, A.; De la Fe C.; Sánchez, A.

Grupo de Investigación Sanidad de Rumiantes.Departamento de Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria.Campus Regional de Excelencia Internacional Mare Nostrum. Universidad de Murcia. 30100 Murcia (España).

E-mail: [email protected]

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reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Amo-res et al., 2012). En los últimos años se han des-crito un gran número de protocolos de PCR con elfin de obtener un diagnóstico más rápido y sensi-ble que los aportados por las técnicas de cultivoconvencional (Tola et al., 1996; Marenda et al.,2005; De la Fe et al., 2012). Sin embargo, diver-sos estudios han demostrado la presencia de inhi-bidores de la PCR en las muestras de leche, de talforma que esta técnica se podría presentar limita-ciones para el diagnóstico con este tipo de mues-tras (Bicley et al., 1996; Becker et al., 2012). Asi-mismo, se ha demostrado que los parámetros devalidez y los límites de detección obtenidos en eldiagnóstico mediante PCR presentan grandes va-riaciones en función de la muestra sobre la que serealice (Tola et al., 1996), siendo capaz de detec-tar la presencia de M. agalactiae a concentracio-nes más bajas cuando se trabaja sobre medios decultivo en lugar de emplear las propias muestrasde leche. De esta forma, está comprobado que elcultivo previo a la PCR de las muestras de lecheaporta mejores valores de sensibilidad que cuandoésta se analiza directamente (Oravcová et al.2009). Como paso previo a las técnicas de PCR,es necesario realizar la extracción y purificacióndel material genético. En los últimos años se handescrito un gran número de protocolos de extrac-ción del ADN. Así, Tola et al. (1997) fueron losprimeros en describir un método de extracción di-señado específicamente para muestras de leche,alcanzando una mayor sensibilidad en el diagnós-tico de M. agalactiae. Actualmente, existen unagran variedad de métodos de extracción desarro-llados por laboratorios comerciales, sin embargo,el efecto de esta técnica sobre el límite de detec-ción de la PCR y su sensibilidad diagnóstica aunno se han determinado.

Debido a la importancia de las técnicas diagnósti-cas dentro de los programas de control, y a los es-tudios previos en los que se demuestra la gran va-riabilidad que presentan dichas técnicas en fun-ción de las condiciones en las que se llevan acabo, el objetivo de este trabajo fue estudiar losparámetros de validez y el umbral de detección detres protocolos de PCR diferentes sobre muestrasde leche de cabra inoculadas experimentalmente,así como la influencia que ejerce el uso de dife-rentes métodos de extracción del ADN.

MATERIAL Y MÉTODOS

Muestras de leche

Se recogieron un total de 5 muestras de leche decabra. Una de las muestras se tomó del tanque ylas otras 4 se tomaron de distintas cabras seleccio-nadas de forma aleatoria. Todas ellas, se tomaronde un rebaño sin historial previo de AC y fueronnegativas a M. agalactiae mediante cultivo con-vencional de micoplasmas (Nicholas y Baker,1998) y a una técnica especifica de especie dePCR (Marenda et al., 2005).

Inóculo bacteriano

A las muestras se les añadieron diferentes concen-traciones de M. agalactiae. Para ello, se partió deuna muestra de la cepa de referencia PG2 (NCTC10123) que se replicó en medio Hayflyc modifica-do (Kirchhoff y Rosengarten, 1984) hasta alcanzarla fase de crecimiento en meseta (48 horas). Apartir de dicho cultivo, se realizaron diluciones se-riadas en base 10 para adicionar en distintas alí-cuotas de las muestras de leche diferentes concen-traciones de micoplasma. Así, a cada alícuota delas muestras de leche se le agregó una concentra-ción de M. agalactiae diferente que posteriormen-te se determinó mediante el recuento de UFC/mlviables (Albers y Flecher, 1982). De esta forma, alas cinco muestras empleadas para nuestro estu-dio, se les añadieron concentraciones de entre 108

y 10 UFC/ml.

Análisis realizados

De cada muestra se tomaron nueve alícuotas a lasque se les agregaron concentraciones diferentes deM. agalactiae en un rango entre 108 y 10 UFC/ml,dejando una intacta para obtener un control nega-tivo. Posteriormente, todas las alícuotas de las cin-co muestras se analizaron siguiendo el mismo pro-cedimiento, realizándose 2 repeticiones para cadaanálisis. Se tomaron dos alícuotas de 200μl pararealizar dos extracciones de ADN de cada muestrainoculada, empleando un kit comercial (High PurePCR Template Preparation Kit, Roche Diagnos-tics) y la técnica descrita por Tola et al. (1997).Posteriormente, estas muestras se analizaron me-diante los tres protocolos de PCR descritos ante-

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riormente (Tola et al., 1996; Marenda et al., 2005;De la Fe et al., 2012). Con ello, obtuvimos un to-tal de 540 resultados analíticos.

Análisis estadístico de los resultados

Para el cálculo de los parámetros de validez, obte-nidos en función del método de extracción y pro-tocolo de PCR realizado, se empleó el programaWin Episcope 2.0 (Thursfield et al., 2001).

El estudio de la influencia del método de extraccióny protocolo de PCR sobre la sensibilidad de la téc-nica empleada, se realizó mediante el cálculo de laprueba Chi cuadrado; para ello, se utilizó la aplica-ción Análisis de programa integrado de estadísticaepidemiológica Epi Info 3.5.2 (Dean et al., 1996).

RESULTADOS

Para evaluar la sensibilidad dela técnica de PCR a diferentesconcentraciones de M. agalac-tiae, estudiamos la influenciasobre los resultados del proto-colo y el método de extrac-ción de ADN empleado. Así,según se muestra en la tabla 1,el uso de diferentes protocolosde PCR, no dio lugar a dife-rencias estadísticamente signi-ficativas. Por otro lado, comose observa en la tabla 2, am-bas técnicas de extracciónpresentaron diferencias esta-dísticamente significativas.De esta forma, las PCR que serealizaron mediante el usoprevio de la extracción del kitcomercial obtuvieron un ma-yor número de resultados po-sitivos en muestras con con-centraciones de M. agalactiaede 10 a 107 UFC/ml (44,6%).En el caso de las PCR realiza-das sobre muestras extraídasmediante el método descritopor Tola et al. (1997), éstasdeterminaron un 33,8% de po-

sitivos en concentraciones de 10 a 107 UFC/ml deM. agalactiae.

En cuanto al límite de detección, éste también varióen función del método de extracción empleado.Cuando la extracción del ADN se realizó medianteel kit comercial, la PCR fue capaz de detectar la pre-sencia bacteriana en una concentración mínima de102 UFC/ml. En el caso de la extracción mediante elprotocolo de Tola et al. (1997), el límite de detecciónse fijó en 104 UFC/ml. Estos límites de detección sealcanzaron con valores de sensibilidad bajos, de talforma que, para que la sensibilidad fuera superior al70%, la concentración de M. agalactiae fue de 105

UFC/ml en el caso del kit comercial y 106 UFC/mlcuando se empleó la extracción de Tola et al. (1997).Estos datos se presentan en la figura 1.


Tabla 1: Detección de Mycoplasma agalactiae en función delprotocolo de PCR empleado en muestras de leche de cabra con un

rango de concentración de 107 a 101 UFC/ml.

Protocolo PCR Resultados de la PCRNegativo Positivo (n) Positivo (%)

Tola et al. (1996) 78 58 42,6a

Marenda et al. (2005) 80 56 41,2a

De la Fe et al. (2012) 90 46 33,8a

a: Valores con diferente superíndice presentan diferenciasestadísticamente significativas (p < 0,05).

Tabla 2: Detección de Mycoplasma agalactiae según el método deextracción de ADN utilizado en muestras de leche de cabra con un

rango de concentración de 107 a 101 UFC/ml.

Método de Resultados de la PCRextracción Negativo Positivo (n) Positivo (%)Kit comercial 113 91 44,6a

(Roche diagnosis)Tola et al. (1997) 135 69 33,8b

a, b: Valores con diferente superíndice presentan diferenciasestadísticamente significativas (p < 0,05).

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DISCUSIÓN

En el estudio de diferentes protocolos de PCR, nose encontraron diferencias estadísticamente signi-ficativas para el diagnóstico de M. agalactiae enconcentraciones desde 10 a 107 UFC/ml. La cepade referencia empleada en este estudio (PG2) hasido contrastada en el desarrollo de los tres proto-colos de PCR empleados (Tola et al., 1996; Ma-renda et al., 2005; De la Fe et al., 2012). Todosellos amplifican un fragmento específico de M.agalactiae, por lo que la ausencia de diferenciasestadísticamente significativas confirma que estosprotocolos amplifican una región altamente con-servada, tanto entre cepas de campo como la dereferencia. Sin embargo, en el estudio del métodode extracción, se determinó que el kit comercialera capaz de detectar una proporción de verdade-ros positivos superior a las que se realizaron conla extracción de Tola et al. (1997). Además, estefactor también determinó diferencias en el límitede detección y la sensibilidad de la técnica.

La principal diferencia existente entre los dos mé-todos de extracción empleados, es la incorpora-ción de un paso previo de desnaturalización de lasproteínas presentes en la muestra mediante protei-nasa K, que se realiza en la extracción mediante elkit comercial (High Pure PCR Template Prepara-tion Kit, Roche Diagnostics). El uso de esta enzi-ma, junto con la aplicación de altas temperaturas,inactiva a inhibidores de la PCR presentes en lasmuestras de leche. En estudios anteriores ya se ha

comprobado la presencia de estosinhibidores (Bickley et al., 1996;Becker et al., 2012). La PCR directasobre muestras leche se puede inhi-bir por la presencia de endonuclea-sas de origen celular. Estas enzimasactúan sobre cadenas de ADN pu-diendo interferir en el proceso deamplificación de los fragmentos es-pecíficos. Además, los iones calciopresentes en la leche también van ainhibir la acción de la polimerasadebido a la afinidad que presentanpor las moléculas de ADN, impi-diendo de esta forma la unión de lapropia polimerasa (Bickley et al.,1996). La importancia de estos inhi-

bidores quedó de manifiesto en estudios realiza-dos por Becker et al. (2012), en los que se com-probó que en igualdad de concentración de mico-plasmas, al realizar la PCR sobre muestras deagua, está era más sensible que al realizarla sobremuestras de leche.

En cuanto al límite de detección de los protocolosde PCR, la comparativa con otros estudios resultadifícil de realizar debido a las diferencias en méto-dos de extracción, protocolo de PCR y tratamientoprevio de la muestra de leche. Becker et al.(2012), también realizaron un ensayo sobre mues-tras de leche de cabra inoculadas experimental-mente en condiciones similares a las nuestras. Enél, detectaron la presencia de M. agalactiae hastaconcentraciones de 3,5 x 102 UFC/ml. Este dato essimilar al límite de detección alcanzado en nuestroestudio cuando empleamos la extracción del kitcomercial, si bien se utilizó un protocolo de q-PCR en dicho estudio (Becker et al., 2012). Tolaet al. (1996) al trabajar directamente sobre mues-tras de leche inoculadas artificialmente alcanzaronun límite de detección de 104 UFC/ml, coincidien-do con el límite de detección obtenido en nuestroestudio con la extracción de Tola et al. (1997).Posteriormente, Tola et al. (1997) mejoraron elprotocolo de extracción del ADN, consiguiendodisminuir el límite de detección en muestras ino-culadas artificialmente a 102-103 UFC/ml. En estecaso, en nuestro estudio, estos valores solo se pu-dieron alcanzar cuando la extracción del ADN serealizó mediante el kit comercial, pero no con el


Figura 1. Límites de detección y sensibilidad diagnóstica de la PCR según elmétodo de extracción de ADN y la concentración de Mycoplasma agalactiaepresente en la muestra de leche de cabra.

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método de extracción propuesto por Tola et al.(1997).

La importancia de los límites de detección de lastécnicas diagnósticas está relacionada con la ca-pacidad de éstas para detectar la excreción porparte de animales afectados. En este sentido, sehan realizado estudios sobre los niveles de excre-ción de Mycoplasma spp. tanto en ovino (Sanchiset al., 2000) como en caprino (Kinde et al.,2004; Castro-Alonso et al., 2010). Kinde et al.(2004) analizaron la excreción de M. agalactiaeen muestras de leche procedentes de animales deuna explotación con un brote de AC. Concluye-ron que en este tipo de brotes, M. agalactiae seexcreta en concentraciones de entre 106 y 108

UFC/ml. Estos datos fueron corroborados poste-riormente por Castro-Alonso et al. (2010) quie-nes se realizaron inoculaciones intramamariasexperimentales de 1010 UFC/ml., observando que,a los 5 días postinfección, los animales excreta-ban en leche 1012 UFC/ml y que esta concentra-ción descendía hasta 109 UFC/ml de M. agalac-tiae a los 45 días postinfección. De la misma for-ma, Sanchis et al. (2000) pusieron de manifiestoque durante una infección experimental en gana-do ovino, tras los primeros días postinfección, elagente se elimina en muestras de leche a concen-traciones de entre 108 y 1012 UFC/ml. Sin embar-go, tras 49 días postinfección, esta concentracióndescendió a un rango de entre 102 y 103 UFC/ml.Con estos datos y los límites de detección de lastécnicas estudiadas, independientemente del mé-todo de extracción empleado, las técnicas dePCR serían capaces de detectar la presencia deM. agalactiae en un brote agudo de AC. Sin em-bargo, según evoluciona el proceso, estas técni-cas perderían sensibilidad siendo en este casomás recomendable el uso de métodos de extrac-ción que incorporen la digestión con proteinasa.

Con todo lo anterior, el uso de las técnicas de PCRpara el análisis de muestras de tanque donde laconcentración bacteriana de la muestra es descono-cida, un límite de detección de 102-104 parece insu-ficiente para la detección del agente que presumi-blemente debería encontrarse en concentracionesmenores a las que se presenta en muestras de ani-males individuales. Por ello, en el diagnóstico dela AC sobre muestras de tanque, éstas deberían so-

meterse a un procedimiento previo que aumente lasensibilidad de la técnica. En este sentido, destacala importancia de realizar un cultivo previo de lamuestra en medio específico para el crecimiento demicoplasmas y posteriormente, realizar la extrac-ción sobre el cultivo en lugar de sobre la propiamuestra de leche (Oravcová et al., 2009).

CONCLUSIONES

El uso de diferentes protocolos de PCR no modifi-ca la detección de M. agalactiae en muestras deleche de cabra, mientras que la utilización de dis-tintos métodos de extracción de ADN sí influyesignificativamente en los resultados de la técnica.Así, la utilización de métodos de extracción deADN que incorporan proteinasa reduce el límitede detección de la técnica y aumenta la sensibili-dad de la misma para muestras de leche de cabracon bajas concentraciones de M. agalactiae.

AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo ha sido financiado por el Pro-yecto AGL2009-09128 del Ministerio de Educa-ción y Ciencia. Ángel Gómez Martín y Ana Pater-na son beneficiarios de becas de F.P.U. de la Uni-versidad de Murcia. Juan Tatay-Dualde y MirandaPrats-van der Ham son beneficiarios de sendasAyudas de iniciación a la investigación de la Uni-versidad de Murcia.

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INTRODUCCIÓN

El síndrome reproductivo y respiratorio porcino(PRRS) es una de las enfermedades porcinas másimportantes en la mayoría de países productores.El diagnóstico es fundamental para su control, ycada vez se investigan métodos más precisos, másrápidos, más económicos y menos estresantes paralos animales. De aquí la importancia que ha adqui-rido en los últimos años el uso de fluidos orales

(FO) como alternativa al suero en el diagnóstico ymonitorización del PRRS.

Sin embargo, la validación de los kits para estetipo de muestra es un proceso laborioso querequiere adaptar completamente los ELISAs yaexistentes para suero. Un anterior estudio (publica-do en la revista AVEDILA abril 2013), en el que seensayaron diferentes conjugados (anti-IgG1+anti-IgA, anti-IgG1 y anti-IgG1 concentrado – concen-


USO DE FLUIDOS ORALES PARA LAMONITORIZACIÓN DE PRRS EN UN GRUPO

DE CERDAS NULÍPARAS INFECTADAS

Alba Martos-Raich1, Marta Badosa-Brossa1, Ester Coma-Oliva1, Jordi Serra-Martínez2,Xavier Barrera-Toro3, Llorenç Planasdemunt-Regàs3, Lourdes Porquet-Garanto1, Xavier Rebordosa-Trigueros1.

1 HIPRA. 17170 Amer, Girona, España. 2 Biofar Laboratoris, S.L 08261 Cardona, Barcelona, España. 3 AVP Planasdemunt i Associats 17400 Breda, Girona, España

Figura 1. Muestras obtenidas a lo largo de la prueba. W0-W8: Semanas post-infección.

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trado respeto al utilizado para el suero-), ofreciómuy buenas expectativas en cuanto al uso de losFO como monitoreo de PRRS. En esta mismapublicación, se observó cómo el conjugado mássensible era el IgG1+IgA, seguido del IgG1 con-centrado y, finalmente, del IgG1.

El objetivo de este ensayo es aportar nuevos datospara la validación de CIVTEST® SUIS PRRS E/Sa la muestra de FO, para que este ELISA pueda serutilizado tanto para suero como para FO.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se escogieron 10 grupos de 10 nulíparas cada uno,separados en 10 corrales. Los ani-males eran negativos a PRRS en elmomento del inicio de la prueba(W0) – PCR y serología negativos-.En ese mismo instante, se infecta-ron con un inóculo infeccioso dePRRS tipo 1 vía intramuscular enlas tablas del cuello y, posterior-mente, se monitorearon durante 8semanas post-infección, tal comoindica la Figura 1.

La sangre se extraía mediante pun-ción en la vena yugular, y los FO seobtenían de una cuerda de algodón,siguiendo el procedimiento especi-ficado en las Figuras 2.1-2.5.

En el laboratorio, se analizaron los sueros conCIVTEST® SUIS PRRS E/S (según indicacionesdel fabricante), y los FO mediante CIVTEST®

SUIS PRRS E/S (conjugados anti-IgG1+anti-IgA,anti-IgA e anti-IgG1 concentrado; dilución 1:2 eincubación toda la noche a 4ºC) y RT-PCR.

RESULTADOS

Para comprobar la correcta inoculación de los ani-males se realizó la RT-PCR de las muestras de FO.Todos los lotes fueron negativos por RT-PCR en elmomento de la infección y resultaron positivos(virémicos) en la primera semana post-infección(Tabla 1).

Figuras 2.1-2.5. Procedimiento de obtención de las muestras de fluidos orales.2.1. Se pone la cuerda en el corral (1 cuerda cada 15-20 animales), a la altura de los ojos de los animales. Deben evi-tarse sitios sucios, como las esquinas o cerca de bebederos-comederos. La cuerda debe ser de algodón, sin que se lehaya aplicado ningún tratamiento químico.2.2-2.3. Se coloca la cuerda (el extremo húmedo) en una bolsa de plástico limpia, y se exprime todo el FO posible.2.4. Se traspasa el FO a un tubo de centrífuga tipo Falcon limpio.2.5. Envío de muestras refrigerado

Tabla 1. Resultados RT-PCR para las muestras de FO obtenidas a lo largodel estudio (semanas 0-8). POS: Positivo; NEG: Negativo.

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En cuanto a la serología, comose esperaba, el conjugado anti-IgG1+anti-IgA fue el más sensi-ble en momentos cercanos al ini-cio de la infección (primera ysegunda semanas post-infec-ción), llegando a comprometer laespecificidad del kit cuando losanimales eran negativos (W0),con valores positivos (valoressuperiores a 20) antes de iniciarel estudio (Tabla 2).

Analizando las muestras con elconjugado anti-IgG1, la sensibi-lidad en los momentos tempra-nos de la infección se veía redu-cida respeto al caso anterior; dehecho, en la segunda semanapost-infección, sólo la mitad delos corrales se interpretabancomo positivos. Sin embargo,por un lado, no se observaronresultados falsos positivos a W0.Por otro lado, todos los corralesfueron positivos a W3 y estapositividad se mantuvo hasta elfinal del estudio (Tabla 3).

Respeto al conjugado anti-IgA,éste permitió detectar temprana-mente la seroconversión pero lasensibilidad se redujo drástica-mente a partir de la segundasemana post-infección, dandocomo negativos algunos lotesclaramente positivos cuando seanalizaban con alguno de losotros dos conjugados (Tabla 4).

DISCUSIÓN YCONCLUSIONES

Como ya se ha comentado, elconjugado que ofrece una mayorsensibilidad es el combinado(anti-IgG1+anti-IgA). Sinembargo, la media (ELISA) delas cuerdas a W0 es muy cercanaal punto de corte. Esto no supon-dría gran problema en el monito-reo de granjas positivas, pero sílo podría ser en el análisis deanimales negativos (por ejemplo,cerdas de reposición o núcleosgenéticos libres de PRRS) o en el


Tabla 3. Resultados obtenidos con los FO mediante CIVTEST® SUIS PRRSE/S, empleando el conjugado anti-IgG1, a lo largo del seguimiento realizado,

semanas 0-8; en sombreado los IRPC(%) con un valor superior a 20. W0-W8: Semanas post-infección.

Tabla 4. Resultados obtenidos con los FO mediante CIVTEST® SUIS PRRSE/S, empleando el conjugado anti-IgA, a lo largo del seguimiento realizado,

semanas 0-8; en sombreado los IRPC(%) con un valor superior a 20. W0-W8: Semanas post-infección.

Tabla 2. Resultados obtenidos con los FO mediante CIVTEST® SUIS PRRSE/S, empleando el conjugado combinado anti-IgG1+anti-IgA, a lo largo del

seguimiento realizado, semanas 0-8; en sombreado los IRPC(%) con un valorsuperior a 20. W0-W8: Semanas post-infección.

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seguimiento de transiciones provenientes de gran-jas que están desarrollando un plan de control/eli-minación del virus.

Por otro lado, el conjugado anti-IgG1 es menossensible pero no presenta problemas de especi-ficidad a W0. No obstante, sigue ofreciendovalores IRPC (%) superiores a la media de lossueros, tanto en la tercera como en la séptimasemana post-infección, lo cual es indicativo dela buena sensibilidad del kit con la muestra deFO (Figura 3).

Por último, el conjugado anti-IgA ofrece buenasensibilidad en las fases tempranas de la infec-ción, pero no posteriormente.

Así entonces, la mejor opción para el nuevo kitCIVTEST® SUIS PRRS E/S PLUS es el uso deun conjugado anti-IgG1 concentrado, combina-damente con la dilución de las muestras a 1:2 eincubando los FO una noche a 4ºC. Por tanto, enestas condiciones, el kit está validado tanto parael uso de suero como para el de FO para el diag-nóstico de PRRS.

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Figura 3. Las barras de color azul indican el porcentaje de positividad con la PCR de FO, mientras que las barrasnaranjas indican el porcentaje de positivos en serología con el conjugado combinado (IgG1+IgA) y las grises con el

conjugado IgG1. La línea roja horizontal corresponde al punto de corte del kit (cualquier valor superior a 20 es consi-derado como positivo). La otra línea roja indica la media de las 10 cuerdas durante el seguimiento de las 8 semanaspost-infección (IgG1+IgA), mientras que la negra indica también los resultados de serología (FO) pero utilizando elconjugado que sólo contiene IgG1. Los círculos amarillos ubicados en la tercera y en la séptima semanas post-infec-

ción, corresponden a la media de la serología de los 100 animales incluidos en el estudio.

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INTRODUCCIÓN

Clostridium difficile es un bacilo grampositivo,esporulado y anaerobio estricto (Figura 1). Fuedescrito por primera vez por Hall y O`Toole en1935 bajo la denominación de Bacillus difficilis,en referencia a la dificultad que supone su aisla-miento y cultivo, motivado, entre otras razones,por su lento crecimiento.

Aunque C.difficile puede encontrarse en el tractointestinal del ser humano y una gran diversidad deespecies animales formando parte de la microbiotacomensal, hoy día se le considera un patógeno

oportunista emergente, tanto en medicina humanacomo veterinaria.

C.difficile está adoptando una importancia crecientepor ser agente causal de diarrea asociada a tratamien-tos antibióticos prolongados, la cual puede evolucio-nar hacia una colitis pseudomembranosa en los casosmás graves. Además, la aparición de cepas hipervi-rulentas asociadas a brotes hospitalarios hace que seanecesario un estudio más exhaustivo de este patóge-no emergente. Por su parte, C.difficile también hasido relacionado con diferentes síndromes diarreicosen animales, si bien, aún falta por esclarecer los me-canismos de patogenicidad de este anaerobio sobremuchas de estas especies animales.

En lo referente a la salud pública, la importancia deC.difficile radica en la posible aparición de reservo-rios animales que den lugar a una transmisión de labacteria hacia la comunidad. Este hecho junto consu potencial carácter zoonótico hace que sea necesa-rio un constante estudio de su presencia en el medioambiente y en las poblaciones humanas y animales.

FACTORES DE PATOGENICIDAD

C.difficile realiza su acción patógena mediante la li-beración de dos toxinas principales: toxina A (TcdA)y toxina B (TcdB). Algunas cepas hipervirulentas,como por ejemplo, las pertenecientes a los ribotipos078 y 027 producen además la toxina binaria (CDT). El mecanismo de acción de estas toxinas está to-


DETERMINACIÓN DE ANTIBIORRESISTENCIAS EN

Clostridium difficile

Cristina Orden, José L. Blanco, Sergio Álvarez-Pérez, Marta E. García

Departamento de Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria.UCM. 28040 Madrid

[email protected]

Figura 1. Tinción de Gram de bacilos esporulados deClostridium difficile. Las flechas indican la posición delos esporos.

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davía sin esclarecer, puesto que se han aisla-do cepas toxigénicas y no toxigénicas en pa-cientes con y sin diarrea. Lo mismo ocurreen medicina veterinaria, donde hay discre-pancia entre autores sobre si el aislamientode cepas toxigénicas de C.difficile se asociao no a una patología concreta.

DIAGNÓSTICO RÁPIDO EN ELLABORATORIO

El diagnóstico laboratorial de la infecciónpor C.difficile se basa actualmente en labúsqueda del microorganismo o sus toxinasen una muestra de heces del individuo.

Hasta hace poco tiempo el método de referen-cia (“gold standard”) para el diagnóstico de lainfección asociada a C.difficile era el estudiode citotoxicidad diseñado por Bartlet et al. (1978),que consiste en la detección de la actividad citotóxi-ca de las toxinas de C.difficile que pudiera conteneruna muestra sobre un cultivo celular.

Sin embargo, en la actualidad este método diag-nóstico se está sustituyendo por otra serie de kitscomerciales inmunológicos que detectan las toxi-nas directamente en la muestra de heces.

Un ejemplo dentro de este nuevo grupo de kits rá-pidos es el test Tox A/B Quik Chek (Techlab; Fi-gura 2), que consiste en un enzimoinmunoensayorápido de membrana destinado a detectar el antí-geno glutamato deshidrogenasa y las toxinas Ay/o B de C.difficile a partir de una muestra de he-ces. Además, este mismo kit puede utilizarse paraconfirmar la identidad de un cultivo sospechosode ser C.difficile, utilizando en este caso como in-óculo inicial una colonia del microorganismo to-mada de un cultivo puro.

MÉTODOS PARA DETERMINAR LASENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA DE C. difficile

Actualmente existen diversos métodos para el es-tudio de la sensibilidad antibiótica. Estas técnicasson utilizadas indistintamente por los autores se-gún sus posibilidades técnicas, sin que exista unconsenso al respecto.

Métodos de dilución

Los métodos de dilución consisten en exponer elmicroorganismo analizado frente a una batería deconcentraciones crecientes de un antibiótico, quese encuentra presente en el medio de cultivo. Se-gún la naturaleza de dicho medio de cultivo se dis-tingue entre dilución en caldo y dilución en agar.

a) Dilución en caldo: el antibiótico está presente enun medio de cultivo líquido, que, en el caso deC.difficile suele ser caldo Brucella suplementa-do con vitamina K y hemina.

En general, se suele hablar de “microdilución encaldo”, ya que la técnica suele realizarse sobreplacas estériles de material plástico que contie-nen 96 pocillos con fondo en U. Tras dispensaren los pocillos una batería de concentracionesdecrecientes del antibiótico en estudio se aplicael mismo inóculo bacteriano en cada pocillo.

Los resultados se expresan en términos de con-centración mínima inhibitoria (CMI), que sedefine como la mínima concentración de un an-timicrobiano que es capaz de impedir el creci-miento de un microorganismo en unas condi-ciones normalizadas.

En el caso de antibióticos bactericidas estaCMI se corresponde con el primer pocillo o

Figura 2. Resultado del test Tox A/B Quick Chek con un aislado positivo al antígeno GDH (línea de la izquierda)

y a la toxina (línea de la derecha)

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tubo donde no se observa crecimiento bacteria-no, mientras que en el caso de los bacteriostáti-cos la lectura se realiza en el primer pocillo otubo donde se observe una disminución signifi-cativa del crecimiento bacteriano.

b) Dilución en agar: se aplica un inóculo bacteriano auna placa de medio sólido que lleva en su compo-sición una determinada concentración del antibió-tico a estudiar. Al igual que en el caso anterior elmedio empleado es Brucella suplementado con vi-tamina K y hemina; la diferencia es que en estecaso el medio es sólido. Los resultados se expresanen CMI, y se corresponde con la primera placa deagar donde no se observa crecimiento bacterianoen el caso de antibióticos bactericidas y en la pri-mera placa donde se observa un descenso signifi-cativo del crecimiento para los bacterioestáticos.

Métodos de difusión

En la técnica de difusión en agar el microorganismoes inoculado en la superficie de una placa de agar,sobre la cual se colocan discos (difusión en disco) otiras (difusión en tira) impregnados con una concen-tración conocida de antibiótico. Durante la incuba-ción de las placas el antibiótico difunde radialmentedesde el disco o elipsoidalmente desde la tira a tra-vés del agar, de forma que su concentración va dis-minuyendo a medida que se aleja de la tira o el dis-co, hasta que llega a un punto concreto en el que laconcentración presente en el medio será incapaz deinhibir al microorganismo en estudio.

a) La difusión en disco o técnica de Kirby-Bauerconsiste en colocar un disco, generalmente depapel de filtro, impregnado con una cantidadconocida de antibiótico sobre una placa de agarBrucella suplementado con vitamina K y hemi-na. En este caso hay que medir el diámetro delhalo de inhibición expresado en milímetros yrelacionarlo con la CMI, determinada mediantealguno de los métodos de dilución.

b) La difusión en tira o E-test es una técnica basa-da en enfrentar un gradiente de antibiótico pre-definido presente en una tira de plástico frenteun microorganismo del cual queremos estudiarsu sensibilidad y que habremos sembrado pre-viamente en una placa de agar Brucella suple-

mentado con vitamina K y hemina. En un ladode la tira aparece la escala de lectura de CMIen microgramos por mililitro (μg/mL) y un có-digo que indica la identidad del antibiótico. Elreverso de la tira está impregnado de un gra-diente exponencial predefinido de antibiótico.En general el gradiente cubre un rango de con-centración continua en 15 diluciones dobles.

La buena correlación entre el E-test y los métodosde microdilución hacen de este procedimiento laalternativa ideal para el análisis de sensibilidad an-tibiótica. Además, su relativa sencillez le convierteen la mejor opción para realizar análisis de rutina.

Debido al uso extendido de esta técnica en el aná-lisis de la sensibilidad antibiótica de C.difficile, enel siguiente apartado presentamos una descripcióndetallada de la misma paso a paso.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA DE E-TEST

Como paso previo a la realización de la técnica delEtest para el análisis de la sensibilidad antibiótica deC.difficile debe tenerse en cuenta que, al ser ésta unabacteria con unas necesidades nutritivas muy exigen-tes, se deben emplear medios como el Agar Brucellasuplementados con vitamina K y hemina y el caldoBHI (infusión cerebro-corazón). Además el hecho detratar con una bacteria anaerobia estricta poco aero-tolerante hace necesario que todos los medios de cul-tivo deban estar previamente prerreducidos.

Paso 1:

Partiendo de una cepa de C.difficile aislada en cul-tivo puro se realiza una suspensión en un caldoBHI, utilizando como referencia un patrón de tur-bidez McFarland 1.

Paso 2:

A continuación, con ayuda de un hisopo de algodónestéril se siembran las placas de agar Brucella a uti-lizar en tres direcciones diferentes, con el fin deconseguir tras la incubación un tapiz de crecimien-to homogéneo por toda la placa.

Paso 3:

Una vez que todas las placas están sembradas y se-cas se procede a la colocación de las tiras de antibió-


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tico (una o dos por placa, para evitar en la medida delo posible que los halos de inhibición se solapen).Este paso se realiza con ayuda de unas pinzas estéri-les o con un aplicador, ya sea manual o automático,y teniendo especial cuidado en no mover la tira unavez ha tocado el agar, puesto que la difusión del an-tibiótico es inmediata.

Paso 4:

Una vez finalizada la colocación de las tiras de E-test se incuban todas las placas a 37ºC durante 48hen condiciones de anaerobiosis. En el caso de algu-nos ribotipos de crecimiento muy lento (como pue-de ser el 056), puede requerirse un mayor tiempode incubación (hasta 72h).

Paso 5: Lectura de resultados

Tras el periodo de incubación se procede a la lec-tura de los resultados, siempre y cuando haya uncrecimiento homogéneo cubriendo todo el agar.Se lee el valor de CMI donde el halo de inhibición

del crecimiento bacteriano cruza con el lado de latira de antibiótico.

Para los fármacos bactericidas la CMI correspondeal punto de la inhibición completa del crecimiento,incluyendo microcolonias y colonias aisladas, mien-tras que en el caso de los fármacos bacteriostáticosse lee la CMI en el punto de inhibición del 80-90%del crecimiento, según el compuesto empleado.

A partir de la CMI hay que determinar el grado desensibilidad o resistencia al antibiótico analizado. Sinembargo, en el caso concreto de C.difficile no haypuntos de corte establecidos para la mayoría de com-puestos antibióticos utilizados en medicina humana yveterinaria. En medicina humana se suelen utilizarcomo referencia los puntos de corte obtenidos en estu-dios clínicos, si bien hay discrepancias entre autores.En medicina veterinaria existen algunas complicacio-nes adicionales, como son la escasez de datos de sen-sibilidad antibiótica de los aislamientos de C.difficile

Figura 4. Preparación del inóculo en caldo BHI a partirde las colonias tomadas previamente del agar Brucella

Figura 3. Toma de colonias de C.difficile a partir de uncultivo puro crecido en agar Brucella suplementado convitamina K y hemina

Figura 5. Siembra de un inóculo en agar Brucella con unhisopo de algodón estéril.

Figura 6. Extracción de una tira de antibiótico de su contenedor

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de origen animal, y, el desconocimiento de la farma-cocinética de algunos antibióticos de uso veterinario.

No obstante, la mayoría de los aislamientos ani-males de C.difficile analizados hasta la fecha sonconsiderados resistentes a las fluoroquinolonas,mientras que permanecen sensibles al metronida-zol y la vancomicina, que son los principales anti-bióticos utilizados en el tratamiento de la infec-ción asociada a C.difficile.

Particularidades del metronidazol:

Pese a que la mayoría de las cepas de C.difficile semantienen sensibles al metronidazol en ocasio-nes se aíslan cepas resistentes, aunque la mayo-ría son resistencias inestables que revierten trasun segundo pase o tras congelación.

Otro fenómeno que ocurre con cierta frecuenciaen el caso del metronidazol son las heterorresis-tencias, que consisten en la aparición de subpo-blaciones resistentes a metronidazol en el senode una cepa considerada como sensible. Este fe-nómeno puede visualizarse en el método delEtest tras realizar una segunda incubación de laplaca con la tira de metronidazol entre 3 y 5 díasmás y evaluar la posible aparición de coloniasbacterianas dentro del primer halo de inhibición,y en la zona donde se consideraría resistente(CMI ≥ 32 μg/mL).

La metodología descrita en este artículo vienesiendo utilizada de forma rutinaria en nuestro la-boratorio para el estudio de la sensibilidad anti-biótica de aislamientos de C.difficile procedentes

Figura 7. Colocación de la tira de antibiótico en el agarBrucella previamente sembrado

Figura 8. Resultado de un antibiograma por la técnica de E-test: CMI ciprofloxacina ≥32 μg/ml.

CMI eritromicina = 0.75 μg/ml.

Figura 9. Resultado de un antibiograma por la téc-nica de E-test: enrofloxacina (9a), moxifloxacina,rifampicina (9b), teicoplanina, daptomicina (9c)

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de distintas especies animales, como pueden sercerdo ibérico (Álvarez-Pérez et al. 2013), cerdoen intensivo (Peláez et al. 2013), animales dezoo (Álvarez-Pérez et al. 2014) y perros (Blancoet al. 2012). Esta metodología está a disposiciónde aquellos profesionales interesados en estudiarla sensibilidad antibiótica de C.difficile u otrosmicroorganismos anaerobios.

CONCLUSIONES

Debido al carácter emergente y potencialmentezoonósico de C.difficile se considera prioritaria lacaracterización de los aislamientos del microorga-nismo obtenidos de hospedadores humanos y ani-males, prestando especial atención a la búsquedade genotipos hipervirulentos compartidos entreambos grupos.

Por otro lado, la aparición y transmisión de cepasde C.difficile que presentan resistencia a múltiplesantibióticos de uso común en medicina humana yanimal hace necesario el estudio continuado de lasensibilidad antibiótica de los aislamientos de esteanaerobio, con el objetivo de hacer un uso máseficiente y racional de los fármacos actualmentedisponibles.

Este trabajo fue presentado en las VIII JornadasComplutenses de Investigación para alumnospregraduados [comunicación O-82].

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Figura 10. Resultado observado en el E-test con una cepade C. difficile resistente a metronidazol

Figura 11. Resultado obtenido en el E-test con una cepade C.difficile heterorresistente al metronidazol

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