ANALISIS POR HPLC. DETERMINACIÓN DE CAFEÍNA EN BEBIDAS ENERGIZANTES

1. OBJETIVO

Este procedimiento tiene por objeto describir la metodología analítica para la separación y cuantificación de cafeína en bebidas energizantes utilizando el método de cromatografía líquida de alta eficiencia HPLC AOAC 979.08 .

2. ALCANCE

Este procedimiento se aplica al área de análisis fisicoquímico de alimentos del Grupo Laboratorio de Alimentos

3. DEFINICIONES Y ABREVIATURAS

Cantidad de platos teóricos (N): es una medida de la eficiencia de la columna. Para los picos gausianos, se calcula por las ecuaciones:

En donde TR es el tiempo de retención de la sustancia y WB es el ancho de pico en su base, obtenido al extrapolar los lados relativamente rectos del pico hasta la línea base. W50 es el ancho del pico a la mitad de la altura, obtenido directamente por integradores electrónicos.

Resolución R: La resolución se calcula por cada par de picos adyacentes como:

(t2-t1) R = ---------------------

½ (w2 + w1)

Donde t2 y t1 corresponden a los tiempos de retención de los picos 2 y1, w2 y w1 a los anchos de picos medidos en su base.

Factor de asimetría: es una medida de la simetría del pico, es la unidad para los picos perfectamente simétricos y su valor aumenta en la medida que aumenta a medida que la asimetría es más pronunciada (ver figura 1).

Figura 1. Pico cromatográfico asimétrico

4. REFERENCIAS

4.1 Método AOAC 979.08 "Benzoato, cafeína y sacarina en bebidas soda"- Método por cromatografía. Official Methods of Analysis. Association of Official Analytical Chemists. 2005 4.2 PA-06-GM-403-G44 Guía operativa para el manejo del cromatografo líquido marca Agilent

5. RESPONSABILIDADES

Los analistas del laboratorio de análisis fisicoquímico de alimentos son responsables de la aplicación de este procedimiento estándar de operación.

El coordinador del laboratorio de análisis fisicoquímico de alimentos es responsable de verificar

6. CONDICIONES PREVIAS

Conservar siempre las normas de seguridad y las buenas prácticas en el laboratorio.

Verifique que la calibración de los equipos se encuentra vigente.

Calibre el potenciómetro con soluciones certificadas vigentes.

7. PROCEDIMIENTO

7.1 MATERIALES

7.1.1 EQUIPOS

Cromatógrafo liquido de alta eficiencia con bomba cuaternaria, desgasificador en línea para cuatro canales, automuestredor y detector de arreglos de diodos o longitud de onda variable, con software para procesamiento de datos marca Agilent.Balanza analítica de sensibilidad 0,1 mgColumna de fase reversa C18 ZORBAX Eclipse XDB-C18 4.6 x 150 mm , 5 um Sistema para purificación de agua MilliQ Academic marca MILLIPOREPotenciómetro Baño de ultrasonido

7.1.2 ACCESORIOS

Sistema para filtración de solventes en vidrio Membranas para filtración de solventes marca Whatman de Nylon de 47 mm de diámetro y 0,2 um de tamaño de poro o equivalente. Balones aforados de 100 mL y 200mL clase A.Pipetas volumétricas clase A de 5,10,20,30,50 mL.Microespátula en acero inoxidable.Membranas para filtración de muestras tipo mixto (Nylon) de 25 mm de diámetro y 0.45 μm de tamaño de poro Whatman o equivalente.Tubos de vidrio con tapaViales con tapa para inyector automáticoSeptas para inyectorBaño de ultrasonidoPotenciómetro con rango de medición 0,00 a 14, unidades, exactitud ± 0.01 unidades y precisión 0.01 unidades.

7.2 REACTIVOS

Isopropanol grado HPLCAcido acéticoAcetato de sodio trihidrato R.A. Metanol grado cromatográficoAgua ultrapura : Agua resistencia específica ~ 10 megaohms/cm (como mínimo) Milli-Q

7.2.1. Soluciones

Fase Móvil:

Solvente A: CH 3COOH 15% ajustada a pH 3.0 con solución saturada de acetato de sodio.Filtre con ayuda de vacío la solución resultante a través de filtro mixto de 0,2 um.

Solvente B: Isopropanol HPLC. Filtre con ayuda de vacío la solución resultante a través de filtro mixto de 0,2 um.

7.3 PATRONES Y MATERIALES DE REFERENCIA

7.3.1. Estándares

Cafeína R.A. SIGMA (Estándar de trabajo)Cafeína USPMuestra con valor asignado FAPAS o equivalente.

7.3.2 Preparación de estándares y materiales de referencia

7.3.2.1 Soluciones estándar

Solución estándar de cafeína [1] 500 mg/l: Pesar 100 mg de cafeina, disolver con agua, transferir a un balón de 200 ml y completar a volumen con agua HPLC

Solución estándar de cafeína [2] 250 mg/l: Tomar 50 ml de solución[1], transferir a un balón de 100 ml y completar a volumen con agua HPLC

Solución estándar de cafeína [3] 100 mg/l: Tomar 20 ml de solución estándar [1] , transferir a un balón de 100 ml y completar a volumen con agua HPLC

Solución estándar de cafeína [4] 50 mg/l: Tomar 10 ml de solución estándar [1], transferir a un balón de 100 ml y completar a volumen con agua HPLC

Solución estándar de cafeína [5] 25 mg/l: Tomar 5 ml de solución estándar [1], transferir a un balón de 100 ml y completar a volumen con agua HPLC

7.3.2.2 Estándar de verificación (QC)

Un analista autorizado debe paralelamente preparar un estándar de 250 mg/l como se describió en 7.3.2.1 .

Después de inyectar todos los estándares, el estándar de 250 mg/l debe ser inyectado para hacer una verificación de la calibración.

7.4 CONDICIONES AMBIENTALES

Para el análisis de conservantes se requieren las siguientes condiciones ambientales: temperatura del ambiente y de las soluciones de estándares y muestras entre 10 y 25 ºC y humedad relativa entre 40 a 80%, requerimientos eléctricos 110 voltios.

7.5 PREPARACION DE LA MUESTRA

Preparar la unidad o unidades que conforman la muestra de análisis, homogenizar, tomar una muestra representativa y almacenarla en un recipiente de vidrio ámbar, rotulado y de cierre hermético.

7.5.1 Preparación de la solución muestra para el análisis:

7.5.1.1 Bebidas carbonatadas: Desgasifique por agitación o tratamiento con ultrasonido. Filtre a través de membranas tipo mixto de 0.45 μm para filtración de muestras, descartando los primeros mililitros de filtrado. Transvase a un vial para automuestreador Agilent.

7.5.1.2. Bebidas que contengan partículas: Filtre a través de membranas tipo mixto de 0.45 μm para filtración de muestras, descartando los primeros mililitros de filtrado. Si hay gran cantidad de partículas presentes en la muestra, centrifugue antes de filtrar. Transvase a un vial para automuestreador Agilent.

7.5.1.3 Muestra con valor asignado

Paralelamente prepare la muestra con valor asignado de acuerdo al procedimiento descrito en 7.5.1.1 y 7.5.1.2.

7.6 DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO

7.6.1 Preparación de la columna: Equilibre la columna con la fase móvil de trabajo durante 30 minutos.

7.6.2. Funcionamiento del cromatógrafo líquido

Establecer el método específico para el análisis de cafeína en bebidas energizantes siguiendo las instrucciones descritas en la guía operativa del cromatógrafo líquido.

Configuración instrumental:

Bomba cuaternariaDesgasificador en líneaAutomuestreador Detector de ultravioleta visible de longitud de onda variableSoftware para manejo de la señal instrumental.PC

Condiciones cromatográficas:

Columna de fase reversa C18 ZORBAX Eclipse XDB-C18 4.6 x 150 mm, 5 um Fase móvil: Solvente A ( CH3COOH 15% ajustada a pH 3.0 con solución saturada de acetato de sodio): solvente B (isopropanol) en proporción (98.2) Volumen de inyección: 10 ulTemperatura de columna: 20 ºC Tiempo de corrida: 10 minutos Flujo: 2 ml/min Longitud de onda: 254 nm

7.6.3 Secuencia de inyección

7.6.3.1 Inyectar una solución blanco de fase móvil en la primera inyección seguido de un blanco de reactivos (agua HPLC)

7.6.3.2 Inyectar los estándares de trabajo de 25 a 500 mg/l preparados según numeral 7.3.2.1.

7.6.3.3 Inyectar una solución blanco de reactivos (agua HPLC) después de la curva de calibración

7.6.3.4 Inyectar estándar de verificación de 250 mg/l

7.6.3.5 Inyectar una solución blanco de reactivos (agua HPLC) después del estándar de verificación

7.6.3.6 Inyectar las muestras de análisis y la muestra con valor asignado cuando este disponible.

7.6.3.7 Inyectar estándar de verificación de 250 mg/l

Precaución: Las sales de acetato de sodio en alta concentración se depositan en las tuberías y partes del cromatógrafo ocasionando obstrucción de la bomba y de las tuberías por lo cual debe programarse el método de lavado una vez finalizada la secuencia.

7.6.4 Análisis de los datos

Realizar la curva de calibración correlacionando el área de los estándares de los conservantes con la concentración de cada uno.

7.6.5 Medida de la concentración de cafeína en las muestras

Una vez realizada la curva de calibración, se procede a leer las muestras.

Realice la cuantificación por el método de estándar externo

7.7 VERIFICACIONES

7.7 VERIFICACIONES

7.7.1 ASEGURAMIENTO DE CALIDAD DEL METODO

La curva de calibración se lee cada vez que se realice un análisis y se determina su coeficiente de correlación, la pendiente y el intercepto.

Realizar la carta de control con el estándar de verificación QC .

Verificar que los blancos estén exentos de toda contaminación

Los tiempos de retención de la muestras están dentro del valor asignado al estándar ± 2.5 %

Verificar que los picos cromatográficos cumplan la relación señal/ruido

El coeficiente de variación de los duplicados de un análisis de cafeína en bebidas energizantes no debe exceder el coeficiente de variación máximo aceptable de acuerdo a la Ecuación de Hortwitz

Aptitud del sistema cromatográfico (sistem suitability test): Evalue el desempeño del sistema cromatográfico con los resultados de la solución de control QC.

7.7.2. CRITERIOS DE ACEPTACION O RECHAZO:

PARAMETRO RANGO ACCION A TOMAR EN CASO DE FALLA

Desempeño del sistema cromatográfico (System Suitability Test):Platos teóricos (N) >3000 Cambiar columna Resolución >0.8 Cambiar columnaSimetría 0.8 a 1.2 Cambiar columna

Desempeño de la curva de calibración:Coeficiente de correlación >0.999 Revisar preparación del estándar

Repetir curva de calibraciónCarta de controlLa muestra control o la muestra con valor asignado debe encontrarse dentro ± 2 desviaciones estándar de la carta de control.

Revisar preparación de la curva de calibraciónRevisar cálculosRepetir el lote de análisis

PARAMETRO RANGO ACCION A TOMAR EN CASO DE FALLA

Análisis de muestras Tiempo de retención Valor asignado al

estándar ± 2.5 %Revisar la preparación de la fase móvilRealizar adición de estándar

El coeficiente de variación de los duplicados no debe exceder la máxima permitida por la Ecuación de Horwitz: RSDr = 2 (1-0.5 logC)Por ejemplo:

Concentración mg/l Coeficiente de variación máximo

aceptable50 8.88 Verificar la homogeneidad de la

muestraRepetir el análisis

300 6.78 Verificar la homogeneidad de la muestraRepetir el análisis

500 6.27 Verificar la homogeneidad de la muestraRepetir el análisis

7.7.3 CRITERIOS NORMATIVOS

El valor establecido en la ficha técnica del producto o en la tabla nutricional

7.8 EXPRESION DE RESULTADOS

Los resultados deben expresarse en mg/l de muestra.

7.9 RANGO DE MEDICION

Intervalo lineal para cafeína 0-500 mg/l

7.10 ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE

U Descripción Valor (x) Incertidumbre

estándar u(x)

Incertidumbre

estándar relativa

u(x)/x

Estándar de

trabajo

Pureza 101.24 % 0.04

0.0003951

Calibración Pendiente 6.17 0.012 0.001945

Intercepto 34.2 0.5 0.0146

Precisión Validación método 500 mg/l 1.18 mg/l 0.00236

Recuperación

método

Validación método 98.6 0.3535 0.003585

Lectura de

muestras

Precisión del inyector 10 ul 0.025 0.0025

u (C)/ C = 0,015

Grafico 1. Valoración de la incertidumbre aportada por diversas fuentes en el análisis de

cafeína.

Para hallar la incertidumbre expandida se usa el factor de cobertura k: 2

L a incertidumbre está basada en el cálculo de una incertidumbre estándar multiplicada por un

factor de cobertura k=2 para un nivel de confianza del 95%.

Uexpandida = 2*c*u =2*c*0.015 =C*0.030

8. REGISTROS Y DOCUMENTOS ASOCIADOS

REGISTROS

Registro de producción de agua tipo I PA01-MR-403-F 01Registro de uso y verificación diaria de la balanza PA06-GM-403-F08Control de consumo de reactivos y preparación de soluciones PA01-MR-403-F05 Registro de uso del cromatógrafo liquido PA06-GM-403-F28Gráficos de control cafeinaMétodo AOAC 979.08 "Benzoato, cafeína y sacarina en bebidas soda"- Método por cromatografía. Official Methods of Analysis. Association of Official Analytical Chemists. 2005Guía operativa del cromatógrafo liquido Agilent PA-06-GM-403-G44Registro control de columnas para cromatografía liquida de alta eficiencia PA01-MR-403-F15Registro de incertidumbre de la medición PA02-PM-403-F 02

9.ANEXOS

Cromatograma típico de un estándar de cafeína