Plantas Transgénicas - Corn - GMO - Transgenic

Bioquímica Aplicada Junio 2010

Las plantas transgénicas Juan Pablo Allocati

Cátedra de BioquímicaFacultad de AgronomíaUniversidad de Buenos Aires

Manipulación genética de organismos

Esquema de Producción de una planta transgénica

Sistemas de transferencia genética en plantas

Basados en vectores biológicos

Biología de Agrobacterium tumefaciensVectores basados en el plásmido Ti Genes reporteros

Basados en la transferencia directa de ADN

Transformación por biobalísticaTransformación con whiskers de carburo de silicio

Referencias bibliográficas

Bioquímica Aplicada

Plantas transgénicas

Transformación Vegetal

Resumen





El hombre a manipulado los organismos vivos desde hace mucho tiempo

Mejoramiento genético de plantas desde hace 10.000 años

Mejoramiento genético de animales hace 5.000 años.

Mejoramiento de caninos hace 4.000 años

La producción de organismos transgénicos para uso médico es aceptada

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La información hereditaria (genes)de todos los seres vivos es químicamente idéntica (DNA) y funcionalmente muy parecida.

Muchos genes son compartidos entre bacterias, plantas y animalesincluyendo el ser humano.

¿Qué son los organismos Transgénicos o genéticamente manipulados?

Los organismos transgénicos son aquellos a los que se les ha introducido material genético propio o extraño por métodos de laboratorio que involucran el uso de técnicas de DNA recombinante

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Esquema de producción de una planta transgénica Plantas

Maduras


fértiles

Polinización

Semillas Embrionesinmaduros

Proliferaciónde células

Callos

Callosseleccionados

Selección

Introducciónde ADN

Regeneración

Brotes regenerados

Enraizamiento

Maduración

Rustificación

Plántulas




Esquema de producción de una planta transgénica

Las semillas de una planta modificada

heredan de manera estable la nueva

característica de sus padres

Los genes introducidos se transmiten a través de las semillas de generación en generación como cualquier otra

característica (gen) de la plantas

Basados en vectores biológicos




Sistemas de transformación




Sistemas de transformación basados en A. tumefaciens

(vector biológico)

¿De dónde surge la tecnología para producir plantas transgénicas?

Surge del estudio de una bacteria del suelo, llamada Agrobacteriumtumefaciens, que de manera natural y hace muchos millones de años modifica genéticamente las células de las plantas.

Esta bacteria existe en los suelos de todo el mundo y ha sido estudiada desde finales del siglo XIX

El ADN bacteriano se integra al genoma de la planta y se expresa

La bacteria se pone en contacto con la planta a través deheridas y transfiere ADN

Agalla de la corona

Célula vegetal infectada

Proliferación celular




Sistemas de transformación basados en A. tumefaciens

Agrobacterium: Uno de los primeros ingenieros genéticos de la naturaleza

Esta bacteria modifica el genoma de las células vegetales transfiriéndoles genes que las obliga a reproducirse y proveerla de alimento




Transformación de cotiledones de soja mediante co-cultivo con A. tumefaciens

Tomado de: Olhoft et al., Planta, 2003.




Transformación de Arabidopsisthaliana por infiltración floral conAgrobacteriumtumefaciens

Tomado de: Bent, Plant physiology, 2001.

Las plantas florecidas se sumergen en un cultivo

de Agrobacterium tumefaciens. Luego se recogen las semillas

y se germinan en un medio con agente selector.

Tratar con antibiótico para eliminar al Agrobacterium y seleccionar las células

vegetales transformadas

2-4 semanas

Transpasar los discos de hojas sobrevivientes a medio fresco de selección / regeneración

6-10 semanas

Enraizar las plántulas en selección

4-6 semanas

Rusticar las plantas transgénicas

Tiempo total en cultivo: 12-20 semanas

Co-cultivar discos de hojas con Agrobacterium

1-2 días

Lavar los discos de hojas




Tiempos estimados para un protocolo de transformación estándar




Transformación con A. tumefaciens por infiltración al vacío

La técnica es: Rápida: la proteína recombinante puede obtenerse en aproximadamente una semana. Eficiente: alta eficiencia de transformación; acumulación de proteína comparable con la de plantas transgénicas (hasta 40 mg/kg de hoja). Simple: sólo se requiere equipamiento básico.

Flexible: puede utilizarse para producir proteínas de membrana, enzimas o virus quiméricos, o para ensayar promotores

Control sin Control sin transformar, c/transformar, c/BiBi

transformados en transformados en medio selectivomedio selectivo

Seguimiento de la transformación de embriones de maíz y regeneración de una planta transgénica mediante

la reacción histoquímica de la enzima β-glucuronidasa.




Expresión del gen uidA en plantas de maíz

Basados en la transferencia directa de ADN




Sistemas de transformación




Sistemas de transferencia directa de ADN

• Ventajas

- Son considerados sistemas universales porque, al no depender de organismos vectores, pueden aplicarse a cualquier especie vegetal

- No requieren eliminar las células del organismo vector

de los tejidos o plantas transgénicas

- Requieren construcciones más simples y pequeñas

- Son apropiados para estudios de expresión transitoria

• Desventajas

- Pueden resultar en un alto número de copias y/o copias truncas del transgén y del vector en varios sitios del genoma de las células transformadas

- Se caracterizan por la alta frecuencia de aparición de

re-arreglos en los transgenes




Las técnicas de biobalisticafueron desarrolladas en los años 80.

Bombardeo de micropartículas 1984. Sandford et al., describen la técnica de bombardeo de micropartículas para la transferencia directa de ADN (Universidad de Cornell, EEUU).

M ecanismo de disparo de un cañón impulsado por He a alta pres ión (PDS 1000/He)




Las técnicas de biobalisticafueron desarrolladas en los años 80.




La transformación por biobalísticadepende de diversos parámetros.

• Parámetros físicos y químicos que influyen en la transferencia del ADN

- Método de aceleración de las micropartículas

- Naturaleza química y física, densidad y volumen

de las micropartículas

- Naturaleza, preparación, adherencia y concentración del ADN

- Vacío y distancias de bombardeo

- Diámetro de apertura de la placa de retención

- Número de bombardeos

• Parámetros relacionados con la construcción genética utilizada

- Vector, promotores, intrones, genes reporteros y

genes marcadores de selección




La transformación por biobalísticadepende de diversos parámetros.

• Parámetros relacionados con el tejido o células blanco

- Genotipo de la planta a utilizar - Tipo y capacidad de regeneración in vitro de los explantos

- Preparación y condiciones de cultivo de los explantos pre- y post-bombardeo

- Requerimientos de temperatura, fotoperíodo y humedad de la planta donante de explantos y del tejido bombardeado

Respuesta de los genotipos a la transformación

050

100150200250300350400

puntos azules por disparo

BLS14 HL22genotipos

Respuesta de los genotipos a la transformaciónpAct1D+pAcH1 pDMC208+pAcH1




Transformación con Whiskers de carburo de silicio.

Nanobiotecnología

A B C

D E F

Adaptado de: Frame et al. The Plant Journal, 1994 y de Petolino et al. Plant CellReports, 2000.

A: suspensiones celulares de maíz penetradas por fibras de carburo de silicio (0,3-0,6�m por 10-100�m) recubiertas de ADN (transformación)

B: expresión transitoria del gen uidA luego de la transformación

C: callos resistentes a fosfinotricina

D y E: inflorescencia y fruto de una planta transgénica R0

F: ensayos de resistencia a fosfinotricina con plantas R1 dos semanas después del tratamiento




¿Transferencia directa de ADN versus Agrobacteriumtumefaciens?

Vs.

1. Tzfira, T. and Citovsky, V. Agrobacterium-mediated transformation of plants: biology and biotechnology.Current Opinion in Biotechnology, 17:147-154, 2006.

2. Gelvin, S.B. Improving plant genetic engineering by manipulating the host. Trends in Biotechnology, 21:95-98, 2003.

3. Gelvin, S.B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "Gene-Jockeying" tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67:16-37, 2003.

4. Bent, A.F. Arabidopsis in planta transformation. Uses, mechanisms, and prospects for transformation of other species. Plant Physiology, 124:1540-1547, 2000.

5. Microprojectile mediated plant transformation: A bibliographic search. Rajesh Luthra, Varsha, Rajesh K. Dubey, Ashok K. Srivastava and Sushil Kumar. Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants (CIMAP), P.O. CIMAP, Lucknow, 226 015, India

6. Pollen-mediated method for transformation of maize, tomato or melon. United States Patent 6806399. Carmel-Haifa University Economic Corporation Ltd. (Haifa, IL)

7. Estudio del comportamiento en cultivo in vitro de líneas de maíz flint: competencia para la transformación genética. Allocati, JP. Tesis Licenciatura. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas – Universidad Nacional de General San Martín.

8. Transformation of Maize Using Silicon Carbide Whiskers. Jim M. Dunwell. Feb-15-1999; DOI:10.1385/1-59259-583-9:375. Springer Protocols.

9. “Enhancing cytosolic ADP-glucose synthesizing sucrose synthase activity in transgenic potato tubers results in increased starch content.” Baroja-Fernandez, Edurne , Muñoz, Francisco Jose , Moran-Zorzano, Maria Teresa, Allocati, Juan Pablo, Etxeberria, Ed , Alonso-Casajus, Nora, Pozueta-Romero, Javier . Botany and Plant Biology 2007. July 7-11, 2007 * Hilton Chicago * Chicago, Illinois.




Bibliografía

Plantas Transgénicas - Corn - GMO - Transgenic

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