Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología

Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Rompimiento celular

Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa



Productos Extracelulares-Antibióticos-Enzimas extracelulares-Muchos polisacáridos-Mayoría de aminoácidos

Productos Intracelulares-Mayoría de proteínas modificadas

genéticamente-Lípidos-Algunos antibióticos

BiomasaEsteroides

(Se extraen sin romper)



Tomado de “Advances in product release strategies and impact on bioprocess design” (2009)Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell



Fermentación

Cosecha de células

Rompimiento Celular

Centrifugación, filtración con vacío,

filtración con membranas

Homogenización, molienda, lisis

(enzimática o química)


Etapas primarias

de recuperación

Remoción de restos celulares

Concentración y/o

fraccionamiento

Operaciones de alta

resolución

Operaciones finales

Producto


filtración con membranas

Precipitación, extracción, filtración con

membranas, evaporación

Cromatografía, cristalización

Adaptado de: Sanchez-Ruiz, 1989

Studies on cell disruption and cell debrisremoval in downstream processing



Ruptura Celular de Saccharomyces cerevisiae

Antes de la ruptura celularDespués de 2 pasos a 1000 bar dando un

rompimiento celular de 95%



Equipo de ruptura

Industria Alimentaria(Homogenización de la leche)

Industria de la Pintura(Reducción de Pigmentos)

Industria BiotecnológicaAplicación en …



Método Técnica Principio Estrés

sobre el

producto

Costo Ejemplo

Químico Choque osmótico Ruptura osmótica de la membrana Suave Barato Ruptura de células de sangre

Digestión

enzimática

Rompimiento por digestión de la

pared celular

Suave Caro Micrococcus lysodeikticus tratado con lisozima

de huevo

Solubilización Detergentes solubilizan la

membrana celular

Suave Moderado-

caro

Sales biliares actuando sobre E.coli

Disolución de

lípidos

Solventes orgánicos se disuelven en

la pared celular y la desestabilizan

Moderado Barato Ruptura de levadura con tolueno

lípidos la pared celular y la desestabilizan

Tratamiento

alcalino

La saponificación de lípidos

solubiliza la membrana

Fuerte Barato

Mecánico Homogenización

(tipo navaja)

Células cortadas en una licuadora Moderado Moderado Tejido animal y células

Molido Ruptura celular por molido con

abrasivos

Moderado Barato

Ultrasonicación Células rotas con cavitación

ultrasónica

Fuerte Caro Suspensión de células a pequeña escala

Homogenización

(tipo orificio)

Se hace pasar células por un

pequeño orificio y se rompen por

estrés

Fuerte Moderado Tratamiento a gran escala de suspensión de

células excepto bacterias

Rompimiento en

molino de perlas

Se aplastan las células entre el

vidrio y perlas de acero

Fuerte Barato Tratamiento a gran escala de suspensión de

células y células de plantas



Procariotes Gram –(E. coli produce la mayoría de las proteínas recombinantes)

Membrana externa(Proteínas y lipopolisacáridos)

Polipéptidoglucanos8 nm

Fuerza mecánica

Esquema de la pared celular de células procariotas

Procariotes Gram +

Polipéptidoglucanos

Espacio Periplasmático(Proteínas)

Membrana de plasma

8 nm

Polipéptidoglucanos

Espacio Periplasmático(Proteínas)

Membrana de plasma(Fosfolípidos, proteínas dispersas, iones metálicos)

Permeabilidad



Dificultad de la ruptura

Esporas

Cocos gram -

Levaduras

Células vegetales

Bacilos gram +

Bacilos gram - y cocos

Micelios

Células animales



Elección del método de ruptura

�Naturaleza de la fuente de la enzima

�Escala de la operación�Escala de la operación

�Velocidad del método de extracción

�Estabilidad del enzima

�Pureza requerida

�Costo del proceso



Factor inactivante Fuente de

enzima

Frecuencia Modo de

contrarrestarlo

Calor Cualquiera Universal Enfriamiento

Frío Cualquiera Raro Calentamiento

Factores que inactivan las enzimas durante su aislamiento

Proteasa Mayoría Común Inhibidores de proteasas o frío

Productos oxidación de

fenoles

Plantas y hongos Bastante común Agentes reductores

Oxidación Cualquiera Común Agentes reductores

Dilución proteína Cualquiera Bastante común Concentración rápida

Pérdida de estabilidad Cualquiera Bastante común Restauración de ese factor

Inhibidores específicos Plantas y bacterias Raro Separación del inhibidor

Metales pesados Cualquiera Raro Agentes quelantes

Cambio de fase Cualquiera Común Mínima agitación



Choque osmótico

1. Suspensión de células en solución tamponada hipertónica (sacarosa 20%)2. Equilibrio osmótico3. Centrifugación: concentración de las células4. Resuspensión en agua (4ºC)5. Ruptura celular por entrada de agua en el interior celular

• Mayor sensibilidad en GRAM – (GRAM + alta presión osmótica interna)• Ventajas:

Extracción de enzimas del espacio periplasmático, simplificación de los procesos de purificación

• NO a gran escala:Grandes volúmenes de medio (400 L/10 kg pasta celular)Elevado número de pasos de centrifugaciónNecesidad de refrigeración



Tratamiento con lisozima + EDTA

•Digestión de las paredes celulares por ruptura de los enlances beta-(1.4) glicosídicos entre el ácido N-acetilmurámico (NAM) y la N-acetilglucosamina (NAG) del mucopéptido

•Mayor susceptibilidad GRAM +•Combinación con EDTA: quelante del Ca2+

•Otros policationes: GRAM +: quitosano, hidroglutamato, polilisina, antiobióticos GRAM -: lipasas, fosfolipasas, policationesHongos/levaduras: quitinasa/glucanasas

•Necesidad de choque osmótico•No empleo a gran escala:

Alto precio de la lisozimaEliminación de lisozima tras extracción



Tratamiento con detergentes

Permeabilización de células por solubilización de proteínas de membrana, debido a apertura de poros

Tipos:1. Iónicos: provoca desnaturalización proteica

Aniónicos: Lauril sulfato sódico, colato sódico, SDSCatiónicos: Bromuro de cetil-trimetil-amonioCatiónicos: Bromuro de cetil-trimetil-amonio

2. No iónicos: preservan estructura nativa e interacciones de la enzimaTween, Spam, Triton

Inconvenientes:Precipitación de proteínasNecesidad de eliminación (cromatografía, ultrafiltración)



Tratamiento con álcalis

�Tratamiento de las células con soluciones alcalinas (KOH, NaOH, pH 11.5-12.5; 20-30 min)

� Hidrólisis de la pared celular� Ventajas:

� Simpleza, barato� Fácil aplicación a gran escala� Fácil aplicación a gran escala

� Desventajas: � Tratamiento fuerte, es un ejemplo extremo de la solubilización (Saponificación de lípidos que se convierten a detergentes)� No selectivo� Aplicación SÓLO si las enzimas a aislar son estables a pH alcalino



�Método tradicional de ataque ( tolueno).

Disolventes orgánicos

�No se usan a gran escala.

�Inconvenientes:PrecioToxicidadDesnaturalización de proteínasInflamabilidad



Homogeneización con abrasivos

•Mortero + abrasivo (cristal, albúmina, kieselgurh)•Dispositivos de funcionamiento continuo:

Agitador Mickle (agitador vibratorio)Dyno-mill (agitador de discos giratorios)

•Efectividad depende de:� Tipo y concentración de abrasivo� Tipo, concentración y edad de las células: levaduras >bacterias� Velocidad de agitación� Cantidad y flujo a través de la cámara� Temperatura� Dispositivo de discos



Sonicación

•Aplicación de frecuencia superiores a 20kHz•Aparición de áreas de compresión/enrarecimiento/cavidades →colapso de cavidades →ondas de choque →daño celular•Aplicación continua o discontinua•Eficacia dependiente de:

Tipo de microorganismo: diversidadGram ->Gram +Gram ->Gram +Bacilos > CocospHTemperaturaFuerza iónica del medioTiempo de exposiciónDensidad de la célula

•Uso a pequeña escal, NO a gran escala:Elevados requerimientos de energíaDificultad de transmisión de la energíaProblemas de disipación del calor producido



Congelación/Descongelación

•Formación y fusión de cristales de hielo � liberación de proteínas

•Combinación con otros métodos: congelación de sedimentos bacterianos

•Ventajas:•Ventajas:SimplicidadBajas temperaturas de trabajo

•NO a gran escala:Elevado tiempo de tratamientoResistencia de algunos microorganismosSensibilidad de las enzimas a congelación/descongelación



Cizalla líquida

•Paso de la suspensión de células a elevada presión (>55MPa) a través de un orificio estrecho•Homogeneizador de Manto-Gaulin•Mecanismo:

Ruptura celular por caída brusca de presión y choque

•Modos de uso:Paso único, series de reciclaje, reciclaje continuo con eliminación de sustancia

•Efectividad depende de:Tipo de microorganismos: GRAM -> GRAM +Historia de la materia de partida:Condiciones de crecimiento (fase estacionaria > fase exponencial)Congelación/descongelación



Cizalla sólida

•Paso de células congeladas (-20ºC) a través de orificio

•Mecanismo:Agitación en presencia de abrasivo (cristales de hielo) + ruptura por cizalla líquidaruptura por cizalla líquidaFuerzas de cizalla: paso a través de orificio + desgarro por cristales de hielo

•No produce la desnaturalización de las enzimas

•NO a gran escala:Manejo complicado y costoso



Tomado de “Advances in product release strategies and impact on bioprocess design” (2009)Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell



Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular

Choque osmótico: El cálculo del gradiente de presión se basa en el equilibrio químico

1c⋅⋅−=− TRPPie

Molino de Perlas (operación intermitente): El rompimiento celular con perlas agitadas a altas velocidades sigue una cinética de primer orden. El balance de masa de proteína liberada puede ser expresado mediante la ecuación:

( )MmMVRRk

dt

dRV −=

Integrando y re-arreglando

ktRR

R

m

m =−

ln

t

RR

R

m

m

−ln

kEjemplo 5.2




Eficiencia de los Molinos de Perlas (operación continua): El número de etapas de un molino de perlas obtenido mediante experimentos de pulsos, puede ser empleado para calcular la eficiencia del rompimiento esperada. El balance de masa de proteína liberada (células rotas) considerando que el molino consta de N etapas tipo tanque perfectamente agitado en serie y que el rompimiento sigue una cinética de primer orden puede ser expresado mediante la ecuación:expresado mediante la ecuación:

( )�

VRRkFR

dt

dR

�

Vm

m

m

111 −+−=

Expresando la ecuación en función de un tiempo adimensional e integrando obtenemos

+=

�F

kV

�F

kV

R

R

m

m

m 1

1

Eficiencia de la etapa !!!

Re-arreglando y generalizando para N etapas, tenemos:�

m

�m

m

�F

kV

RR

R

+=−

1 Ejemplo 5.3




Homogeneizador de alta presión: La desintegración celular en un homogeneizador de alta presión a una presión fija puede ser descrita mediante una cinética de primer orden respecto al número de pasos, de tal manera que:

( )RRkd�

dRm−= '

Integrando obtenemos la ecuación:

�kRR

R

m

m 'ln =−

Se ha determinado experimentalmente que la constante k’ tiene una dependencia con la presión de la siguiente forma:

aPkk "'=

a

m

m�Pk

RR

R"ln =

−

Combinando las ecuaciones anteriores se tiene:




Microflidizador: En el caso del microfluidizador la cinética de rompimiento presenta una cierta dependencia no lineal con el número de pasos expresada mediante la ecuación:

ab

m

mP�k

RR

R"ln =

−Ejemplo 5.4

mRR −

Donde b es un exponente que varía con el tipo de célula y toma valores entre 0.28 y 1



Chang and Su, 2006Kinetic model for simultaneous cell

disruption and aqueous two-phase

extraction

A = Am[1 − exp(−kt)]



La Ruptura celular, cuando se están procesando cientos o miles de litros de material, represanta un reto diferente a la ruptura celular a

nivel laboratorioFactores claves son: Eficiencia y reproducibilidad

A nivel Industrial sólo se emplean los molinos de perlas agitados y los homogeneizadores a alta presión. El diseño de los molinos está basado en ecuaciones empíricas y en experimentos piloto.está basado en ecuaciones empíricas y en experimentos piloto.

GEA Liquid Processing cell rupture skid for biologic cell lysing. The homogenizer feature the high efficiency sharp profile rupture valve type R which enable cell disruption at lower pressures

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