Bol. San. Veg. Plagas, 27: 159-168, 2001

Pie negro o Necrosis del cuello (Phoma lingam (Tode: Fr.)Desmaz.) en cultivos de colza canola en la Argentina

SILVIA GAETÁN, MARTA MADIA, ANA RODRÍGUEZ

Este trabajo tiene por objeto identificar la etiología de una enfermedad detectada enun cultivos de colza cañóla de primavera, llevados a cabo en el campo experimental dela Facultad de Agronomía de la Universidad de Buenos Aires y en la localidad de Bra-gado, Provincia de Buenos Aires, Argentina. La misma se presentó en la etapa de fructi-ficación (G,-G,)y se caracterizó por la presencia de una necrosis de la región basal delos tallos asociada a un cancro de bordes irregulares y tamaño variable. Las plantas evi-denciaron un desecamiento prematuro y las silicuas no presentaron semillas.Se dtecta-ron también síntomas en hojas.Sobre los tejidos desintegrados se observaron, bajo lupa,picnidios globosos ostiolados. Los análisis de laboratorio y las pruebas de patogenici-dad, efectuadas sobre plántulas de tres variedades y un híbrido, indicaron que se tratabade la enfermedad conocida como Pie Negro o Necrosis del cuello de la colza causadapor el anamorfo (Phoma lingam (Tode.Fr.) Desmaz.). Se reporta por primera vez, en Ar-gentina, la presencia de este patógeno fúngico en ejemplares de cañóla, en condicionesde campo y se describe la sintomatologia observada.

S. GAETÁN, A. RODRÍGUEZ Y M. MADIA. Cátedra de Fitopatología. Facultad de Agrono-mía. Universidad de Buenos Aires. Avda. San Martín 4453 (1417). Capital Federal. Ar-gentina. sgaetan@mail.agro.uba.ar

Palabras clave: colza, Phoma lingam, pie negro, necrosis del cuello, síntomas fo-liares

INTRODUCCIÓN

La colza, especie anual Brassicaceae esun cultivo oleaginoso del cual se cultivandos especies: Bras sica napus L. van oleíferay B. campestris L... A partir de 1974, con lamejora en la calidad de aceite y harina,ocupa el tercer lugar en producción de olea-ginosos en el mundo. En la Argentina estecultivo resulta una alternativa interesante yaque posee un ciclo vegetativo de invierno yprimavera, de manera que es factible lograrbuenos resultados en un área similar a la tri-guera, enriqueciendo los esquemas de rota-ción agrícola. (MURPHY Y PASCALE,1991).

En un cultivo de colza de primavera delhíbrido Iciola 41 conducido por la Cátedrade Cultivos Industriales, en parcelas delcampo de experimentación de la Facultadde Agronomía de la Universidad de Bue-nos Aires, se detectó, hacia fines de no-viembre de 1994, una enfermedad caracte-rizada por la necrosis de tejidos corticalesasociados a lesiones deprimidas en la basedel tallo (Figura 1). Los síntomas fueronobservados en la etapa fenológica corres-pondiente a fructificación (G,-G2). Se ob-servó que los cancros, cóncavos, de bordesirregulares y tamaño variable, presentabanuna coloración pardo oscura; cuando éstosanillaban el tallo, al descalzar las plantas,

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Fig. 1.—Síntoma en la base del tallo en el híbrido Iciola 41 producidos por P. lingam en condiciones de campo; tejidoscorticales necrosados asociados a lesiones deprimidas.

Fig. 2.—Síntoma foliar en condiciones de campo:lesiones necróticas de color grisáceo, halo clorótico y

con desarrollo de picnidios.

las raices quedaban en el suelo. El patrónde distribución de las plantas enfermas enel lote fue al azar y en todos los casos, seobservó muerte de los ejemplares afecta-dos. Se evidenció un desecamiento prema-turo y silicuas más reducidas con una me-nor cantidad de granos. Sobre los tejidoscon síntomas se encontraron estructurasglobosas de color negruzco, visibles bajolupa, que correspondieron a picnidios os-tiolados. En posteriores seguimientos efec-tuados a este cultivo, en una línea experi-mental de colza de primavera, en lalocalidad de Bragado (provincia de Buenos

Aires), fue observado, en el estadio B8 (ro-seta) síntomas foliares consistente en lesio-nes necróticas más o menos circulares decolor grisáceo, rodeadas por un halo cloró-tico y con desarrollo de picnidios negrosvisibles a simple vista (Figura 2). En am-bos casos, las características de las estruc-turas fúngicas observadas resultaron com-patibles con Phoma lingam (Tode:Fr.)Desmaz.

En cuanto a la presencia de P. lingam enla Argentina, la misma fue reportada en1985, solamente en semillas de colzas de in-vierno y en la década del 90 pudo detectarsesobre semillas de colzas de primavera pro-cedentes de la región pampeana, compro-bándose su transmisión por esta vía (GAE-TAN et al., 1995; GARBAGNOLI yGAETAN, 1995; GAETAN y MADIA,1995). Esta es la primera vez que se reportaeste microorganismo causando síntomas endiferentes órganos de la planta durante elperíodo del cultivo.

El Pie Negro provocado por Phoma lin-gam (Tode:Fr.) Desmaz es la enfermedadmás desvastadora que afecta Brassicas,entre las que se incluye la colza (B. napusL. var. oleifera); el teleomorfo es Leptosp-haeria maculans (Desmaz.) Ces. & DeNot (ROUSSEL et al, 1999). Las mayoresepidemias han ocurrido en Australia, Ale-mania, Francia e Inglaterra. La enferme-dad está difundida en todas las áreas donde

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se cultiva colza, incluso Canadá. El hongoproduce lesiones necróticas en cotiledones(de 2 a 3 mm. de diámetro) y en hojas, de5 a 15 mm. de diámetro (REGNAULT etal, 1987). Luego de invadir el mesófilo dela hoja alcanza el tejido vascular y colo-niza toda la planta, a través de pecíolos ytallos. Esta fase sistémica e intercelular secaracteriza por un crecimiento asintomá-tico. Posteriormente, se produce una inva-sión de las células corticales en la partebasal del tallo, con el consiguiente desa-rrollo de una necrosis localizada en el cue-llo de la planta. Esta fase eminentementenecrótrófica culmina con la formación deun cancro que constituye la manifestaciónmás característica de la enfermedad en elcultivo (ROUSSEL et al, 1999). Esta le-sión necrótica, semejante a un cancro,puede rodear totalmente el tallo, en lazona de la corona, lo que determina lamuerte de la planta y ocasiona serias pér-didas en los rindes (GLADDERS y MUSA,1979; MCGEE y EMMETT, 1977; ROÜ-SELL et al., 1999). La presencia de esta le-sión tan característica dio origen al nom-bre de la enfermedad, Pie negro(HAMMOND et al, 1985). En colza, L.maculans causa madurez prematura y dis-minuciones en los rindes de hasta un 60%.Tales daños han sido reportados en culti-vos con cancros severos en la base del ta-llo (SMITH et al, 1988). Además de man-chas en hojas y cancros en los tallos, elpatógeno puede causar damping-off enplántulas, podredumbre seca de la raíz einfección en semillas. La simiente infec-tada puede actuar como fuente de inoculoprimario y es particularmente importante,como vía de introducción del patógeno enzonas libres de la enfermedad (GABRIEL-SON, 1983). El microorganismo infectalas silicuas estableciéndose en la semilla(LACOSTE et al., 1969). Ellas puedenpresentarse arrugadas y decoloradas, nomostrar síntomas macroscópicos o bien,pueden ser de menor tamaño que las semi-llas sanas (GARBAGNOLI Y GAETAN,1995; JACOBSEN y WILLIAMS, 1979;

LLOYD, 1959; WALKER, 1952). El tele-omorfo es de gran importancia en la epide-miología de la enfermedad, ya que el ino-culo primario está constituido por lasascosporas (BRUNIN y LACOSTE, 1970)que pueden ser dispersadas por el viento avarios kilómetros de distancia (ALABOU-VETTE y BRUNIN, 1970. Esta fase se-xual se cumple en los restos culturales endonde desarrollan los pseudotecios. Lasprecipitaciones provocan la dehiscencia delos ascos y la liberación activa de las as-cosporas, las cuales pueden vivir hasta 6semanas. En condiciones favorables, seforman los picnidios (fructificaciones ase-xuales) sobre las lesiones del año produci-das en los órganos aéreos de la planta, delos cuales se desprenden las picnidiospo-ras que diseminan la enfermedad, constitu-yendo la fuente de inoculo secundario(PETRIE, 1978). Las diferencias encontra-das en la patogenicidad de L. maculans hadeterminado la aparición de dos grupos:uno, agresivo (Tox +) y otro, no agresivo(Tox °). La aplicación de métodos de ca-racterización bioquímicos y moleculareshan demostrado que ambos tipos podríanconsiderarse dos especies distintas (BA-LESDENT et al., 1992; MORALES et al,1993). La resistencia genética es la me-dida más económica de control de la Ne-crosis del cuello. Los cultivares actualesde cañóla varían de altamente susceptiblesa moderadamente resistentes a la enferme-dad (CURTIS et al, 1997). La implemen-tación de medidas preventivas, como lasrotaciones, parece ser otra estrategia efi-ciente para combatir la enfermedad, yaque L. maculans puede sobrevivir en ras-trojos infestados por tres años. Las rota-ciones, de al menos 4 años, con cultivosno susceptibles en lotes con antecedentesde la enfermedad, no elimina el riesgo deinfección pero reduce la severidad de lossíntomas. Plantas y semillas de otras espe-cies de Brassica pueden actuar como ver-daderos reservónos del inoculo, por lo queresulta importante su control (GUGEL yPETRIE, 1992). La bibliografía extranjera

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menciona la presencia de este patógeno engéneros silvestres y cultivados de Brassi-caceae: Brassica (colinabo, colza, nabo,col, etc), Sinapsis alba (mostaza blanca) yespecies de Raphanus.

Dada la escasez de antecedentes en laArgentina sobre los patógenos que afectanel cultivo de cañóla y en particular, ante laausencia de referencias sobre la apariciónde esta enfermedad en condiciones decampo, como es este caso, se planteó comoobjetivo de la presente investigación corro-borar la etiología de la patología observadaen tallo y hojas y establecer su sintomato-logía.

MATERIALES Y MÉTODOS

Análisis del material vegetal enfermo

Muestras

Plantas de cañóla correspondientes al hí-brido Iciola 41 (B. napus L. subsp. oleifera)con síntomas en la base del tallo, proceden-tes de un ensayo de fechas de siembra y eva-luación de rendimientos, llevado a cabo porla Cátedra de Cultivos Industriales en elcampo experimental de la Facultad de Agro-nomía de la Universidad de Buenos Aires,Argentina.

Plantas de colza cañóla con síntomas fo-liares provenientes de un ensayo de evalua-ción de líneas experimentales provenientesde la localidad de Bragado (Provincia deBuenos Aires).

Se efectuaron pequeñas secciones de losórganos afectados (tallos y hojas) de alrede-dor de 0.5 a 1 cm. de longitud que fueron so-metidas a una desinfección superficial conalcohol 70°, Hipoclorito de Sodio al 2% yreiterados lavados con agua destilada estéril.A continuación, las porciones tratadas fue-ron colocadas en cámaras húmedas, dentrode cajas de Petri de plástico de 9 cm. de diá-metro, e incubadas en estufa a 22-24°C (+/-3°C) en oscuridad, a fin de promover el de-sarrollo del microorganismo.

Aislamientos y reaislamientos

Tanto para los aislamientos como para losreaislamientos se usó como medio de cultivoPDA -Potato Dextrosa Agar- al 2% pH: 7 yligeramente acidulado con gotas de ácidoláctico al 25%.

El hongo se aisló a partir de fructificacio-nes asexuales (picnidios) extraidas del tejidovegetal incubado en cámaras húmedas, conaguja histológica, bajo lupa estereoscópica12-50X. Las siembras se colocaron en pla-cas de Petri de vidrio de 9 cm. de diámetro yse incubaron en estufa y cámara bioclimáticacon una alternancia de 12 horas de luz NUVy 12 horas de oscuridad a 22-24°C (+/-3°C). Posteriormente, las colonias desarro-lladas fueron repicadas a tubos de ensayo,con el mismo medio de cultivo en pico deflauta, y se las incubó de igual forma.

Pruebas de patogenicidad

Hospedantes

Los tests de patogenicidad se llevaron acabo empleando plántulas sanas de colzaprovenientes de semilla, correspondientes alos estadios de 3 y 4 hojas verdaderas (B3 -B4) y con aproximadamente 20 días de desa-rrollo. La semilla utilizada fue previamentedesinfectada con Hipoclorito de Sodio al 2%durante 10 minutos y luego, lavada con aguadestilada estéril. Las plántulas crecieron enmacetas de plástico conteniendo una mezclade tierra y arena en partes iguales (1:1), este-rilizada a 1 atmósfera de presión durante 30minutos en autoclave. Por maceta se sembra-ron 10 semillas efectuando luego un raleohasta dejar un número equivalente a 5 plán-tulas por maceta.

Se incluyeron colzas de primavera corres-pondientes a las variedades: Global, Malukay Topas y al híbrido Iciola 41. Para cada cul-tivar se utilizó un total de 10 macetas, 6 des-tinadas para las inoculaciones y 4 para lostestigos.

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Inoculo

El inoculo se obtuvo a partir de coloniasfúngicas de 10 días, desarrolladas en PDA yobtenidas a través de las metodología deta-llada anteriormente.

Técnicas de inoculación

Para cada cultivar se aplicaron las si-guientes técnicas:

Técnica 1. Aspersión de una suspensión deesporas sobre los órganos aéreos

Se preparó una suspensión de esporas enagua destilada estéril con una concentraciónde 2x 106 propágulos del hongo/ml.

Las plántulas se inocularon pulverizandola suspensión de propágulos utilizando unpulverizador del tipo De Vilbiss. Los testi-gos se pulverizaron con agua destilada esté-ril solamente.

Las plántulas permanecieron cubiertascon bolsa de polietileno por un lapso de 72horas y se colocaron en cámara bioclimáticaa 22-24°C a 40 cm debajo de 3 tubos NecBiolux FL40 SBR 40Watt TÍO con una sepa-ración de 15 cm entre sí que proporcionaban12 hs de luz y otras 12 hs provenían de untubo Sylvania F36wts LD54 colocado en eltecho de la cámara.

Técnica 2. Discos de PDA con desarrollofúngico en el cuello de las plántulas

En esta técnica se utilizaron pequeñosdiscos de 0,8 mm de PDA con desarrollofúngico. La inoculación de las plántulas sellevó a cabo colocando 2 discos de PDA so-bre el cuello de las mismas.

Las plántulas así inoculadas se some-tieron a iguales condiciones de luz y tem-peratura que las especificadas para la téc-nica anterior. En las plantas testigos seaplicaron 2 discos de iguales caracterís-

ticas que carecían del desarrollo delhongo; posteriormente, fueron mantenidasen las condiciones anteriormente mencio-nadas.

Tanto las plántulas inoculadas artificial-mente como sus correspondientes testigosfueron regados, a intervalos regulares de 48-72 horas, con agua corriente.

RESULTADOS

Características del agente causal

Al cabo de 10-12 días de incubación, elhongo desarrolló colonias que se caracteri-zaron por la presencia de escaso micelio aé-reo de color grisáceo y gran producción depicnidios superficiales o semisumergidos,esféricos, globosos, comprimidos, de colorcastaño oscuro a negro, ostiolados, modera-damente rostrados, de 100 a 250 u de diáme-tro, dispuestos en anillos concéntricos. (Fi-gura 3).

La producción de esporas fue abundante.Son unicelulares (conidios), hialinas, gotula-das, de 3,5-4,5 u x 1,5 u que emergieron delos picnidios con aspecto de masas cremosasde color beige amarronado.

Fig. 3.—Colonia de Phoma lingam: (de 10 días) escasodesarrollo de micelio aéreo y abundante producción de

fructificaciones asexuales.

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Figs. 4 y 5.—Pruebas de patogenicidad (por aspersión de órganos aéreos): lesiones necróticas en hojas y cotiledones, deaspecto irregular de color pardo y situados en los márgenes.

Fig. 6.—Pruebas de Patogenicidad (por aspersión de órganos aéreos): lesiones necróticas que rodearon los vastagos yprovocaron su estrangulamiento.

Pruebas de patogenicidad

Técnica 1. Aspersión de una suspensión deesporas sobre los órganos aéreos

Mediante la aplicación de esta metodolo-gía los primeros síntomas se evidenciaron alos 14 días de la inoculación. Los mismos semanifestaron a través de lesiones necróticasen hojas y cotiledones de 2-3 mm de diáme-

tro, de aspecto irregular, de color pardo y si-tuadas, en especial, en los márgenes. (Figu-ras 4 y 5).Sobre los tallos se produjeron le-siones necróticas que rodearon los vastagosy determinaron estrangulamiento de los mis-mos (Figura 6).

Las plántulas evidenciaron un decaimientogeneral permaneciendo las hojas marchitasadheridas a los tallos. Finalmente se produjola muerte de todos los ejemplares inoculados.

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Fig. 7.—Pruebas de Patogenicidad (aplicación de discos de PDA con desarrollo fúngico): sobre la porción basal de lostalludos se presentaron lesiones necróticas causando estrangulamiento y posterior muerte de la plántula.

Esta sintomatología se observó en todoslos cultivares de cañóla que participaron enel ensayo.

Técnica 2. Discos de PDA con desarrollofúngico en el cuello de las plántulas

A través de la aplicación de esta técnicade inoculación, se produjo una evoluciónrápida de los síntomas que condujeron, en8 días, a la muerte de la totalidad de lasplántulas de todos los cultivares utiliza-dos.

En todos ellos, los síntomas comenzarona evidenciarse a los 6 días de efectuadas lasinoculaciones. Sobre la porción basal de lostalludos se presentaron lesiones necróticasque rodearon los mismos, provocando es-trangulamiento y posterior muerte de lasplántulas (Figura 7).

Sobre todas las plántulas empleadas comotestigos no se detectó sintomatología alguna(Figura 8).

De todas las lesiones reproducidas en ho-jas y tallos se efectuaron los reaislamientoscorrespondientes, obteniéndose colonias deiguales características a las obtenidas en losaislamientos, pudiéndose constatar que el

microorganismo mantuvo los caracteres ob-servados inicialmente.

DISCUSIÓN

Las características morfológicas y cultu-rales del agente causal coinciden con lasdescriptas por SUTTON (1980); SOMDA etal (1998) para el anamorfo (P. litigam).

Los síntomas observados en las plantasde colza provenientes del ensayo realizadopor la Cátedra de Cultivos Industriales secorresponden con los observados porSMITH ¿i fl/.(1988), GOIDANICH (1990);MORALES et al. (1993); REMPEL et al.(1991).

Las plántulas inoculadas en la base del ta-llo mostraron una sintomatología caracteri-zada por un debilitamiento y estrangula-miento del mismo, que concuerda con lasobservaciones de BRUNIN and LACOSTE(1970); HAMMOND et al. (1985); GA-BRIELSON (1983) Y GARBAGNOLI YGAETAN(1995).

La rápida evolución de los síntomas ob-servados en plántulas inoculadas en la partebasal coincide con las apreciaciones de MCGEE y PETRIE, 1978 quienes observaron

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Fig. 8.—Pruebas de Patogenicidad (aplicación de discos de PDA sin desarrollo fúngico): testigo.No se presentaron síntomas.

mayor incidencia de la enfermedad cuandolas plántulas eran inoculadas antes del esta-dio de sexta hoja (B6).

Los resultados obtenidos en plántulas quefueron asperjadas con la suspensión de pro-págulos en agua destilada estéril, coincidencon las observaciones de REGNAULT et al(1987); GLADDERS y MUSA (1979); MO-RALES et al. (1993); GARBAGNOLI YGAETAN (1995) y GAETAN et al (1995).

Las lesiones foliares observadas sobreplántulas, en el estadio B8 (roseta) en condi-ciones de campo en la localidad de Bragado(provincia de Buenos Aires), concuerdancon la lesión típica (Tp) que describenBRUN et al. (1997). Sin embargo, en estecaso, las manchas se hallan rodeadas por unhalo clorótico muy notorio.

CONCLUSIONES

Phoma lingam (Tode: Fr) Desmaz. secomporta como patógeno del cultivo de

colza cañóla, produciendo síntomas en hojasy lesiones necróticas y cancros en la base deltallo que determinan la muerte de las plantasafectadas.

Este microorganismo fúngico demostróuna acentuada agresividad sobre los ejem-plares inoculados artificialmente ya que so-bre las plántulas tratadas, ocasionó estrangu-lamiento de la región basal de los tallitos ylesiones necróticas en hojas y vastagos.Además produjo una elevada mortandad dealrededor del 95% de los ejemplares inocu-lados.

Todos los cultivares de colza de prima-vera incluidos en los ensayos (tres varieda-des y un híbrido) manifestaron una gran sus-ceptibilidad al patógeno.

Es el primer reporte de P lingam afec-tando el cultivo de colza cañóla de prima-vera en Argentina, no habiéndose detec-tado por el momento, en el país, la formateleomórfica del microorganismo (Lep-tosphaeria maculans (Desm.) Ces. et deNot.).

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ABSTRACT

The objetive of this paper was to identify the etiology of a rapeseed disease de-tected in a spring crop located in experimental field of the Faculty of Agronomie andBragado in Buenos Aires, Argentina. This disease appeared at the fructifing stage G^G.,and was characterized by the presence of a necrotic area in the basal internode associa-ted with irregular shaped cancker.

Plants showed premature wilting and the pods did not have seeds. Globose and os-tiolated picnides developed on desintegrated tissues.

Tests of pathogenicity on three cultivars and one hybrid indicated the disease wasBlackleg of rapeseed and the causal agent was identified as Phoma lingam (Tode.Fr.)Desmaz. This is the first report in Argentina about this pathogen in rapeseed's crop. Thesymptomatology associated was described.

Key words: rapeseed, Blackleg, Phoma lingam.

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(Recepción: 16 noviembre 2000)(Aceptación: 2 julio 2001)