PERSPECTIVAS CLINICAS Y EXPERIMENTALES EN EL USO DE...
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PERSPECTIVAS CLINICAS Y EXPERIMENTALES EN EL USO DE LA HORMONA MELATONINA COMO ANTIOXIDANTE CELULAR GREGORIO TISKOW DROST UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTAL “LISANDRO ALVARADO” BARQUISIMETO, FEBRERO DEL AÑO 2005
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PERSPECTIVAS CLINICAS Y EXPERIMENTALES EN EL USO DE LA HORMONA MELATONINA COMO
ANTIOXIDANTE CELULAR
GREGORIO TISKOW DROST
UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTAL
“LISANDRO ALVARADO”
BARQUISIMETO, FEBRERO DEL AÑO 2005
PERSPECTIVAS CLINICAS Y EXPERIMENTALES EN EL USO DE LA HORMONA MELATONINA COMO
ANTIOXIDANTE CELULAR
Por GREGORIO TISKOW DROST
TRABAJO DE ASCENSO PARA OPTAR A LA CATEGORÍA DE PROFESOR ASOCIADO EN EL ESCALAFÓN DEL PERSONAL
DOCENTE Y DE INVESTIGACIÓN
UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTAL “LISANDRO ALVARADO”
DECANATO DE MEDICINA
BARQUISIMETO, FEBRERO DEL AÑO 2005
PERSPECTIVAS CLINICAS Y EXPERIMENTALES EN EL USO DE LA HORMONA MELATONINA COMO
ANTIOXIDANTE CELULAR
Por
GREGORIO TISKOW DROST
TRABAJO APROBADO
_________________________ _______________________ RIGOBERTO GUERRERO LUIS BATALLA SOTELO COORDINADOR
__________________________ AURA LOPEZ DE ORTEGA
BARQUISIMETO, 29 DE MARZO DE 2005
PENSAMIENTOS Sólo 3 frases celebres llenarán este espacio, un espacio de reflexión para
todo aquél que aún logra visualizar las maravillas del Universo:
Un plan es cosa real, y las cosas proyectadas son experimentadas. Una vez
hecho y visualizado un plan se convierte en una realidad junto con otras
realidades- nunca se destruirá, pero es fácil de ser atacado….
John Steinbeck
En nuestra época, en la que todo lo sabido está aprendido del ayer, es deber
lógico rememorar y aceptar los orígenes verdaderos de las cosas…
Gabriel Rojas
Nos juzgamos por lo que creemos que somos capaces de hacer; en tanto,
que otros nos juzgan por lo que ya hemos hecho…
Henry W. Longfellow
IV
AGRADECIMIENTOS
.-Al Laboratorio de Bioenergética Celular del Centro de Biofísica del
IVIC, en las personas de mis tutores de siempre: Dr. Reinaldo Marín, Dr.
Fulgencio Proverbio y la Sra. Teresa de Proverbio. Siempre juntos….
.-Al personal de Laboratorio de la Unidad de Investigación en Fisiología,
empleados, técnicos y obreros por el apoyo incondicional de siempre…
.-Al personal de la Biblioteca “Marcel Roche” del IVIC, Centro de
Referencia Documental y Científico de Latinoamérica, quienes por dos
meses apoyaron con su entusiasmo y colaboración esta obra…
.-Al personal docente de la Sección de Fisiología del Decanato de
Medicina, mi segundo hogar, quienes con su apoyo irrestricto me
permitieron consolidar el año sabático y la ejecución de esta obra…
A todos ellos…. Muchas Gracias….
V
DEDICATORIA
A Nohelli y Flavia, las que siempre han sabido que esta es mi pasión y
que todo este trabajo tendrá un beneficio al final…
Un beso para las dos…
VI
RESUMEN
La melatonina (N-acetil-5-metoxi-triptamina) es una hormona producida
por la glándula pineal cerebral y otras estructuras del cuerpo, que fue aislada
por vez primera en 1959 por Lerner y su equipo de trabajo. Desde esa fecha
ha sido aislada en numerosos organismos, desde vertebrados hasta
unicelulares y plantas superiores. La producción de la hormona en todas las
especies, incluyendo a los humanos, es regulada por el entorno cíclico
fotoperiódico, con la fase diurna de luz asociada a bajos niveles de
melatonina y la fase de oscuridad, a elevados niveles de la misma. A causa
de su mecanismo regulatorio dependiente de la luz, la melatonina es
producida y liberada bajo un esquema circadiano. Tiene como característica
fundamental la de ser liposoluble e hidrosoluble, lo que la hace una
molécula que puede difundir con facilidad a través de los compartimientos
celulares. Entre las principales funciones que se han atribuido a la hormona
se encuentran, la de control de los ritmos biológicos, el ciclo sueño-vigilia,
ser inmunoestimulador, intervenir en el control del inicio de la pubertad,
agente oncostático y una, que en la última década ha cobrado elevado
interés entre los pinealólogos, la de ser un antioxidante celular, es decir un
agente que puede neutralizar a los radicales libres derivados del oxígeno.
Según numerosos autores, la melatonina reduce el estrés oxidativo de
distintas maneras; en forma directa, removiendo los radicales libres y en
forma indirecta, estimulando los otros mecanismos defensivos contra la
acción nociva de los radicales libres. En ensayos realizados in vitro e in vivo, la
VII
melatonina ha sido utilizada en dosis farmacológicas, encontrándose que es
efectiva para reducir el daño ocasionado a diversas estructuras celulares por
los agentes oxidativos. La melatonina carece de toxicidad a dosis elevadas,
suministradas inclusive a diario, sin mayores efectos colaterales, económica
y de fácil administración. Otra acción que se está investigando con
insistencia, es el de la función de la melatonina en el envejecimiento celular;
el papel de los niveles fisiológicos de la hormona, que decaen
progresivamente con la edad, está siendo evaluada por su importancia en la
capacidad de defensa antioxidante total del organismo. Otros autores por su
parte, han criticado fuertemente el hecho que esta hormona sea propuesta
como un antioxidante celular, ya que no cumple los requisitos para tal fin;
proponen que la melatonina puede actuar como un removedor de radicales
libres de tipo preventivo, pero de la clase catalogada como desactivadores
de iones metálicos favorecedores de la generación de radicales libres. Los
datos experimentales aportados por el autor del presente trabajo, favorecen
la idea que la melatonina si se comporta como un agente neutralizador de la
peroxidación lipídica, requiriéndose más investigaciones para confirmar si
efectivamente la melatonina puede ser clasificada bajo los esquemas actuales
como un clásico y efectivo antioxidante celular.
Palabras Claves: Melatonina, Antioxidante Celular, Radicales Libres,
Peroxidación Lipídica, Glándula Pineal, Ritmos Biológicos, Neurociencias
VIII
INDICE
Cápitulo Pag.
Pensamientos IV
Agradecimientos V
Dedicatoria VI
Resumen VII
Lista de Figuras XII
Lista de Tablas XIII
Lista de Gráficos XIV
Lista de Cuadros XV
I. MARCO TEORICO (Antecedentes, Introducción, Planteamiento del Problema, Objetivos) 1 II. LA GLANDULA PINEAL (Anatomía, Fisiología y Bioquímica) 12 A.-Anatomía de la Glándula Pineal 12
1.-Dimensiones, ubicación, peso 12 2.-Situación anatómica-conformación-relaciones 12 3.-Embriología-Evolución 14 4.-Inervación 16 B.-Fisiología de la Glándula Pineal 18 1.-Control del inicio de la pubertad 19 2.-Regulación de ritmos biológicos 21 3.-Regulación de la temperatura corporal 22 4.-Inducción del sueño 23 5.-Influencia en el crecimiento corporal 23
IX
Cápitulo Pag.
6.-Efectos sobre diversos órganos endocrinos 25 a.-Corteza adrenal 25 b-Glándula tiroides 26 c.-Otras glándulas 26 C.-Biosíntesis, Secreción y Metabolismo de las Hormonas Pineales 27
1.-Sitios de producción de melatonina 28 a.-Síntesis de melatonina en la pineal 28 (1).-Melatonina en los fluidos corporales 34 b.-Producción de melatonina en otros tejidos 36 c.-Regulación neuro-farmacológica de la síntesis de melatonina 37 d.-Distribución y metabolismo de melatonina 43 e.-Regulación de la síntesis de melatonina 46
D.-Estructura y Propiedades Fisicoquímicas de la Melatonina 49
E.-Receptores Celulares de la Melatonina 52
F.-Acción de la Melatonina en Células y Tejidos Corporales 59
1.- A nivel cerebral 59 2.- A nivel de sistema inmunológico 61 3.- A nivel endocrino y sistemas de control y retroalimentación 62 4.-Otras acciones 65
X
Cápitulo Pag.
III. MELATONINA COMO ANTIOXIDANTE CELULAR 67
A.-Papel de los Radicales Libres en el Proceso de Salud
y Enfermedad 72
B.-¿Por qué la Melatonina como Antioxidante Celular? 73
C.-¿Qué Características Bioquímicas de la Melatonina han Permitido Postular a esta Molécula como Antioxidante? 81
D.-Acciones protectoras de la melatonina en su papel de Antioxidante a nivel de órganos y tejidos corporales 83
1.-Sistema nervioso central 83 2.-Sistema gastrointestinal 87 3.-Piel 89 4.-Otras acciones antioxidantes 89
E.-Evaluación del Estrés Oxidativo en Ratas con Diabetes Mellitus tipo I Inducida por Estreptozotocina: Posible Papel Protector de la Melatonina 96 F.-Niveles de Peroxidación Lipídica en Fantasmas de Glóbulos Rojos Sometidos a Radiación Ultravioleta Tratados o no con Melatonina 109 G.-Otras Acciones de la Melatonina 117
XI
Cápitulo Pag.
IV. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 119
BIBLIOGRAFIA 124
ANEXOS 137
XII
LISTA DE FIGURAS
Pag.
Fig. 1 Visión de Descartes acerca de la glándula pineal la sede del alma 3 Fig. 2 Ubicación anatómica de la glándula pineal cerebral 13 Fig. 3 Ruta de biosíntesis de la hormona melatonina 31 Fig. 4 Mecanismos de transducción de señales intracelulares para la síntesis de melatonina 33 Fig. 5 Esquema de la inervación de la glándula pineal y un ejemplo de su acción a nivel endocrino 39 Fig. 6 Estructura química de la melatonina 50 Fig. 7 Representación tridimensional de la unión de la melatonina a su receptor 53 Fig. 8 Modelo propuesto de acción inhibitoria de la melatonina
sobre células gonadótropas neonatales de ratas 58 Fig. 9 Representación esquemática del proceso de peroxidación lipídica 146
XIII
LISTA DE TABLAS
Pag.
Tabla I Valores de melatonina en fluidos corporales humanos 35 Tabla II Propiedades fisicoquímicas de la melatonina 51 Tabla III Clasificación de los receptores de melatonina 56 Tabla IV Niveles de peroxidación lipídica en rebanadas de corteza de riñones de animales controles y experimentales 107 Tabla V Niveles de peroxidación lipídica en membranas de glóbulos rojos sometidos o no a radiación U.V., tratados o no con melatonina 0 hidroxi-tolueno-butilado 115
XIV
LISTA DE GRAFICOS
Pág.
Gráfico 1 Parámetro fisiológico analizado: peso corporal 102
Gráfico 2 Parámetro fisiológico analizado: volumen de orina 105
Gráfico 3 Parámetro bioquímico analizado: nivel de glicemia 106
XV
LISTA DE CUADROS
Pág.
Cuadro 1 Peso de los animales control y experimental 102
Cuadro 2 Volumen de orina excretado en 24 horas en
animales controles y experimentales 105
Cuadro 3 Niveles de glicemia en animales control y
experimental 106
XVI
I.- MARCO TEORICO
(ANTECEDENTES, INTRODUCCIÓN GENERAL, PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA, OBJETIVOS)
La glándula pineal (Epiphysis cerebri), ubicada cerca del centro de
nuestro principal órgano de control y pensamiento, el cerebro, es la
encargada de producir la hormona denominada Melatonina. La glándula
pineal o cuerpo pineal, ha sido estudiada con insistencia por los fisiólogos y
bioquímicos desde hace ya varias décadas y aún, la misma no se comprende
del todo. Ha sido siempre un tópico de especulación filosófica y
controversia científica. Por mucho tiempo, se tenía la idea errada que la
pineal en mamíferos representaba apenas un órgano vestigial de la evolución
de las especies, considerándola como un mero apéndice epitálamico. La
función de la glándula pineal y su principal hormona, la melatonina, es uno
de los misterios más subyugantes en la fisiología de los órganos de los
mamíferos, aunque con los adelantos actuales de la biología molecular y
celular, este misterio pudiera tener una pronta solución y esté a la vuelta de
la esquina. Se ha planteado con sólidos argumentos experimentales que lo
apoyan, que la glándula pineal es un complicado y sensible “Reloj
Biológico” encargado de convertir información proveniente del ambiente,
en este caso, señales fóticas, en actividad cíclica nerviosa que
posteriormente se traduce en información hormonal, orquestada por el
sistema endocrino.
Se conoce la existencia de la glándula pineal desde hace más de dos
mil años, cuando Galeno de Pergamon en el Siglo II escribió que a los
anatomistas griegos les había llamado la atención la situación particular de
dicho cuerpo, concluyendo que servía de drenaje o regulador del flujo de
pensamiento, que se creía almacenado en los ventrículos laterales del
cerebro. En el Siglo XV, Berengario da Carpi, relacionó este órgano con la
idea de un filtro del líquido cerebroespinal. En el Siglo XVII, René
Descartes propuso que la glándula pineal era la sede del alma racional del
hombre, cuando postuló su Teoría Mecanística de la Percepción. En la
misma, Descartes proponía que el ser humano percibía con sus ojos los
eventos reales que se sucedían en el entorno y se transmitían a la pineal por
medio de cordones o haces en el cerebro. La pineal respondería permitiendo
que los humores secretados pasaran a los músculos donde se producirían las
respuestas adecuadas (Wurtmann, 1965). Por lo menos, los estudios han
demostrado en éste, como en otros aspectos de su pensamiento, la gran
intuición del filósofo. Ver Fig. No. 1
Hacia finales del Siglo XIX y comienzos del Siglo XX a la glándula
pineal se le dio mayor relevancia con un enfoque más científico que
metafísico. En 1898 Otto Heubner, médico alemán, publicó un caso clínico
de un adulto joven que tenía como antecedente una pubertad precoz
correlacionándolo con un tumor de la pineal (pinealoma). En años sucesivos
continuaron describiéndose más casos de niños con pinealomas, casi todos
varones y desarrollo de pubertad precoz. En 1954 Julian Kitay de la Escuela
Figura No. 1
Visión de Descartes acerca de la Glándula Pineal como la
sede del alma
Médica de Harvard halló en su trabajo descriptivo de tumores pineales que
la gran mayoría de casos clínicos de retraso en la pubertad eran
consecuencia de tumores pineales con una actividad incrementada de la
glándula. Descubrimientos histopatológicos posteriores describieron que la
pineal después de la pubertad, comenzaba un proceso de calcificación
progresiva.
En 1918 Nils Holmgren, anatomista sueco, examinó la región pineal
de ranas mediante microscopia de luz y advirtió que la pineal contenía
células sensoriales de diferente naturaleza, que asemejaban a los conos de la
retina y estaban enlazados a células nerviosas. A partir de entonces se
sugirió que, la pineal pudiera funcionar como un órgano fotorreceptor o
“tercer ojo” en los vertebrados inferiores.
Curiosamente en 1917, Carey McCord y Floyd Allen del Johns
Hopkins University (citado en Bardasano-Rubio, 1978), observaron que
extractos de glándula pineal de bovinos adicionados a un medio en el cual se
sumergía piel de batracios, la misma blanqueaba, perdía color. A comienzos
de los años sesenta, Eberhardt Dodt en Alemania, demostraba que la pineal
de sapo, es un auténtico discriminador de longitudes de onda de luz,
convirtiendo energía lumínica en impulsos nerviosos. No estaba lejos de la
propuesta de Descartes. En esa misma década, Johannes Ariens Kappers,
neuroanatomista alemán (citado en Bardasano-Rubio, 1978), publicó un
estudio detallado de las conexiones nerviosas de glándula pineal en ratas,
hecho interesante que demostró que a pesar que este órgano se originaba
embriológicamente en el cerebro, perdía todas las conexiones nerviosas con
el mismo luego del nacimiento. De esta forma, quedaba claro que no
existían conexiones o tractos nerviosos procedentes del cerebro y que
tuvieran influencia neural sobre la glándula, al menos en ratas. Este autor
demostró también que la pineal estaba intensamente inervada por fibras
procedentes del sistema simpático, originados en el ganglio cervical superior
ubicado en el cuello.
Pero, a juicio crítico del autor del presente trabajo, es a finales de los
años cincuenta cuando se produce el descubrimiento más importante
relacionado con la glándula pineal y su función. En 1958, Aaron Lerner,
dermatólogo, y su equipo de trabajo de la Escuela Médica de la Universidad
de Yale, identificaron un componente químico único, aislado de la glándula
pineal de bovinos, la cual denominaron posteriormente Melatonina1 (N-
acetil-5-metoxitriptamina) con la propiedad de aclarar la piel de anfibios,
mediante la agregación de los gránulos de melanina dentro de los
melanocitos (Lerner, 1959)
Posteriormente Nicholas Giarman, farmacólogo de la Universidad de
Yale, analizó extractos pineales de mamíferos encontrando la presencia de
serotonina, una amina de estructura molecular parecida a la melatonina. Ese
mismo año, Julius Axelrod y Hebert Weissbach caracterizan
bioquímicamente la acción metoxilante de la enzima hidroxi-indol-O-metil
transferasa (HIOMT) que convierte la N-Acetilserotonina en melatonina. 1 Melatonina: su nombre se debe a que la hormona tiene la propiedad de actuar sobre los MELAnóforos, aclarando la piel en anfibios, y de sero TONINA, su precursor inmediato.
En 1960 Virginia Fiske del Wellesley Collage, reportó que la exposición de
ratas a iluminación continua por varias semanas, conducía a una
disminución en el peso de sus pineales y cambios en la función gonadal
(incrementos en el peso de los ovarios y aceleración del ciclo estral). Sobre
la base de estos datos y otros estudios, Richard Wurtmann, William Roth y
Elizabeth Chu, postularon que la melatonina era una hormona y que se
comportaba como el elemento clave de un transductor neuroendocrino
como lo es la glándula pineal (Wurtmann, 1965). Después de dilucidar la
cascada enzimática que produce la melatonina en la pineal, Hoffman y
Reiter en 1965, comprobaron que la disminución en los pesos de las
gónadas de hamsters inducido por exposición de los mismos a períodos
largos de oscuridad, era completamente bloqueado por la pinealectomía
(Lerchi, 2002). Finalmente, Wurtmann y Axelrod presentaron dos hipótesis
magistrales para la investigación en esta glándula: una que, la pineal era un
transductor neuroendocrino y que la melatonina era la hormona que
mediaba los efectos del fotoperíodo (ciclos de luz-oscuridad) a nivel
sistémico. En los años 80, se demostró que la melatonina no sólo estaba
presente en animales, sino también en plantas y hasta en organismos
unicelulares (Lerchi, 2002)
Por más de 30 años luego de su descubrimiento, la melatonina ha
sido evaluada ampliamente en referencia a sus efectos, fundamentalmente
sobre el sistema neuroendocrino, en especial el sistema reproductor. Desde
1990 los estudios se han ido extendiendo, evaluando el efecto de la
hormona sobre otros sistemas fisiológicos y adjudicándole otras
propiedades. Como dato curioso, se puede mencionar que el creciente
conocimiento acerca de la pineal y la melatonina, es reflejado en un
incremento en el número de publicaciones relativas a las mismas, pasando
de unas cuantas en 1960 a más de 4000 en el año 2001 (Lerchi, 2002)
En adición a los efectos mencionados, la melatonina está envuelta en
el control de los ritmos biológicos en organismos superiores e inferiores de
la escala evolutiva; en muchas especies la hormona regula los ciclos
estacionales de reproducción, alimentación, termorregulación e hibernación.
La melatonina tradicionalmente ha sido vista como la “hormona de la
oscuridad”, ya que se secreta en mayor cantidad en la fase de oscuridad del
fotoperíodo. Esta señal es usada por muchos organismos para ajustar sus
relojes internos y sus sistemas fisiológicos al tiempo real del día o a ciclos
estacionales.
Otras funciones que se han atribuido recientemente a la melatonina
incluyen control del metabolismo celular, efectos oncostáticos, estimulación
del sistema inmunológico, control del apetito, inducción del sueño, control
del inicio de la pubertad, efectos anti-envejecimiento, y una que desde 1993
se ha venido manejando con insistencia, encontrando apoyo entre los
investigadores, pero también con muchos detractores, aquella por la cual, la
melatonina puede actuar como sustancia removedora de radicales libres, es
decir, comportarse como un antioxidante celular. Los radicales libres son
moléculas o agentes químicos, que poseen un electrón desapareado en su
orbital más externo, altamente reactivos con componentes celulares y que
generan alteraciones o daños, reversibles e irreversibles a nivel celular y
tisular. Se ha propuesto que la melatonina es capaz de remover o neutralizar
estos radicales libres. La hormona es una sustancia natural cuyas
concentraciones requeridas para ejercer esta acción podrían ser del rango
fisiológico (picogramos), pero hay muchas discrepancias a este respecto, ya
que todos los ensayos realizados al presente han empleado dosis
farmacológicas (en el rango micromolar o milimolar), lo que a juicio de
muchos autores, no podría catalogarse a la melatonina a este respecto como
un verdadero antioxidante.
La melatonina a dosis farmacológicas se ha demostrado ejerce
protección importante contra la acción de los radicales libres en diversas
situaciones patológicas como, diabetes mellitus, toxicidad por metales
pesados, asbestosis, toxicidad por pesticidas, colitis ulcerativa, enfermedad
de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, procesos inflamatorios, enfisema
pulmonar, catarata senil, degeneración macular, iniciación y crecimiento
neoplásicos, daños por isquemia-reperfusión, entre otros (Reiter, 2000)
Numerosas evidencias apuntan a que la melatonina puede
comportarse como un verdadero antioxidante celular; los hallazgos han
sugerido entre otros postulados que, la eficacia de la hormona como
antioxidante pudiera estar relacionada a la facilidad con la cual cruza la
membrana celular. Otras investigaciones han sugerido que la melatonina
remueve y detoxifica selectivamente oxidantes altamente reactivos, por lo
menos in vitro, donando un electrón a estos compuestos electrofílicos
(Poeggeler, 1994)
Otros investigadores han postulado que la melatonina promueve la
estabilización de la membrana celular. De interés particular es que, la
melatonina sólo influye sobre la fluidez de la membrana cuando se
acompaña de estrés oxidativo. Esta acción estabilizante pudiera ser otro
factor importante por el cual la hormona reduce el daño oxidativo a órganos
y tejidos corporales. También se ha descrito que la melatonina promovería
la actividad de enzimas antioxidantes presentes en el organismo (Poeggeler,
1994) y (Reiter, 2001)
Contrario a las premisas anteriores, un grupo de investigadores han
señalado que la combinación in vivo de las propiedades antioxidantes muy
débiles de la melatonina y, su relativa baja concentración en el plasma y
tejidos corporales, hacen improbable que la hormona pueda ser considerada
como un elemento removedor de radicales libres o inhibidor de la
lipoperoxidación celular al grado que se ha planteado (Antunes, 1999)
Por lo antes expuesto, el autor ha considerado que es de relevante
importancia contribuir a esclarecer las dudas que se han suscitado entre la
comunidad científica encargada del estudio de la hormona melatonina, sus
efectos y consecuencias, tomando en cuenta el interés del autor por el tema,
las investigaciones realizadas en el campo de acción de los radicales libres
sobre tejidos y órganos animales y recientemente, los efectos protectores de
la melatonina en afecciones como la diabetes mellitus y la hipertensión
arterial inducida por el embarazo (pre-eclampsia), es que se realiza este
trabajo que abarca dos aspectos fundamentales: una revisión integral y
amplia acerca de la fisiología y bioquímica de la glándula pineal y su
principal hormona, la melatonina, así como dilucidar si ésta última, cumple
los requisitos bioquímicos y fisiológicos mínimos para ser considerada
como una sustancia antioxidante.
OBJETIVOS DEL TRABAJO:
En base a la exposición realizada y los argumentos que conllevaron a
plantear el problema expuesto, se formularon los siguientes objetivos para la
realización de este trabajo:
1.- Evaluar con sentido crítico los más recientes descubrimientos
relacionados con la fisiología, la bioquímica y biología molecular de la
glándula pineal y su hormona, la melatonina.
2.-Caracterizar en base a los hallazgos experimentales del autor, a la
melatonina como probable agente removedor de radicales libres derivados
del oxígeno, esto es, como antioxidante celular.
Para una comprensión adecuada del tema propuesto, se ha dividido el
trabajo en tres grandes aspectos: a) los relacionados con la anatomía, la
fisiología y la bioquímica de la glándula pineal; b) aquellos que permiten la
caracterización bioquímica y molecular de la hormona melatonina en base a
las investigaciones más recientes y, c) los que permiten comprender el
mecanismo de acción de los radicales libres en células, tejidos y órganos del
cuerpo y como la melatonina pudiera ser considerada o no un agente
antioxidante.
II.- GLANDULA PINEAL
ANATOMIA, FISIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA
A.-ANATOMIA DE LA GLANDULA PINEAL
1.-Ubicación, Peso, Dimensiones
La glándula pineal o epífisis cerebral, es un cuerpo impar, de color
grisáceo-rojizo, de ubicación central en el cerebro que se desarrolla a
expensas de una evaginación de la bóveda del tercer ventrículo. Mide por
término medio de 7 a 8 mm y de 4 a 6 mm de anchura en un adulto joven.
Pesa ordinariamente menos de 200 mg. Se halla recubierta por la piamadre.
Su peso específico es de 1,047 a 1,050
2.-Situación Anatómica-Conformación-Relaciones
En el ser humano se sitúa por debajo del rodete del cuerpo calloso,
entre los dos tubérculos cuadrigéminos anteriores que le forman lo que se
ha denominado el lecho de la glándula pineal. Por debajo de la glándula, se
observa el abocamiento del acueducto de Silvio en el tercer ventrículo (Ver
Fig. No. 2). La pineal se ha comparado siempre a una piña, a un cono con
la base dirigida hacia delante, de ahí los diversos nombres que se le han
dado: pineal, cuerpo pineal, conarium, entre otros. Se considera en ella una
parte media o cuerpo, un extremo anterior o base y un extremo posterior o
vértice.
Figura No. 2
Ubicación anatómica de glándula pineal en el cerebro
Glándula Pineal
El cuerpo es ligeramente liso o granuloso; se relaciona por arriba con
las venas de Galeno y el rodete del cuerpo calloso; por abajo, con el surco
longitudinal que separa los dos tubérculos cuadrigéminos anteriores; por los
lados, con los plexos coroideos del tercer ventrículo. La base dirigida hacia
delante, se desdobla en dos laminillas transversales, una superior y otra
inferior. El vértice dirigido hacia atrás y abajo, es a veces redondeado, otras
veces puntiagudo. Dicho vértice flota libremente por encima de los
tubérculos cuadrigéminos, en los espacios subaracnoideos. La glándula está
unida al cerebro por un conjunto de fascículos nerviosos que nacen de su
base. Estos fascículos, denominados pedúnculos de la glándula pineal, son
en número de seis, ubicados tres a cada lado.
3.- Embriología-Evolución
Como parte integrante del epitálamo diencefálico, la pineal se
desarrolla como un divertículo de la línea media de la parte caudal del techo
del tercer ventrículo cerebral. Comienza su desarrollo al final del segundo
mes fetal. Un hecho interesante de su desarrollo es que, la pineal pierde en
el adulto casi todas las conexiones neurales pinealofugales y en lugar de ello
resulta inervado de una forma nueva e inusual. Los pinealocitos o sea, las
células parenquimatosas de la glándula, reciben los impulsos nerviosos a
través de neuronas simpáticas post-ganglionares, cuyos cuerpos celulares se
hallan en el ganglio cervical superior del cuello.
Un rasgo común de todos los órganos pineales, tanto los de función
fotorreceptora en vertebrados inferiores, como los de función glandular en
vertebrados superiores (incluyendo los mamíferos), es el desarrollo de
distintos tipos de células a partir de la matriz ependimaria. La ulterior
diferenciación en dirección a un órgano sensorial o a glándula endocrina, se
lleva a cabo en las distintas especies gracias a un desarrollo y proliferación
característicos de los elementos celulares (Bardasano-Rubio, 1978)
En humanos, existen dos tipos de células diferenciadas a partir de las
células primordiales neuroepiteliales, de las cuales se desarrolla la pineal
embrionaria humana. Uno de los tipos celulares madura hacia las células
astrocíticas con prolongaciones bien definidas y diferenciadas. El otro tipo
celular se convierte en los pinealocitos, formando nidos y sólidos cordones
dentro de la matriz glial. Las prolongaciones de los pinealocitos rodean a los
vasos sanguíneos encargados de su nutrición. Se asemejan a las neuronas,
con un pericarion y un número desconocido de procesos citoplasmáticos; el
núcleo es grande y con un nucléolo prominente (Bardasano-Rubio, 1978)
También se han encontrado restos de fibras musculares estriadas en el
órgano pineal de ciertos mamíferos, lo que sugiere la existencia de un
posible “ojo ancestral” que tal vez tuvo movimiento voluntario (Bardasano-
Rubio, 1978). No se han encontrado en pinealocitos de mamíferos
elementos fotorreceptores, a diferencia de otros vertebrados inferiores y
anfibios.
Diversos autores están de acuerdo en señalar que, al menos 3 grandes
cambios estructurales han ocurrido en el desarrollo filogenético de la pineal
de mamíferos, los cuales están envueltos en las respuestas de la pineal a la
luz (Wurtman, 1980):
a) Un nuevo tipo celular, el pinealocito, desarrollado, careciendo de
organelas subcelulares para la fotorrecepción, pero conteniendo otras
organelas como por ejemplo, abundante retículo endoplasmático,
característico de células secretorias.
b) Un nuevo patrón único de inervación de la glándula. La abundante
cantidad de fibras nerviosas simpáticas post-ganglionares que llegan a la
pineal desde el ganglio cervical superior, y que terminan, no en los vasos
sanguíneos como era de esperarse, sino sobre o cerca de los pinealocitos, las
células secretoras de la melatonina. Estos nervios median el control cerebral
de la pineal.
c) Una porción del tracto óptico conteniendo fibras cuyos cuerpos celulares
descansan en la retina, divergiendo para formar una haz nervioso, el tracto
óptico accesorio inferior, los cuales transmiten la porción del estímulo
lumínico que alcanza la pineal.
4.- Inervación
La inervación de la glándula pineal en mamíferos ha sido claramente
definida tanto morfológica como funcionalmente. Como ya mencionado, las
fibras nerviosas provienen del ganglio cervical superior, proporcionando la
inervación simpática, corren por la arteria carótida interna y penetran a la
pineal como nervios conarios. En un principio se creía que la pineal no
recibía inervación central, pero esto ha cambiado. Fibras nerviosas alcanzan
la glándula vía habenular y a través de las comisuras posteriores, y ahora,
con las modernas técnicas neurobiológicas disponibles, se ha aclarado que
estas fibras tienen importancia funcional. Estudios con peroxidasa de
rábano y microlesiones dirigidas, han revelado que estas fibras nerviosas
pinealopetales centrales se originan en diversas regiones del cerebro,
incluyendo la habénula, núcleos supraquiasmático y paraventricular del
hipotálamo, amígdala, centros olfatorios, área pre-óptica, cuerpos
geniculados laterales y ciertas zonas de la estria medular. En estas fibras se
han caracterizado entre otras, neuropéptidos como oxitocina, vasopresina,
hormona liberadora de hormona luteinizante, péptido intestinal vasoactivo.
Las fibras eventualmente se distribuyen en la glándula, algunas insertándose
en la periferia y otras en el centro. Sorprendentemente, en ratas el 90% de
las fibras nerviosas que se internan en la pineal tienen una localización
perivascular, el resto permaneciendo entre pinealocitos. Ello es muy
curioso, ya que las fibras nerviosas simpáticas predominan en los espacios
perivasculares y los nervios conarios llegan a la pineal independientemente
de los vasos sanguíneos (Thipayang, 1998)
B.- FISIOLOGIA DE LA GLANDULA PINEAL
Lejos de ser el órgano rudimentario que muchos investigadores
creyeron que era, hoy día se reconoce que la glándula pineal posee una
intensa actividad bioquímica y reviste enorme importancia fisiológica en el
control de numerosas funciones corporales en las distintas especies
animales. La pineal es de mayor tamaño en el hombre que en la mujer y en
la infancia lo es más que en la edad madura; comienza a disminuir de
tamaño a partir de los 7 u 8 años de edad. Esta involución en el tamaño o
atrofia de una glándula, lejos de ser negativa, parece tener implicaciones
funcionales importantes o madurativas en los seres vivos.
Entre los fisiólogos existieron importantes controversias para
catalogar a la glándula pineal como un transductor neuroendocrino,
controversias afortunadamente solventadas en la propia década de los años
sesenta. Esta claramente definido que, para transmitir información desde el
sistema nervioso a un órgano endocrino, un transductor neuroendocrino
debería presentar algunas características especiales, tanto del tejido neural
como del endocrino. Debe además, responder a sustancias liberadas
localmente desde las terminaciones nerviosas, y debe contener la maquinaria
bioquímica necesaria para sintetizar una hormona y liberarla a la circulación
sanguínea. La pineal, cumpliendo estos requisitos ha sido catalogada como
un transductor neuroendocrino, capaz de convertir un impulso nervioso de
entrada (input) (proveniente del estímulo fótico, en una respuesta de salida
hormonal (output) (secreción de melatonina) (Axelrod, 1963), (Wurtman,
1980) y (Alonso-Solis, 1992)
La pineal es el órgano del sistema visual, el cual transduce el mensaje
fotoperiódico en una señal química la cual sirve como un mensajero para
cada órgano del cuerpo. La pineal es pues, el intermediario entre la señal
fotoperiódica externa y el medio interno corporal.
Entre las numerosas funciones que se han asignado a la glándula
pineal se pueden enumerar y destacar las siguientes:
1.- Control en el inicio de la pubertad.
Desde el mismo momento del nacimiento, los testículos y los ovarios
poseen una estructura lo suficientemente adecuada como para que en
presencia de las gonadotropinas se inicie su maduración en forma
inmediata. Sin embargo, este estímulo se halla reprimido, frenado a nivel de
la hipófisis cerebral. La hipófisis, capacitada para producir dichas
gonadotropinas en presencia del adecuado estímulo hipotálamico de
hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), no las produce por carencia
de éste. En el adulto, los esteroides sexuales se autorregulan al unirse a
receptores hipotalámicos específicos que, a partir de cierta concentración
sanguínea disparan la vía opioide u opiatérgica productora de endorfinas
(opiáceos fisiológicos). Esta a su vez, distorsiona la pulsatilidad de la GnRH
que frena la producción y liberación de gonadotropinas, por lo que las
gónadas en ausencia de dicho estímulo, dejan de producir esteroides
sexuales, disminuyendo su concentración en el plasma. Con ello, los
esteroides unidos a los receptores respectivos, se liberan y se vuelve a
activar la liberación de GnRH. En el periodo pre-púber debería pasar lo
mismo, pero no es así. La hormona melatonina, esta descrito, tiene la misma
afinidad por los receptores hipotalámicos de esteroides sexuales que éstos.
En la niñez, se produce mayor cantidad de melatonina que en periodo post-
púberal, de forma que constantemente se halla unida a tales receptores
hipotalámicos, activando la vía opiatérgica, impidiendo así la liberación de
GnRH, y en consecuencia la maduración de las gónadas (Alonso-Solis,
1992) y (Ganong, 2003)
A partir de los 7 años de edad, la pineal disminuye progresivamente
de tamaño, y en consecuencia, la concentración de melatonina también lo
hace, hasta un punto en que ya no se une a suficiente número de receptores
hipotalámicos, bloqueándose la vía opiatérgica, produciéndose entonces la
síntesis y liberación por primera vez de GnRH. Ello sucede a partir de los
11-12 años en la mujer, y de los 13-14 años en el hombre. Se da inicio así a
la pubertad. Descubrimientos histopatológicos han descrito que la pineal
comienza a calcificarse al inicio de la pubertad (arenilla pineal)
De esta manera, la melatonina ha sido caracterizada como una
hormona con propiedades anti-gonadales (Wurtman, 1977). Trabajos
complementarios han demostrado que la pinealectomía en ratas machos o
hembras jóvenes pre-púberes, induce a una maduración sexual prematura.
El mismo efecto lo causa la iluminación continua, pues como se verá más
adelante, la pineal inhibe la producción de melatonina bajo esta condición.
Cuando los animales son expuestos por su parte a oscuridad continua o se
les induce ceguera, se describe retardo en el desarrollo sexual y disminución
en el tamaño de órganos reproductivos (Romijn, 1978)
2.-Regulación de los Ritmos Biológicos.
En la naturaleza los niveles de luz cambian con los ciclos diurnos y
anuales, aunque los humanos poco lo percibamos. De hecho, casi no
percibimos las maravillas del Universo. La relación día/noche (fotoperíodo)
varía con un ritmo anual que alcanza su nadir en el solsticio de invierno y su
cenit el primer día de verano. Se ha demostrado sobre todo en animales
inferiores que, los ciclos de luz-oscuridad son muy importantes en la
regulación de diversos tipos de función endocrina, entre ellos la
reproducción. Tales ritmos se han denominado circadianos (del latín circiter
que se traduce por “alrededor de un día”, 24 horas). Los ritmos circadianos
endógenos o regulados internamente incluyen la actividad motora, ciclo
sueño-vigilia, temperatura corporal, presión arterial, patrones de secreción
de diversas hormonas, valores basales de numerosas sustancias o sustratos
fisiológicos, entre otros.
Una de las principales funciones de la glándula pineal es precisamente
la sincronización de los ritmos biológicos del cuerpo. Este efecto es más
prominente en aves y reptiles, donde la pineal es una parte integral del
sistema de control circadiano. Se ha descrito que en mamíferos los ritmos
circadianos pueden persistir, aún en animales pinealectomizados sin
interferencias obvias. Ello hace presumir la existencia de otro(s) órganos(s)
encargado(s) del control de los ritmos endógenos. También en mamíferos,
el más importante de los papeles de la pineal y su hormona, la melatonina,
es mediar la regulación de los ritmos estacionales mediante la percepción de
fotoperíodos. La adaptación a las estaciones envuelve cambios en el status
reproductivo, pautas de alimentación, calidad y coloración de las pieles, y
adaptabilidad a la hibernación. Estos cambios incrementan la viabilidad de
sobrevivencia de los organismos durante las estaciones más desfavorables
del año. El ritmo estacional de fertilidad en animales es regulado por
cambios en la frecuencia de pulsos de liberación de la hormona GnRH.
(Vanecek, 1998). En líneas generales, se puede postular que la pineal actúa
sin duda como un órgano sincronizador, estabilizador y modulador de los
distintos procesos fisiológicos del organismo.
3-Regulación de la temperatura corporal.
El papel de la pineal y de la melatonina en el control de la
temperatura corporal central ha sido conocido desde hace bastante tiempo.
Se ha visto que en humanos la melatonina tiene distintos impactos sobre la
temperatura corporal. Y esto es verdadero para situaciones naturales bajo las
cuales la síntesis de la hormona está inversamente correlacionada con los
cambios de temperatura, así como también cuando la melatonina es
suministrada exógenamente (Lerchi, 2002). Ensayos efectuados en gorriones
(Passer domesticus), a los cuales se les monitoreaba continuamente la
temperatura central por radio-telemetría, mostraron que el ritmo diurno
normal de temperatura corporal persistía como ritmo circadiano aún cuando
los animales eran colocados en oscuridad constante. La pinealectomía sin
embargo, abolía este ritmo circadiano en oscuridad constante y reducía la
temperatura corporal. Se concluyó así que la pineal era esencial para la
función normal del reloj biológico que controla el ritmo de temperatura
corporal, ubicándose este reloj en el hipotálamo (Romijn, 1978)
Así se le asignaba a la pineal otro papel, el de regulador fino del
proceso de termorregulación.
4.-Inducción del sueño.
Hay evidencias concluyentes que señalan que la pineal y la melatonina
son inductoras potenciales del sueño. De hecho, la pineal esta involucrada
directamente en el control del ritmo sueño-vigilia, ritmo que posee
circadianidad. Lo que no esta claro aún es, cómo la melatonina ejerce una
acción de tal naturaleza a nivel cerebral. Cuando se aisló por vez primera la
melatonina se descubrió que tenía un efecto sedante moderado en los
animales. En 1982 Wurtman y colaboradores, demostraron que la hormona
puede inducir el sueño en las personas también. En sus primeros ensayos, se
utilizaron dosis elevadas de melatonina (hasta 240 mg) y se describió que
tales dosis dejaban muy cansadas a las personas al día siguiente. En otra
serie de ensayos, dosis entre 0,1 y 10 mg de melatonina causaron aumento
de la somnolencia con menor cansancio post-sueño. Dosis muy pequeñas
de melatonina son suficientes para subir los niveles al punto de inducir
sueño relajador, y dado que no causa efectos colaterales ni dependencia, se
ha venido usando con frecuencia e insistencia para tratar casos de insomnio,
sobre todo en ancianos (Pierpaoli, 1996)
5.-Influencia sobre el crecimiento corporal.
De acuerdo a Hester (citado en Romijn, 1978), la pineal ejerce un
efecto inhibitorio sobre el crecimiento. En sus estudios el autor utilizó ratas
machos y hembras, enucleadas unilateral y bilateralmente en combinación o
no con pinealectomía. Las autopsias efectuadas entre los 25 y 125 días
posteriores a las maniobras, revelaron mediante pesaje de órganos que en
ratas hembras la enucleación solamente retardó el crecimiento ovárico,
uterino, adrenal y pituitario; la pinealectomía previno esta inhibición del
crecimiento en todos los casos. En machos se detectó tamaño corporal
reducido, pesos disminuidos de los testículos, vesículas seminales, glándulas
adrenales y la pituitaria. Este efecto fue contrarrestado por la pinealectomía.
Estos resultados indujeron al autor postular que la melatonina inhibe o
causa una reducción en la secreción de somatotropina, gonadotropinas y
adrenocorticotropinas en la hipófisis. Trabajos posteriores efectuados por
diversos investigadores han indicado que, por lo menos en ratas la
melatonina actuaría como un bloqueador general o inhibidor competitivo a
nivel de hipotálamo o hipófisis, bloqueando o frenando la producción de
factores del crecimiento. Otros trabajos más interesantes, señalan que la
pineal no sólo ejerce un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de tejidos
sanos, sino también actuaría como agente oncostático, inhibiendo el
crecimiento tumoral (Lerchi, 2002). Estos efectos no sólo se han
demostrado in vitro sino también in vivo ; en un estudio realizado por
investigadores de la Facultad de Medicina de la Universidad de Texas,
descubrieron que la melatonina podría reducir en un 50% la tasa de
crecimiento de tumores de próstata en ratas. La melatonina podría impedir
el desarrollo de tumores sensibles a hormonas sexuales, normalizando la
producción de éstas últimas. En todo caso, las últimas investigaciones han
indicado que la hormona pudiera actuar a través de diversas vías atacando a
las células neoplásicas. Una de ellas podría ser bloqueando el proceso de
división celular, ya que se ha visto que la melatonina impide la formación de
husos mitóticos. Otros hallazgos demuestran que la melatonina aumenta el
número de receptores de estrógeno en células cancerosas humanas; aunque
parezca paradójico, este aumento del número de receptores por razones aún
no claras, podría desempeñar un papel crucial en la inhibición de la
proliferación celular (Pierpaoli, 1996). Los estudios más recientes han
demostrado la acción protectora de la melatonina contra la acción de los
radicales libres, sustancias éstas envueltas directamente en la aparición y
desarrollo de neoplasias. Respecto a este punto y por su trascendental
importancia, se reserva más adelante un aparte especial en el capítulo
dedicado a la melatonina y su mecanismo de acción.
6.-Efectos sobre diversos órganos endocrinos.
a.-Corteza Adrenal: diversos estudios indican que la pineal restringe y
modula la esteroidogénesis adrenal bajo condiciones normales y de estrés.
Ensayos efectuados por Kinson y su grupo (citado en Romijn, 1978) en
ratas a los cuales indujeron pinealectomía, un mes después del mismo se
observó que la secreción de aldosterona y corticosterona adrenal habían
aumentando, al igual que los valores de presión arterial en los animales. Así
se propuso que la pineal debe normalmente ejercer un efecto inhibitorio
sobre la glándula adrenal, efecto que no sólo debe estar confinado a la
aldosterona.
Investigaciones hechas por De Fronzo (citado en Romijn, 1978)
sugirieron que la pineal inhibe la función adrenal vía la intermediación de la
hipófisis. De esta forma, se puede proponer que la pineal tendría como otra
función elemental, controlar y modular las reacciones fisiológicas de defensa
y adaptación a cambios en el entorno y a situaciones de estrés.
b.-Glándula Tiroides: En este caso también se han reportado efectos
inhibitorios de la pineal sobre la función tiroidea. Tratamiento con
melatonina a ratas adultas causa una reducción en el peso de la glándula y
disminución en la captación de yodo y secreción de hormona tiroidea. La
pinealectomía tiene el efecto opuesto (Romijn, 1978)
c.-Otras glándulas: Dado el papel modulador de la pineal y en lo que
respecta a otras funciones endocrinas, se han descrito interacciones
recíprocas entre la pineal y otras glándulas como el páncreas donde la
melatonina ejercería un efecto tónico sobre la secreción de insulina y sobre
el timo, donde ejercería efectos estimulatorios y reguladores (Romijn, 1978)
C.-BIOSINTESIS, SECRECION Y METABOLISMO DE LAS
HORMONAS PINEALES
La melatonina ha sido caracterizada en todos los mamíferos
vertebrados, en especies invertebradas, 16 familias de plantas superiores,
eucariotas unicelulares, levaduras y procariotas.
En la glándula pineal de los vertebrados inferiores y superiores se han
caracterizado diversas sustancias de estructura química muy peculiar,
incluyendo no solo la melatonina como la hormona más representativa, sino
a la arginina-vasotocina, vasopresina y oxitocina, así como las respectivas
neurofisinas, componentes de la familia de la propiomelanocortina,
componentes del sistema renina-angiotensina y distintos neuropéptidos
como somatostatina, neuropéptido Y, polipéptido intestinal vasoactivo,
hormona liberadora de tirotropina, hormona liberadora de hormona
luteótropa. Lo que permanece en estudio es si tales sustancias tienen origen
neural o son producidas por los pinealocitos. Lo que si está bien aclarado es
que, la pineal sintetiza a través de los pinealocitos, diversas indolaminas a
partir del triptófano circulante (Alonso-Solis, 1992) y (Ganong, 2003)
Dado que el objetivo fundamental de este trabajo es el de caracterizar
bioquímica y farmacológicamente a la melatonina, en las páginas sucesivas
se procederá a la descripción detallada de esta hormona así como de sus
metabolitos principales. Aún queda mucho camino por recorrer en la
investigación acerca de la bioquímica de la glándula pineal, por lo que
mientras las investigaciones en el área de estudio de las otras sustancias que
se han descrito en la pineal continúan, se profundizará en el estudio de la
melatonina como principal indolamina sintetizada por éste órgano cerebral.
1.-Sitios de producción de melatonina
Dentro del sistema neuroendocrino difuso (SNED), dos grandes
poblaciones celulares productoras de melatonina pueden ser distinguidos: el
central y el periférico. El central incluye a los pinealocitos ubicados en la
glándula pineal, y el sistema visual que abarca la retina y la glándula
Harderiana, todos los cuales exhiben un ritmo de secreción de melatonina
que se adapta al ciclo biológico de luz-oscuridad. El periférico da cuenta de
todas las células localizadas fuera de las áreas nombradas, producen la
hormona y su función no depende probablemente del grado de iluminación
ambiental; es el caso de los intestinos (Kventoy, 1999)
a.-Síntesis de melatonina en la glándula pineal
Las rutas de síntesis de la hormona melatonina en la glándula pineal
de mamíferos esta bien caracterizada desde principios de los años setenta.
Para la síntesis de melatonina se requiere que el pinealocito capte el
aminoácido triptófano de la circulación general, probablemente por un
mecanismo de transporte activo. Se ha reportado que los niveles de
triptófano son mayores al final del período de iluminación ambiental con un
decaimiento progresivo a medida que avanzan las horas nocturnas. La
captación de triptófano hacia el pinealocito está bajo control de
mecanismos simpáticos noradrenérgicos (Ebels, 1986), (Kennaway, 2002) y
(Ganong, 2003). Se ha demostrado que adición de l-noradrenalina a cultivos
de pinealocitos causan un marcado incremento en la formación de
melatonina a partir del triptófano (Axelrod, 1974)
Luego que el aminoácido es captado es inmediatamente hidroxilado a
5-hidroxitriptófano (5-HTP) por la enzima triptófano hidroxilasa, que
requiere de oxígeno molecular y tetrahidrobiopterina (una pteridina
reducida) como cofactores. Se ha detectado que la concentración de
tetrahidrobiopterina es mayor en tejido pineal que en cualquier otra
localización cerebral. La actividad de esta enzima es regulada por receptores
ß-adrenérgicos que utiliza a su vez, AMPc como segundo mensajero. Se ha
reportado que la actividad de esta enzima en mamíferos es mayor en horas
nocturnas.
Siguiendo hacia la formación de melatonina, el (5-HTP) es
descarboxilado a serotonina (5-hidroxitriptamina) /5-HT) por la acción de
la 5-hidroxitriptófano decarboxilasa, la cual tiene una distribución muy
abundante en la pineal y no exhibe un patrón circadiano de actividad. La
enzima requiere de 5-fosfato piridoxal como cofactor (Zinder, 1967)
Aparentemente esta enzima no responde a la estimulación noradrenérgica.
Respecto a la serotonina, se ha descrito que el contenido de la misma en la
pineal de distintas clases de mamíferos, es mayor durante el día y disminuye
en horas de la noche.
La serotonina (5-HT) tiene una variedad de rutas metabólicas dentro
de la pineal. Las principales rutas incluyen la deaminación oxidativa para
originar 5-hidroxi-indol acetaldehído por acción de una mono-aminooxidasa
(MAO), orto-metilación que resulta en la formación de 5-metoxitriptamina,
y por supuesto, la de mayor interés fisiológico, la N-acetilación para formar
N-acetilserotonina, precursor inmediato de la melatonina (Ganong, 2003)
Para detalles de la ruta metabólica referirse a la Fig. No.3
La serotonina en presencia de acetil-Coa y la enzima N-acetil
transferasa (NAT) (EC 2.3.1.87), es convertida a N-acetilserotonina. La
actividad de la NAT fue de las primeras enzimas en ser demostrada que
poseía un ritmo circadiano de 24 horas en la pineal. La NAT tiene un peso
molecular de 39.000 daltons y transfiere un grupo acetilo desde la acetil-
CoA a un aceptor de amina en este caso, la serotonina. Se ha definido que la
actividad de la NAT es la limitante en la tasa de producción de melatonina
pineal. La actividad de la NAT es iniciada en la glándula pineal en horas
nocturnas por estimulación de la adenilato ciclasa, vía de un receptor ß1-
adrenérgico. El proceso comienza con la liberación de noradrenalina a partir
de las terminaciones nerviosas simpáticas post-ganglionares que finalizan en
la pineal. Después de su interacción con los receptores adrenérgicos en la
membrana celular de los pinealocitos, se produce estimulación de la
producción de AMPc intracelular con la activación de la cascada de
segundos mensajeros correspondientes. Se requiere de la síntesis de ARNm
para la inducción de la actividad de la NAT. Ciertas drogas como la
adrenalina, isoproterenol y L-Dopa causan un marcado incremento en la
actividad de la NAT durante el día; bloqueantes ß-adrenérgicos como el l-
propranolol previenen esta elevación (Axelrod, 1974)
Figura No. 3
Ruta de biosíntesis de la hormona melatonina
Triptófano 5-OH-Triptófano
Serotonina
N-acetil-serotonina
MELATONINA
5-metoxi-triptofol
5-metoxi-indol-acético
5-OH-indol-acético
5-OH-triptofol
5-OH-indol-acetaldehído
Triptófano Decarboxilasa
Triptófano Hidroxilasa
En adición a la activación de receptores ß1-adrenérgicos, la
noradrenalina también se une a receptores a-adrenérgicos en la membrana
del pinealocito, incrementando el recambio de fosfatidilinositol que resulta
en la liberación intracelular de otros segundos mensajeros, como
diacilglicerol (DAG), ácido fosfatídico e inositol trifosfato (IP3). Esta ruta
sin duda, envuelve un efecto de potenciación de la activación de los
receptores beta por parte de los receptores alfa para una mayor actividad de
la enzima NAT. La N-acetil serotonina formada por N-acetilación, es el
precursor inmediato de la melatonina. La cantidad de N-acetilserotonina
formada en la pineal semeja la actividad de la enzima NAT; así, los valores
son mayores en la noche de N-acetil serotonina cuando la actividad de N-
acetilación de la serotonina es mayor. Ver Figura No. 4
La O-metilación de la N-acetilserotonina conduce a la formación de
melatonina. Este paso requiere de la enzima hidroxi-indol-ortometil-
transferasa (HIOMT) (EC 2.1.1.4); esta enzima no sólo está envuelta en la
síntesis de melatonina, sino en la producción de otros metoxi-indoles
pineales. La HIOMT tiene dos subunidades pequeñas de 39.000 daltons y
representa entre 2-5% del total de proteína soluble en la pineal. La HIOMT
se encuentra altamente concentrada en la pineal de aves y mamíferos;
algunas pequeñas cantidades se han podido hallar en la retina de rata. La
HIOMT en anfibios, peces y réptiles se ha localizado también en el ojo y
cerebro, además del cuerpo pineal (Axelrod, 1974). La sustancia que actúa
Leyenda: C: adenil-ciclasa; NAT: N-acetil-transferasa; PC: protein-cinasa dependiente de AMPc; PCC:
protein-cinasa C; Gs: proteína G estimulatoria; PLC: fosfolipasa C; DG: diacilglicerol; NA: noradrenalina;
IP: inositol-fosfato; VIP: péptido intestinal vasoactivo; R: receptores
Figura No. 4
Mecanismos de transducción de señales intracelulares para la síntesis de la melatonina
como donadora de metilos en este paso de la reacción es la S-adenosil
metionina (SAM).
Una vez producida la melatonina en el pinealocito, rápidamente
escapa a la circulación sanguínea. No se ha descrito a la fecha ningún
mecanismo activo para explicar el eflujo de la hormona desde la glándula.
La molécula es altamente liposoluble por lo cual, el mecanismo de difusión
simple es suficiente para explicar su descarga a partir del pinealocito.
(1).- Melatonina en los fluidos corporales
Una vez liberada la melatonina al torrente sanguíneo, la misma se
distribuye ampliamente por todos los tejidos corporales. Los niveles
óptimos se alcanzan desde luego en el plasma sanguíneo . En el plasma los
niveles de la hormona reflejan el ritmo de producción de la misma en la
glándula pineal., exhibiendo un típico patrón circadiano, esto es,
incrementos nocturnos de los niveles y descenso de los mismos en horas
diurnas. En mamíferos vertebrados, las concentraciones de melatonina
varían entre 0,1 nM y 1 nM. En líquido cefalorraquídeo (LCR), se ha descrito
que los niveles de melatonina exhiben de igual manera, un ritmo nada
diferente al encontrado en el plasma. Determinaciones efectuadas en
humanos, han demostrado que los niveles de melatonina son de rutina
mayores en plasma que en líquido cerebroespinal. En saliva, los niveles
diurnos de melatonina en humanos son equiparables a los del plasma; en
comparación, los valores nocturnos fueron de casi 1/3 menores de aquellos
presentes en plasma. Los valores más representativos indican
concentraciones de 0,5 a 0,9 pmol/h en el día y de 1,0 a 2,4 pmol/h en la
noche. Como dato interesante, en reportes efectuados por Wurtman y
colaboradores se vio que los niveles de melatonina séricos en mujeres eran
mayores, justo antes y durante el período menstrual (Wurtman , 1977)
En el líquido folicular ovárico, se ha descrito que el mismo concentra
cantidades importantes de la melatonina, sobre todo en los folículos pre-
ovulatorios. Las concentraciones promedio de la hormona en líquido
folicular son de 36,5 ± 4,8 pg/ml, valores mucho mayores que los hallados
en plasma de mujeres voluntarias, cuyas muestras se tomaron a la misma
hora (10 ± 1,4 pg/ml). La Tabla I presenta los valores más representativos
de melatonina en los principales fluidos corporales.
Tabla I
Valores medios de melatonina (MLT) en fluidos corporales humanos
Líquido Valores de MLT en el día Valores de MLT en la noche
Plasma (pg/ml) 12 – 135 (44) 45-200 (225)
Orina (ng/4h) 1-12 (6) 4-40 (25)
LCR (pg/ml) 1-60 (39) -
Entre parentésis, valores medios. Tomado de Alonso-Solis (1992)
b.- Producción de melatonina en otros tejidos
La síntesis de melatonina está más ampliamente distribuida en el
organismo de los mamíferos de lo que se pensaba anteriormente. La lista de
células productoras y almacenadoras de melatonina, indican que la hormona
tiene una posición única entre todas las demás hormonas del sistema
neuroendocrino, siendo hallada en prácticamente todos los sistemas
orgánicos. Tomando en cuenta la cantidad de células productoras de
melatonina en el cuerpo, el amplio espectro de actividades biológicas de la
misma y especialmente, su propiedad universal de reguladora de ritmos
biológicos, se pudiera hipotetizar que la melatonina extrapineal pudiera
jugar un papel clave como molécula mediadora de las señales paracrinas,
para la coordinación local de relaciones intercelulares. De hecho, y como
dato adicional que apoyaría tal hipótesis se tiene que en muchas de las
células vecinas en distintos tejidos donde la melatonina ha sido detectada, se
han caracterizado receptores de alta afinidad por la hormona. Esta
propiedad parece ser la distinción principal entre la melatonina extrapineal y
la producida en la glándula.
Uno de los principales sitios de producción de melatonina extrapineal
lo constituye sin duda alguna el intestino delgado. Análisis matemáticos han
demostrado que el número total de células enterocromafines (EC) presentes
en el intestino, es significativamente mayor que el número posible de células
secretoras de la hormona en la pineal (Kventoy, 1999). Se ha evidenciado
que el tracto gastrointestinal de aves y mamíferos contiene al menos, 400
veces más melatonina que la misma glándula pineal. Para algunos
investigadores, estos datos y el hecho que las células EC dan cuenta del 95%
de toda la serotonina endógena, el precursor principal de la melatonina,
sugiere que las células EC son la principal fuente de melatonina en humanos
y tejidos animales (Kventoy, 1999)
Estudios posteriores han demostrado que la retina ocular y los
órganos ciliares e iris, incluyendo órganos orbitales accesorios como la
glándula Harderiana y lacrimales extraorbitales, cuentan con la maquinaria
sintética necesaria para la síntesis de melatonina. En adición a ello, algunas
células sanguíneas han sido evaluadas y tienen la posibilidad de producir
melatonina (Reiter, 1991)
c.-Regulación neurofarmacológica de la síntesis de melatonina
El incremento nocturno en la producción de la melatonina en la
pineal está bajo el control de la inervación simpática de la glándula. El
ritmo de secreción de melatonina por el pinealocito, se estima que es
iniciado por la actividad neuronal presente en el núcleo supraquiasmático
del hipotálamo (NSQ). Así, lesiones de este núcleo previenen el incremento
nocturno en la actividad de la enzima NAT pineal (Wurtmann, 1965)
Las proyecciones caudales del NSQ pudieran incluir una sinapsis en
el núcleo paraventricular, y por lo tanto, una conexión monosináptica con la
columna celular intermediolateral del cordón medular torácico superior
(Bittman, 1984). Estas neuronas simpáticas preganglionares dan lugar a
fibras las cuales abandonan la médula espinal por la raíz ventral y pasan al
tronco simpático para hacer sinapsis sobre cuerpos celulares cuyos axones
terminan eventualmente en la pineal. Durante el día, la actividad neural
dentro de las fibras simpáticas que inervan la pineal está deprimida por la
influencia lumínica, información ésta que es transferida al NSQ del
hipotálamo. Para detalles de la inervación, ver Figura No. 5
Una pregunta que ha fascinado a los investigadores de este campo
por muchos años, es ¿cómo puede actuar la oscuridad en el proceso de estimulación de
la glándula pineal para producir la melatonina y la luz tener el efecto contrario? Para la
década de los sesenta se plantearon 3 posibilidades, (Wurtman, 1963):
a) Que la luz penetrara directamente a través del cráneo y actuará
directamente sobre la glándula pineal. Ganong y sus colaboradores de la
Universidad de Berkeley en California, demostraron que cantidades
significativas de luz pueden penetrar el cráneo de vertebrados inferiores.
Figura No. 5
Esquema de la inervación de la glándula pineal y un ejemplo de su acción a nivel endocrino
(tomado de Wurtman, Scient. Am., 1975)
Glándula Pineal
Médula Espinal
Ovario
Hormona Luteinizante
Melatonina secretada
Hipotálamo
Hipófisis
Nervio óptico
Luz
Ganglio cervical superior
Nervio simpático pre-ganglionar
Nervio simpático post-ganglionar
Esta hipótesis fue luego desechada al comprobarse que ratas ciegas
perdían por completo la capacidad de responder a la luz con cambios en la
actividad de la enzima HIOMT; así se postuló que la retina debía ser la
receptora de las ondas lumínicas.
b) La segunda posibilidad que se había planteado era que la luz alterara el
nivel de hormona circulante, afectando quizás la glándula pituitaria y que
ésta hormona, secundariamente afectase la actividad enzimática en la misma
glándula pineal. Esta hipótesis se descartó también ya que la remoción
quirúrgica de la pituitaria y los ovarios no interferían con la respuesta de la
HIOMT a la luz.
c) La tercera posibilidad y la más aceptable es que, la información lumínica
es transmitida a la pineal por vía nerviosa. Se comprobó luego que la
sección de las terminaciones simpáticas, o la extirpación del ganglio cervical
superior, alteraban la formación inducida por la luz de la melatonina. El
incremento en la actividad de la NAT (de casi 30 veces) en horas de la
noche, pudiera ser explicado por la liberación reducida de noradrenalina
durante el día, causando así una supersensibilidad al neurotransmisor
descargado con mayor concentración al inicio de la fase de oscuridad.
Otros hallazgos notables han sido que, la luz tiene la capacidad de
influenciar en la formación de la enzima 5-hidroxi-triptófano decarboxilasa
que induce la formación de serotonina a nivel pineal, más no en otros
órganos. En contraste a la HIOMT, la actividad de la decarboxilasa se
incrementa cuando ratas experimentales son mantenidas bajo iluminación
constante y decrece con la oscuridad (Axelrod, 1963)
Es en la noche, justamente cuando la actividad de la glándula pineal
es máxima, cuando el cuerpo físico y la mente se restauran y se estabilizan
de los efectos de la actividad diaria y el estrés cotidiano. En este período, la
actividad nerviosa parasimpática se incrementa, la musculatura se relaja, las
frecuencias cardiaca y respiratoria se reducen, el metabolismo general se
minimiza, mientras que la hormona del crecimiento en plasma aumenta
(Romijn, 1978). La actividad endocrina de la pineal es reflejada por el nivel
de metabolitos de indolamina presentes en plasma y orina. Esta premisa es
apoyada por los siguientes hechos:
a) El neurotransmisor pinealotrópico, la noradrenalina, cuya liberación está
aumentada en la noche, estimula simultáneamente la síntesis y liberación de
indolaminas pineales.
b) La elevada tasa de recambio del metabolismo de indolaminas pineales en
la noche, se refleja por un nivel de melatonina elevado en plasma sanguíneo
y líquido cefalorraquídeo, con un pico elevado en la excreción urinaria del
metabolito 5-hidroxi-indolacético.
c) En la noche la actividad de la pineal es máxima.
d) La concentración de melatonina y serotonina se ha encontrado que es
mayor en la pineal que en otros tejidos cerebrales.
e) La tasa de flujo sanguíneo por gramo de tejido pineal, excede aquella de
muchos otros órganos endocrinos, igualando al de la neurohipófisis y sólo
sobrepasado por los riñones.
Se ha considerado como muy importante el tener presente los dos
componentes del ritmo de secreción de melatonina, es decir, la duración del
tiempo que permanece elevada la melatonina en plasma (a) y la amplitud del
ritmo de secreción (b), tal como se presenta a continuación:
b
a
La duración de la concentración de melatonina elevada en plasma es
proporcional además, a la duración del período de oscuridad diario.
Considerando que bajo condiciones naturales la relación luz/oscuridad
cambia sobre la base de una relación diaria y mensual, el mensaje que la
pineal envía al organismo debe variar diariamente y estacionalmente. En
muchas especies de animales, los altos niveles de melatonina son
mantenidos por sólo un breve período durante la noche, mientras que en
otros, virtualmente todo el período de oscuridad se halla asociado con
niveles circulantes elevados de la hormona. En períodos como el invierno,
cuando las noches son más largas, la duración de la concentración de
melatonina elevada está también prolongada (Reiter, 1991)
d.-Distribución y metabolismo de la melatonina
Una vez que la hormona es liberada de los pinealocitos a la
circulación sanguínea mediante difusión simple gracias a su alta
liposolubilidad, difunde con rapidez y se distribuye hacia otros líquidos y
tejidos corporales. Cantidades apreciables y detectables pueden ser
cuantificadas en líquido cefalorraquídeo, líquido ocular (cámara anterior del
ojo), saliva, líquido folicular ovárico, líquido seminal, leche materna y
líquido amniótico. La melatonina tiene la capacidad de atravesar la placenta
a partir de lo cual provee información fotoperiódica al feto (Rowe, 2002)
La melatonina circulante en plasma viaja en parte unida a la albúmina
(60-70%) y el resto en forma libre. La vida media de la melatonina en la
circulación sanguínea es de aproximadamente 15-20 minutos. La mayor
parte de la hormona es inactivada en el hígado mediante su conversión a 6-
hidroxi-melatonina la cual es excretada por la orina en forma de compuestos
sulfatados (75%) o glucurónidos (5%). Otra parte de la melatonina (15%) es
transformada en el tejido cerebral a compuestos derivados de la
kinurenamina, y sólo apenas un 5% o menos, se excreta en forma libre por
la orina. Los metabolitos urinarios de la melatonina exhiben también un
ritmo circadiano que asemeja con el de la melatonina en plasma (Alonso-
Solis, 1992). El promedio de excreción de metabolitos de la hormona por
vía urinaria varía considerablemente entre los individuos, oscilando entre 0-
30 ng/8 h, pero es muy consistente día a día. Entre un 60 y 70% del total
excretado por día, se realiza entre las 11 pm y la 6 am. (Wurtman, 1977) y
(Fourtillan, 2001)
Entre los metabolitos derivados de la melatonina se encuentran
diversos compuestos indólicos. El grupo 5-metoxi de la molécula no es
retenido necesariamente en ellos. La melatonina incluso, puede ser
reconvertida en su precursor, N-acetilserotonina en especies como aves y
mamíferos, incluyendo al hombre. Esta última ruta parece predominar a
nivel de la retina que posee mayores cantidades de N-acetilserotonina que
de melatonina (Allen, 1991). Mejor documentado se encuentra el efecto de
los indoles 5-metoxilados, en particular la 5-metoxi-triptamina. Esta se
puede producir por las siguientes vías: 1) O-metilación de la serotonina
debido a la acción de la enzima HIOMT, el cual ocurre en retina, pineal y
glándula Harderiana de roedores; 2) vía de O-metil-transferasas inespecíficas
localizadas en tejidos vegetales (Banerjee, 1973); 3) a partir de la melatonina
por medio de la enzima aril-acilamidasa (Beck, 1981)
La 5-metoxi-triptamina es rápidamente degradada en la glándula
pineal a 5-metoxi-triptofol mediante la acción de la Mono Amino Oxidasa
(MAO) (Galzin, 1986). En varias clases de mamíferos y otras especies de
vertebrados el 5-metoxi-triptofol está presente en la pineal, retina y glándula
Harderiana. Presenta alta hidrofobicidad. Se han descrito influencias
antigonadales de este metabolito, incluyendo efectos sobre células de Leydig
(Hardeland, 1993). Tiene la capacidad también de hacer disminuir la
temperatura corporal en ratas. El metabolito es degradado rápidamente a
ácido-5-metoxi-indolacético que se excreta por la orina.
Otro metabolito de interés derivado a partir de la 5-metoxi-triptamina
es el N-N-Dimetil-5-metoxi-triptamina que es formado por vía de la N-
metil-transferasa; la molécula es poco hidrofóbica. Es de mucho interés en
el área psicopatológica y está presente además en concentraciones
importantes en numerosas plantas tropicales alucinógenas (Hardeland,
1993). La ruta sintética para formar el compuesto mencionado se cree,
comienza con la N-metilación de la serotonina dando lugar a la bufotenina,
que luego es O-metilada por la HIOMT (Banerjee, 1973). Se ha considerado
a esta sustancia como un potente ligando serotoninérgico.
El metabolismo de las indolaminas 5-metoxiladas no está restringida
sólo a modificaciones de sus residuos laterales. La cadena alifática en
especial puede sufrir también ciclación. Pueden presentarse en este caso dos
posibilidades: una, es la formación de un segundo anillo de 5 átomos de
carbono, apareciendo simultáneamente con hidroxilación y saturación del
doble enlace en posición 2-3. Esto origina el isómero cíclico de la 2-hidroxi-
melatonina. Esta sustancia se ha aislado en orina de ratas y humanos
(Hardeland, 1993). La segunda opción de ciclación es mediante la
incorporación de un átomo de carbono adicional, formándose las ß-
carbolinas. Estas sustancias son halladas en todos los tejidos que producen
melatonina. Su generación metabólica bajo condiciones fisiológicas es aún
incierta. Poseen efectos psicomiméticos relacionados con la interferencia de
dos importantes mecanismos neurobiológicos: unión a receptores
benzodiazepínicos y modulación de la afinidad del sitio de unión de la
imipramina relacionado al transportador de serotonina (Haefely, 1985). Las
ß-carbolinas se ha visto que influencian la secreción de hormonas a nivel de
pituitaria, en especial, la prolactina.
Una de las principales ß-carbolinas metoxiladas detectadas es la
Pinolina (6-metoxi-1,2,3,4-tetrahidro- ß-carbolina = 5-metoxi-triptolina).
Los sitios de unión de este metabolito se han detectado densamente en la
pineal, también en otras regiones del cerebro y áreas de corteza y médula
adrenal (Hardeland, 1993)
Otra importante vía del metabolismo de la melatonina conduce a la
formación de kinuraminas sustituidas, formadas por clivaje del anillo
pirrólico de la melatonina. La reacción puede ser catalizada por la
indolamina-2,3-dioxigenasa, una hemoenzima que requiere de aniones
superóxido como sustrato (Vanecek, 1998). El primer metabolito que se
forma por el clivaje del anillo pirrólico es el N1-acetil-N2-formil-5-metoxi-
kinuramina (AFMK), que luego por acción de la arilamina formamidasa la
convierte en N1-acetil-5-metoxi-kinuramina (AMK). Ambas sustancias han
sido caracterizadas en el cerebro, en mayor proporción en glándula pineal.
e.-Regulación de la síntesis de melatonina
Se han descrito elementos fisiológicos que participan bien sea, en la
estimulación o en la inhibición de la síntesis de la hormona. Se describirán a
continuación algunos de los principales elementos investigados a la fecha y
su influencia en la síntesis de melatonina.
.-Noradrenalina: como ya ha sido señalado anteriormente, el efecto del
inicio de la oscuridad en mamíferos conduce a la liberación de noradrenalina
a partir de las terminaciones nerviosas simpáticas provenientes del ganglio
cervical superior. La noradrenalina activa receptores ß1 y estimula la
actividad adenilato-ciclasa con la consecuente producción de AMPc. Este
proceso estimula la síntesis de melatonina.
.-GABA: lo que se ha podido describir acerca del efecto del ácido
gamma amino-butírico sobre el metabolismo de las indolaminas pineales es
variada entre las distintas especies de mamíferos. Estimulación o carencia de
este efecto puede observarse en ratas, mientras que en pineal de bovinos, el
GABA inhibe la estimulación de la enzima NAT inducida por norepinefrina
(Ebels, 1986)
-Taurina: este aminoácido sulfurado presente también en la pineal
estimula la actividad de la enzima NAT (Wheler, 1979). Sin embargo, en
combinación con la noradrenalina, su efecto es menor. Se ha evidenciado
que los niveles de taurina alcanzan un máximo en las primeras horas luego
del amanecer, y que la misma compite con la noradrenalina, haciéndola un
candidato interesante para la regulación de la biosíntesis de melatonina; no
está claro el mecanismo de acción del aminoácido.
.-S-adenosil-L-metionina: esta sustancia es una donadora natural de
grupos metilo y es efectiva sólo si el grupo amino está libre. Este grupo
amino puede reaccionar sin embargo, con el fosfato de piridoxal y perder
así, su capacidad donadora de metilos, la cual es indispensable para la
síntesis de melatonina. Del otro lado, el fosfato de piridoxal es necesario
para los procesos de descarboxilación (Ebels, 1986)
.-S-adenosil-homocisteína: este compuesto es formado cuando la S-
adenosil-L-metionina ha servido de donador de grupos metilo, y puede
unirse a la enzima HIOMT inactivándola. Recuérdese que esta enzima es
clave para la biosíntesis de la melatonina.
.-Pteridinas: estas sustancias son muy sensibles a la luz y juegan un rol
muy importante en los procesos metabólicos en mamíferos. En estas
especies, tres mono-oxigenasas de aminoácidos aromáticos como lo son la
fenilalanina hidroxilasa, la tirosina hidroxilasa y la triptófano hidroxilasa,
requieren de pteridina reducida como cofactor para su funcionamiento. La
6-L-Eritrotetrahidro-Biopterina (BH4) es el cofactor natural para las tres
enzimas citadas arriba. Las tres hidroxilasas juegan un papel crucial en la
biosíntesis de las aminas biógenas tales como, catecolaminas y dopamina, y
la serotonina-hidroxi-indolamina a partir de aminoácidos aromáticos. Así, el
BH4 es esencial para la síntesis de melatonina y otros metoxi-indoles en la
pineal (Ebels, 1986)
D.-ESTRUCTURA Y PROPIEDADES FISICOQUIMICAS
DE LA MELATONINA
La hormona melatonina, 5-metoxi-N-acetil-triptamina es una
sustancia perteneciente al grupo de las indolaminas de coloración amarillo
pálida, muy sensible a la luz, cuya estructura básica está conformada por un
anillo pirrólico con un grupo metilo en la posición 5 del grupo indol y un
grupo acetilo presente en la molécula. El grupo N-acetilo representa la
porción de la molécula que previene la unión o binding sustancial de la
misma a receptores de serotonina. También protege este grupo de la
degradación de la hormona por la enzima Monoamino-Oxidasa (MAO), una
característica que la distingue de su análogo, 5-metoxi-triptamina.
Adicionalmente, el grupo acetilo participa en la ciclación de los residuos
alifáticos (Hardeland, 1993) Ver detalles en la Figura No. 6
En la Tabla II se resumen las principales propiedades fisicoquímicas
de la melatonina.
Estructura tridimensional
Estructura planar
Figura No. 6
Estructura química de la melatonina
TABLA II
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LA MELATONINA
___________________________________________________________
Fórmula Química: -N-[2-(5-metoxi-1H-indol-3-yl) etil] Acetamida
Fórmula Estructural: C13H16N2O2 Peso Molecular: 232,27 g/mol
Composición: Carbono: 67,22%; Oxígeno: 13,78%; Nitrógeno: 12,06%; Hidrógeno: 6,94%
Espectro de Absorción y Emisión: la melatonina absorbe luz solamente en la región UV del espectro con una máxima absorción a ~278 nm. El espectro de fluorescencia es muy fuerte en la región cercana a la UV con un máximo de emisión a ~340 nm
Punto de fusión: 116-118°C
Solubilidad: en agua: 0,1 mg/ml; en etanol: 8 mg/ml
Almacenamiento: = 0°C o menor
Se cristaliza a partir de solución de benceno: mp: 116 a 119°C
Densidad: 1,269 g/cc medido por método de flotación en solución acuosa de cloruro de calcio.
Estructura Molecular: La distancia C-C en el anillo bencénico es de 1,402 A°, mientras la distancia C-C y C-N en el anillo pirrólico es de 1,405 A° y 1,394 A° respectivamente. La parte indólica de la melatonina es planar, siendo el promedio de desviación de los átomos a partir del plano 0,011 A°
E.-RECEPTORES CELULARES DE MELATONINA
La respuesta celular a la acción de la melatonina requiere que el
mensaje sea decodificado. Para ello, las células cuentan con los receptores
específicos para esta hormona. Gracias al desarrollo de modernas técnicas
para la caracterización cuantitativa de receptores, agentes farmacológicos
selectivos y ligandos como la 2-(125I) Iodomelatonina, se ha logrado avanzar
significativamente en el estudio de los receptores celulares de la melatonina.
Se ha evidenciado que los efectos de la melatonina son mediados a
través de receptores específicos de alta afinidad. El patrón de distribución
de estos receptores varía de especie a especie. En los vertebrados no
mamíferos por ejemplo, la distribución de los mismos es muy abundante, a
diferencia de los mamíferos la cual es discreta o baja (Vanecek, 1998) y
(Laitinen, 1990). El grupo 5-metoxi y la cadena N-acetilo lateral son
fundamentales para el binding de alta afinidad al receptor, ya que derivados
de la melatonina que carecen de estos grupos son menos afines al receptor.
La densidad de receptores no sólo varía con las especies y su localización,
sino en diversos tejidos está influenciado también por el fotoperíodo,
régimen de iluminación y status endocrino del individuo (etapa de
desarrollo) (Vanecek, 1998). Ver Figura No. 7
En los mamíferos, los receptores de alta afinidad por melatonina
están presentes en la pars tuberalis de la pituitaria y en núcleo
supraquiasmático del hipotálamo. Este patrón de distribución puede ser
TM: Dominios trans-membrana En verde: molécula de melatonina
Figura No. 7
Representación tridimensional de la unión de la melatonina
a su receptor
(Tomado de Balík, Physiol. Rev., 2004)
Melatonina
hallado también, pero en menor grado en área pre-óptica medial,
hipotálamo anterior, núcleos dorsomedial y ventromedial hipotalámicos,
núcleos talámico anteroventral y paraventricular, hipocampo, área postrema,
cortezas cerebral y cerebelar y retina. En retina el binding de Iodo-
melatonina se evidencia mayormente en la capa plexiforme interna, cuyas
células contienen importantes conexiones simpáticas. También ha sido
descrita su existencia en las arterias del círculo de Willis y arteria caudal de
distintos mamíferos (Vanecek, 1998)
Hasta el presente y gracias al desarrollo de estudios de
autorradiografía y biología molecular (clonamiento), se han caracterizado 3
subtipos de receptores de melatonina, perteneciendo a una subfamilia de
receptores con 7 dominios trans-membrana, conectados por 3 asas
extracelulares y 3 intracelulares, acoplados a proteína G inhibitoria sensible
a toxina pertussis presentes en la membrana plasmática celular. Los dominios
transmembrana V, VI y VII se ha sugerido están envueltos en interacciones
específicas entre el receptor y el ligando. Los subtipos de receptores de
melatonina humanos muestran una homología del 60% a nivel de
aminoácidos y distintos perfiles farmacológicos de unión de agonistas y
antagonistas (Dubocovich, 2000) y (Balík, 2004)
La nomenclatura y clasificación para los receptores de melatonina
utilizados en este trabajo son las adoptadas por la Unión Internacional de
Farmacología (IUP) en 1998 (Dubocovich, 1998). De acuerdo al mismo, los
receptores de melatonina se denominan con la letra MT, utilizando la
denominación en minúscula, (mt), para aquellos receptores de los cuales
sólo la estructura molecular se conoce.; la denominación en mayúscula se
reserva para aquellos receptores con una caracterización farmacológica y
funcional bien definidas en un tejido en particular, así como su estructura
molecular. La denominación en mayúsculas e itálicas (MT) se utiliza para
receptores caracterizados farmacológicamente a nivel tisular, pero a los
cuales no se les conoce la estructura molecular.
En la Tabla III se presenta la más reciente nomenclatura y la
caracterización de los receptores de melatonina descritos a la actualidad.
Los subtipos mt1 y mt2 parecen estar ampliamente expresados en los
tejidos antes nombrados y ser los más importantes desde el punto de vista
funcional. Hay variaciones circadianas en la densidad de receptores de
melatonina por ejemplo, en la pars tuberalis lo cual está directamente
regulado por las variaciones diarias de la propia hormona. En retina se ha
encontrado que el receptor mt2 está envuelto en la inhibición de la
liberación de dopamina. En la glándula pituitaria anterior, la melatonina a
través de sus receptores, transduce el efecto del fotoperíodo actuando a
nivel de dos tipos de células secretorias: lactotrofas que secretan prolactina y
gonadotrofas que producen la hormona luteinizante (LH) y la hormona
estimulante del folículo (FSH). La activación de receptores en la pars
distalis, conduce a la inhibición de la liberación de gonadotropinas
controlado por GnRH. Este efecto se ha observado notoriamente en células
gonadotropas neonatales; ello coincide con la expresión temprana de
receptores de melatonina de alta densidad y su gradual declinación en la
pituitaria durante el desarrollo (Balík, 2004)
TABLA III
CLASIFICACION DE RECEPTORES DE MELATONINA
Nomenclatura mt1 mt2 MT3
Otros nombres Mel1a, ML1A Mel1b, ML1B ML2
Afinidad (KD) 45 pM 140 pM 0.3-2 nM
Acoplamiento G i/o G i/o -
Radioligandos 3H-MLT 3H-MLT 2-iodo-(125I) MLT
2-iodo-(125I) MLT 2-iodo-(125I) MLT
Agonistas selectivos - IIK7 N-acetilserotonina
5MCA-NAT
Antagonistas selectivos - 4P-PDOT Prazosin
DH97, K185
Gene/cromosoma MTNR1A/4q35.1 MTNR1B/11q21-22 -
Estructura-7TM h350 P48039, h362 P49286, m121 U57554 -
M353 Q61184, r156 P49218 r120 P49287 -
Localizaciones Retina, NSQ hipotálamo Retina, cerebro Melanóforos
Cerebelo hipocampo cerebro, retina
Especies Mamíferos, Aves Mamíferos Peces, aves, anfibios
Nomenclatura: * IIK/7: N-butanoil-2(2-metoxi-6H-isoindol [2,1-a]indol-11-il)etamina; * 5MCA-NAT: 5-
metoxi-carbonilamino-N-acetil-triptamina; * 4P-PDOT: 4-fenil-2-propioamido tetralina; * DH97:2-bencil-
N-pentanoil-triptamina; * K185:N-butanoil-2-(5,6,7-trihidro -11-metoxibenxo[3,4]cicloheptano[2,1-a]indol-
13-il)etamina.
Está bien documentado que los principales efectos de los receptores
de melatonina a nivel celular son mediados por la inhibición de la actividad
de la adenilato ciclasa, conduciendo a una disminución de los niveles de
AMPc e inhibición de los procesos celulares regulados por este mensajero
intracelular. En las células que expresan por ejemplo, receptores de mt1 la
inhibición de la adenilciclasa, está ocasionalmente acompañada de una
facilitación simultánea de la actividad de la fosfolipasa C, que origina a su
vez, diacilglicerol e inositol-trifosfato. La activación de receptores tipo mt 2
también da lugar a inhibición de la actividad guanilato ciclasa, pero el grado
al cual se produce esta inhibición aún se desconoce (Balík, 2004) Ver la
Figura No. 8 que ilustra el efecto de la activación de receptores de
melatonina en células gonadótrofas neonatales, y su acción inhibitoria sobre
la liberación de LH y FSH.
Leyenda: AC, adenil-ciclasa; CNGC, canal activado por nucleótidos cíclicos; GnRH REC: receptor de
GnRH; SERCA, ATPasa de Calcio de Retículo Endoplasmático Liso; VSSC, canal de sodio sensible a
voltaje; VSCC, canal de calcio sensible a voltaje; InsP3: inositol-tri-fosfato; PLC: fosfolipasa C; Kca: canal
de potasio sensible a calcio
Efecto inhibitorio
Efecto Estimulatorio
Figura No. 8
Modelo propuesto de acción inhibitoria de la melatonina sobre células gonadótrofas neonatales de ratas
Receptor de Melatonina
Despolarización
F.- ACCIONES DE LA MELATONINA EN CELULAS Y
TEJIDOS CORPORALES
.1.- A nivel cerebral. A causa de su alta solubilidad en lípidos y agua,
la melatonina es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica, penetrar a
las neuronas y células gliales y distribuirse con facilidad entre los
componentes subcelulares. En cerebro el efecto de la hormona pudiera ser
mediado por distintos mecanismos, bien sea a través del control de la
homeostasis del calcio y sus mecanismos de señalización intracelular, a
través de sus efectos sobre el estado se alerta y sueño, o a través de su
influencia sobre la actividad de aminoácidos excitatorios o inhibitorios.
Algunos efectos centrales pudieran ser mediados por su interacción con
receptores específicos o sitios de unión expresados en ciertas regiones
cerebrales, y otros pudieran resultar de interacciones, no mediadas por
receptores, con cierta clase de neuronas o células gliales (Huethe, 1996). En
lo que respecta a este último efecto, es decir, no mediados por receptores
existe una tendencia significativa de considerar a la melatonina como
potente agente antioxidante celular, acción ésta que protegería al tejido
cerebral de la acción de los radicales libres generados en diversos procesos
patológicos (Iacovitti, 1997). Ya que éste es uno de los objetivos
fundamentales de este trabajo de investigación, más adelante se hará
referencia y en detalle, acerca del papel de la melatonina como antioxidante
celular.
.-Efectos Metabólicos: luego de la administración de la melatonina se
pueden evidenciar diversos cambios en la actividad metabólica cerebral. Se
ha detectado un incremento de casi dos veces en los niveles de GABA en el
hipotálamo y corteza cerebral (luego de inyectar a conejos adultos vía
intraperitoneal, 50 µg/kg. peso); hecho curioso es que, a dosis de 250
µg/kg. peso la concentración de GABA decae (Antón-Tay, 1974)
Los niveles de serotonina también son modificados por la acción de
la hormona; la serotonina tiende a aumentar en cerebro de ratas adultas una
hora después de la administración de 500 µg/kg. peso de melatonina. Luego
de 30 minutos de la inyección, los niveles de serotonina decayeron en un
14% en corteza cerebral, pero con importantes incrementos en el
hipotálamo. Los niveles permanecieron elevados luego de 180 minutos en
cerebro medial, disminuyendo los valores en hipotálamo y corteza hasta
estabilizarse (Antón-Tay , 1974)
Melatonina a dosis de 200 µg/kg. peso suministrados a ratas causó
un incremento notable, de casi seis veces sus valores normales, en la
actividad de la enzima piridoxal-fosfokinasa que cataliza la formación de
fosfato de piridoxal, grupo prostético muy importante de la enzima L-
aminoácido decarboxilasa, que a su vez, sintetiza la formación de serotonina
cerebral. Lo mismo se describe para la enzima ácido glutámico
decarboxilasa que cataliza la síntesis de GABA.
.- Efectos Electrofisiológicos: estudios electroencefalográficos y de
comportamiento de individuos, han indicado que la administración de
melatonina, en este caso, a gatos y pollos resulta en una desincronización
electroencefalográfica y del sueño. En sujetos voluntarios humanos,
suministrándoles melatonina a dosis de 1,25 µg/kg. peso, se observaron
cambios tales como, ligera desincronización y desactivación
electroencefalográfica y del sueño en los siguientes 30 minutos. Monitoreo
electroencefalográfico en las siguientes dos horas, mostró un incremento en
la aparición de ondas alfa de gran amplitud. Muchos sujetos luego del
ensayo, manifestaron sensación de quietud, paz y tranquilidad (Antón-Tay,
1974)
2.- A nivel del Sistema Inmunológico. Hay evidencias que refieren
que la melatonina posee efectos estimulantes sobre este sistema, aunque hay
carencia de información en cuanto a los mecanismos de acción a este nivel.
En ratones inyectados con melatonina por seis días vía intraperitoneal, se
encontró que hay estimulación en la producción de anticuerpos, incremento
en el número de células formadoras de placas en el bazo y antagonismo de
la inmunosupresión inducida por corticoesteroides (Pierpaoli-Regelson,
1996). Asimismo, a ratas pinealectomizadas y a las cuales se les suministró
melatonina exógena, se evidenció un incremento en la unidad formadora de
colonias de macrófagos en médula ódea (Huethe, 1996). Otro efecto muy
interesante y conocido desde hace cuatro décadas, es la habilidad de la
melatonina para suprimir el crecimiento de tumores y la reproducción de
células neoplásicas, inclusive en humanos (Ebels, 1986), (Maestroni, 1999) y
(Bindoni y Raffaele, 1968) observaron una elevada actividad mitótica en
adenohipófisis de ratas luego de pinealectomía. Tres años después, estos
mismos autores describieron una relación importante entre pineal y la
actividad mitótica en otros tejidos corporales. Otras evidencias
experimentales indican que, la adición de melatonina a medios de cultivo
inhibe el crecimiento de células cancerosas mamarias de humanos MCF-7;
también se ha descrito que la hormona retrasa el ciclo celular, regulando
además, la acción de factores de crecimiento sobre éstas células (García,
1998). La melatonina también tiene acción regulatoria sobre la enzima 5-
lipo-oxigenasa, en el sentido de su inhibición. Esta enzima está restringida
su presencia a granulocitos, monocitos/macrófagos, mastocitos y linfocitos
B. Esta acción envuelve la presencia de un receptor nuclear de la hormona
(Reiter, 1997) y (Xian-Tan, 1999)
3.- A nivel endocrino y sistemas de control y retroalimentación.
.- Melanóforos de la piel: la melatonina tiene la propiedad única de
concentrar los melanóforos dermales de anfibios, réptiles y peces, como un
mecanismo de adaptación a distintas intensidades de luz o iluminación
ambiental. Esta acción la realiza gracias a su propiedad de agregar
rápidamente los gránulos pigmentarios que contienen a la melanina, en
zonas perinucleares celulares, lo cual se traduce en un emblanquecimiento
de la piel del animal. Este movimiento del melanosoma es causa de los
cambios en la arquitectura del citoesqueleto del melanóforo, envolviendo la
fosforilación/desfosforilación de proteínas específicas. La dispersión de los
gránulos de melanina parece ser mediada por cinesinas, ATPasa
dependiente de microtúbulos y dineina la cual es la responsable de la
agregación. El efecto lo ejerce la melatonina, actuando vía de receptores de
alta afinidad, lo cual se traduce luego en una inhibición del contenido de
AMPc inducido por la hormona estimulante del melanocito (MSH).
Después de la exposición a la luz, la concentración de melatonina
decae, resultando en la dispersión de los gránulos pigmentarios y
oscurecimiento de la piel. El significado fisiológico de los cambios
pigmentarios parece envolver la protección de los tejidos profundos de la
peligrosa radiación solar. Este efecto no se ha reportado en mamíferos
(Vanecek, 1998)
.- Retina: la regulación de la sensibilidad visual ocurre a diferentes
niveles dependiendo de la intensidad de la iluminación ambiental. Uno de
los efectos más prominentes de la melatonina es sobre el movimiento
fotomecánico, esto es, la elongación de conos y contracción de bastones,
que ocurre en retinas de vertebrados no mamíferos como una adaptación a
una disminución en la intensidad de la iluminación. El efecto opuesto en
respuesta a una intensa iluminación, ocurre y es mediada por la dopamina.
La liberación de la dopamina en la retina es mayor en horas del día y
disminuye en horas nocturnas. La melatonina suprime la liberación de
dopamina en retina provocada por la luz. Un hecho bien interesante es que,
la melatonina se produce dentro de la misma retina. Los receptores de la
melatonina a nivel de retina se localizan a nivel de la capa plexiforme
interna, justo donde se encuentran las conexiones entre las células amacrinas
productoras de dopamina y las células ganglionares. Así, la hormona regula
la cantidad de luz que llega al fotorreceptor, controlando el movimiento de
gránulos de melanosomas dentro del epitelio pigmentario retinal. La
melatonina se ha demostrado también que altera la actividad eléctrica de
este epitelio retiniano en mamíferos, y en el control de la sensibilidad de las
células horizontales a la luz (Vanecek, 1998)
.- Ajuste y Sincronización de Ritmos Biológicos: como ya fue mencionado,
la melatonina está involucrada en la sincronización de los ritmos
circadianos. Este efecto es más notable en aves, peces y reptiles, donde la
glándula pineal es parte integrante del sistema circadiano. De esta manera,
en estos animales el ritmo de síntesis de melatonina es controlado por un
marcapasos interno (pacemaker) y continua aún después de aislamiento
completo de la pineal in vitro. Aún más, en estas especies sus pinealocitos
son sensibles a la luz y es el ciclo luz-oscuridad la que ajusta o sincroniza
directamente el ritmo de síntesis de la hormona (Bardasano-Rubio, 1978)
En los mamíferos, los ritmos persisten en animales sujetos a
pinealectomía sin ninguna interferencia importante. En humanos, el retraso
o adelanto en la fase del ritmo de 24 horas ha sido descrito después de la
administración matinal o nocturna de melatonina. Así, la melatonina puede
causar un desajuste o desvío en la fase de los ritmos de sueño/vigilia,
temperatura corporal y aparición de la melatonina pineal en plasma
(Vanecek, 1998)
.- Vasos Sanguíneos: el primer reporte que se tiene sobre la acción de la
melatonina sobre un vaso sanguíneo, proviene de la potenciación de la
acción constrictora mediada por noradrenalina en la arteria caudal en
cerebro de rata (Viswanathan, 1990). Ahora se comprobado el efecto sobre
la contracción de la arteria caudal, sobre la base del descubrimiento de
receptores mt1 de alta afinidad en la capa de músculo liso de las arterias
cerebrales anterior y caudal. Este efecto de la hormona es dependiente de la
edad del sujeto. En vasos sanguíneos asilados de ratas muy jóvenes (5
semanas de edad), la melatonina por sí misma causa una fuerte
vasoconstricción. En ratas adultas, la melatonina no mostró efectos de
vasoconstricción directa, pero en presencia de noradrenalina la melatonina
produjo un efecto constrictor pequeño y variable, adicional al de la
catecolamina (Stokkan, 2004)
Otro efecto interesante de la melatonina a nivel de vasos sanguíneos,
es su acción inhibidora de la enzima óxido nítrico sintetasa (NOS),
productora de óxido nítrico, por vía de un mecanismo que envuelve su
unión a la calmodulina (Pozo, 1994)
4.- Otras acciones.
A causa de su gran liposolubilidad, la melatonina no tiene problemas
en atravesar las membranas celulares de todas las células del organismo para
así ejercer su acción, incluso en compartimientos subcelulares incluyendo al
núcleo. La melatonina tiene también la propiedad de ligarse a la
calmodulina, proteína que liga fuertemente al ion calcio y que está envuelta
en la regulación de los niveles de calcio libre intracelular. La melatonina
pudiera de esta manera estimular la síntesis de novo de calmodulina,
incrementando la captación de calcio e inhibir la fosfodiesterasa
dependiente de calcio. Estas acciones sobre el calcio y su homeostasis,
pudieran tener consecuencias directas sobre la actividad y respuestas de
otros segundos mensajeros (AMPc, GMPc), sobre la fosforilación proteica y
la expresión génica (Huether, 1996) De esta forma, la melatonina se ha
propuesto como un interesante modulador de la señalización mediada por
segundos mensajeros intracelulares.
Conociendo ahora la estructura, las propiedades fisicoquímicas, los
sitios de producción y acción de la melatonina, así como sus sitios de unión,
se procederá a partir de las siguientes páginas, a describir en detalle el
objetivo fundamental de este trabajo, el cual es la caracterización de las
propiedades bioquímicas de la melatonina, que la han llevado a proponer
como molécula antioxidante celular.
III.- MELATONINA COMO ANTIOXIDANTE CELULAR
Aunque bien conocida por sus efectos hormonales, sincronizadora
de ritmos biológicos, inductora del sueño, estimuladora del sistema
inmunológico, entre otras funciones, la melatonina ha sido propuesta como
una molécula que puede funcionar como antioxidante celular. A este
respecto las controversias han surgido y las mismas continúan.
En 1991, tres investigadores rumanos (Ianas, Olnescu y Badescu)
publicaron sus manuscritos en donde señalaban que la hormona melatonina
tenía acciones antioxidantes. Ellos generaban radicales libres usando una
combinación de luminol y H2O2 y usaron quimioluminiscencia como un
índice de la producción de radicales libres derivados del oxígeno. Mediante
este sistema, la melatonina fue reportada que ejercía su efecto removedor de
radicales libres cuando la concentración de melatonina excedía a 0,25 mM.
(Reiter, 1997)
Posteriormente en 1993, (Tan y colaboradores, 1993) aportaron
nuevos datos experimentales acerca del papel de la melatonina como
antioxidante, esta vez usando otro sistema de ensayo. Aquí, radicales
hidroxilo (? OH) fueron generados durante la exposición de H2O2 a luz
ultravioleta a 254 nm, utilizando como asociador de radicales libres el
DMPO (5,5-dimetil-pirrolina-N-óxido); la molécula resultante, ? OH-
DMPO fue identificada mediante HPLC usando detección electroquímica y
espectroscopia de resonancia de spin electrónica. Con este sistema, la
melatonina fue comparada con otros removedores (scavengers) de radicales
libres, tales como glutation (GSH) y manitol. Curvas dosis respuesta
revelaron que la concentración requerida para neutralizar 50% (IC50) de los
radicales libres generados fue de 21 µM para la melatonina, 123 µM para el
GSH y de 283 µM para el manitol. Esto sin duda indicaba que la melatonina
era un removedor de radicales libres, más efectivo que los dos anteriores.
Estudios posteriores de radiólisis por pulsos y métodos químicos
adicionales, demostraron que la melatonina neutralizaba radicales ? OH con
un alto grado de eficiencia. La tasa constante para la remoción de radicales ? OH por melatonina se ha calculado en 2,7 x 1010 M-1. S1
Poeggeler y colaboradores en 1994, demostraron también que la
melatonina, basado en su pérdida de fluorescencia, es rápidamente oxidada
en presencia de ? OH. Los autores utilizaron una solución de H2O2 y FeSO4
para generar ? OH; el hierro en su estado ferroso (Fe++) por su parte, no fue
capaz de oxidar en forma eficiente a la melatonina; tampoco lo fue por el
H2O2. Cuando la riboflavina fue adicionada a la solución de H2O2, el
agregado de melatonina condujo a una rápida oxidación de la misma. Todos
estos resultados tomados en conjunto, permitieron a los investigadores
señalar que, por lo menos in vitro, la melatonina tiene la capacidad de
neutralizar en forma eficiente a oxidantes altamente reactivos mediante la
donación de electrones (Poeggeler, 1994)
Pieri y su equipo de trabajo en el mismo año 94, compararon la
actividad removedora de la melatonina de radicales peróxido (ROO? ) con la
del trolox (una forma hidrosoluble de vitamina E), vitamina C y GSH
(glutatión reducido). Utilizaron ß-ficoeritrina como indicador fluorescente y
el 2-2́ -azo-bis-dihidrocloruro - (2 amidopropano) como iniciador de
radicales ROO? . Encontraron que la melatonina fue más eficiente como
removedor de radicales libres que el trolox, la vitamina C y el GSH
(melatonina>trolox>vitamina C>GSH). En base a tales resultados,
plantearon que la melatonina, dado que era dos veces mejor removedor de
radicales libres que el trolox, podía neutralizar cuatro ROO? por molécula
de melatonina (Pieri, 1994)
En 1995 Scaiano, usó la excitación mediante láser para iniciar el
clivaje de la molécula peróxido de di-ter-butilo en dos radicales ter-butóxilo
(ButO? ); la melatonina una vez más, fue capaz de neutralizar a estos
radicales generando radicales indolil a partir de la hormona. La tasa
constante para la interacción de la melatonina con el radical ter-butóxilo fue
calculado en 3,4 x 107 M-1 S-1 (Scaiano, 1995). En ese momento, dada la alta
reactividad de la melatonina con los radicales libres se apoyó la idea que la
hormona era un “excelente antioxidante in vivo”.
Aún más, en ese mismo año el equipo de Poeggeler investigó las
propiedades antioxidantes de la melatonina comparada de nuevo con el
trolox, la vitamina C y GSH utilizando el agente capturador de radicales
libres 2,2´-azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfúrico (ABTS). Se
evidenció que la melatonina actuaba sinérgisticamente con los antioxidantes
tiólicos y fenólicos en neutralizar el ABTS cuando éste era incubado con
H2O2 y FeSO4. Se comprobó además que, la melatonina actuaba mediante la
donación de electrones y en conjunto con los antioxidantes bloqueantes de
la cadena de acción de los radicales libres, para neutralizar el ABTS. Se
infirió de una vez que in vivo, donde la melatonina coexiste con tales tipos de
antioxidantes naturales, la misma pudiera interactuar cooperativamente en
los mecanismos de defensa antioxidantes celulares (Poeggeler, 1995) y
(Reiter, 1997)
En 1996 Marshall y colaboradores, utilizando ensayos in vitro,
establecieron que la melatonina era una excelente removedora de radicales
triclorometilperóxilo (CCl 3O2? ); encontraron también que aunque la
hormona reaccionaba con el ácido hipocloroso HOCl), lo hacía en forma
lenta. Señalaron además que, la melatonina no removía radicales anión
superóxido (O2? ) en forma directa (Marshall, 1996)
Posterior a estos trabajos, se realizaron muchos otros que postulaban
a la melatonina como poderoso agente antioxidante celular directo e
indirecto, que tenía la propiedad removedora de radicales libres tanto in vitro
como in vivo. A la luz de tales hallazgos, surgieron numerosas críticas (y con
evidencias experimentales) de que, la melatonina no podía ser considerada
como un agente antioxidante celular. Estos investigadores que han refutado
las afirmaciones primeras, han mencionado que casi todas las moléculas
orgánicas, en especial las aromáticas (y la melatonina lo es), reaccionan con
los radicales ? OH, así que está propiedad de la melatonina no “la hacía algo
especial”. Era la naturaleza misma de la hormona.
Respecto a si es más eficiente que las vitaminas E o C como
antioxidante, otro grupo de investigadores re-examinaron las evidencias y
concluyeron con variados grados de aseveración que, la melatonina no
atrapaba directamente radicales peróxilo o alcóxilo y por ende, no es un
antioxidante de la misma clase que la vitamina E. Esta conclusión la
apoyaron en que, su estructura carece de un enlace débil O-H o N-H capaz
de donar átomos de hidrógeno a un radical libre. Otros autores con postura
más radical, han afirmado que la melatonina no es un removedor de
radicales libres, menos pudiera ser considerado un antioxidante celular.
Dadas estas circunstancias controversiales, a la importancia que cobra
cada día la hormona melatonina en sus diversos aspectos funcionales y a
que el autor del presente trabajo ha llevado por varios años, líneas de
investigación en el estudio del campo de los radicales libres y en el papel
funcional de la melatonina como hormona, es que se realizó la presente
investigación, haciendo una exhaustiva revisión de la literatura acerca de los
mecanismos de acción bioquímicos de la melatonina, y con los trabajos
experimentales realizados contribuir con un poco de luz a la solución de la
controversia planteada.
A.-Papel de los radicales libres en el proceso de salud y
enfermedad
Los radicales libres, moléculas altamente reactivas con los diversos
componentes y sustratos celulares, han sido involucrados en un importante
número de patologías que afectan a los seres humanos, entre ellas
afecciones del sistema nervioso (enfermedades de parkinson y de
Alzheimer), trastornos cardiovasculares (cardiopatías isquémicas), aparición
de neoplasias, diabetes mellitus, lesiones dermatológicas, daño a la
estructura del ADN, procesos de isquemia-reperfusión tisular, enfisema
pulmonar y otras afecciones respiratorias, intoxicación por distintas drogas y
tóxicos, lesiones oculares (catarata), en el mismo proceso de envejecimiento
celular, entre tantas afecciones que hoy día aquejan no sólo al hombre, sino
a numerosos animales de la escala evolutiva (Tiskow, 1996) y (de Zwart,
1999)
El organismo cuenta con un importante grupo de sustancias que se
han denominado antioxidantes celulares, que nos protegen de la acción
nociva de los radicales libres. Estos antioxidantes pueden ser clasificados en
enzimáticos (caso de la superóxido dismutasa, la catalasa o la glutation
peroxidasa) o no enzimáticos (como las vitaminas C y E, el glutatión
reducido, entre otros) y los mismos ejercen su acción neutralizando o
removiendo estos radicales generados a partir de moléculas de oxígeno, la
misma de la cual depende toda la vida aerobia en el planeta.
Dado que no es el objetivo principal de este trabajo entrar en la
descripción detallada del mecanismo de acción de los radicales libres, se
refiere al distinguido lector al Anexo No. 1 donde encontrará en detalle la
bioquímica de estos compuestos y la acción de las sustancias antioxidantes,
así como la descripción del proceso de peroxidación lipídica, uno de los
principales mecanismos de daño que sufre la célula al ser atacada por las
especies radicales derivadas del oxígeno molecular.
B.- ¿Por qué la melatonina como antioxidante celular?
Según la deducción de varios investigadores y con las evidencias
experimentales correspondientes, la melatonina ya existía en los antiguos
organismos dinoflagelados (Gonyaulax polyedra) y en al menos dos especies
de bacterias. G. polyedra evolucionó hace unos 2,5 millones de años atrás,
cuando existían elevadas concentraciones de oxígeno en la atmósfera
terrestre. Es posible que la melatonina en estos organismos inferiores, haya
aparecido y evolucionado como un agente protector contra el daño causado
por el oxígeno y los radicales libres derivados, y que las funciones
adicionales como hormona hayan surgido a lo largo de la evolución de las
especies. En bacterias y dinoflagelados, los niveles de melatonina son
elevados en la noche y bajos en el día; ahora, si la melatonina evolucionó
como un agente antioxidante el hecho de por qué la producción de esta
indolamina es mayor en la noche, requiere de profundas investigaciones.
Hay que recordar que los niveles de producción de radicales libres son
mayores en el día, debido a la presencia de la luz solar y los rayos
ultravioleta, el estrés, la actividad en general y el mismo metabolismo
bioquímico. Esta regla tampoco se aplica a animales de actividad nocturna
como las ratas (Poeggeler, 1991), (Manchester, 1995), (Tilden, 1997) y
(Reiter, 1997)
Un hecho importante de la acción de la melatonina como agente
neutralizador o removedor de radicales libres es que, no requiere de la
presencia de un receptor. Esta acción implica una función muy especial de
la hormona en cada célula y tejido del organismo, puesto que este indol
tiene una gran permeabilidad a través de las membranas celulares debido a
su alta liposolubilidad.
Se pueden derivar de los estudios analizados que las propiedades
antioxidantes de la melatonina tiene 2 implicaciones:
a) La melatonina es capaz de proteger a las células del estrés oxidativo
causado por los radicales libres. Hay suficientes evidencias para confirmarlo.
Es cinco veces más potente que el mismo glutatión, pero in vivo, la
melatonina es mucho menos abundante en las células y tejidos que los otros
antioxidantes naturales conocidos (vitamina E o C).
b) Si la melatonina actúa como removedor de radicales libres in vivo, en cada
célula del cuerpo, debería esperarse que la hormona al mismo tiempo
interfiera con todos los mecanismos o procesos que conducen a la
generación de los radicales libres, esto es, síntesis de prostaglandinas,
formación de radicales a partir del óxido nítrico, en la cadena respiratoria
mitocondrial, entre otros.
Y he aquí, la primera gran controversia surgida. ¿Puede la
melatonina a las concentraciones fisiológicas existentes en el
organismo, ser relevante en términos de su capacidad antioxidante, o
sólo los niveles farmacológicos empleados hasta ahora en los ensayos
experimentales, ofrecer un grado de protección eficiente contra la
acción de los radicales libres?
Algunos autores que apoyan la hipótesis que la melatonina si se
comporta como un antioxidante celular, postulan que la misma pudiera
actuar mediante un sistema o mecanismo de amplificación, tales como la
estimulación por la melatonina de la expresión aumentada de otros sistemas
antioxidantes, o que la melatonina actúe como una especie de “gatillo” para
la inducción de un amplio complejo de sistemas de defensa celulares contra
la acción de los radicales libres (Huether, 1996) y (Reiter, 2001)
Un grupo de investigadores se apoyan en el hecho que la melatonina
está presente en concentraciones muy importantes a nivel intestinal; en
estos órganos se produce en las células enterocromafines y luego liberada al
lumen intestinal, y en forma especial cuando su síntesis está aumentada (por
un aumento de su precursor el triptófano) también es liberada a la
circulación portal y luego penetra la circulación general. No está muy clara
aún la presencia de estas grandes cantidades de melatonina en el intestino,
pero se ha propuesto que debe jugar un rol crucial como antioxidante
endógeno, protegiendo a los intestinos contra la acción de los radicales
libres, caso de intoxicaciones, procesos inflamatorios locales o irritaciones
locales (Huether, 1992) y (Huether, 1993)
Otros hallazgos experimentales han apoyado la hipótesis propuesta
de la acción de la melatonina como antioxidante celular, justamente por su
acción en patologías donde está bien definida la acción de los radicales
libres. En ratas, el daño hepático inducido por el carcinógeno safrol, se
reduce con la administración de melatonina (Tan, 1993). Un efecto similar
ha sido observado en linfocitos humanos sometidos a la acción de radiación
ionizante in vitro (Vijayalaxmi, 1995). La melatonina se ha descrito, reduce la
incidencia de cataratas formadas en ratas recién nacidas después de la
administración de drogas que agotan el glutatión celular, y atenúa el nivel de
peroxidación lipídica en ratas tratadas con el herbicida paraquat (Huether,
1996). Asimismo, el grado de estrés oxidativo después de la administración
de lipopolisacárido bacterial, una potente endotoxina que causa extenso
daño tisular, se ve atenuado por el suministro exógeno de melatonina
(Sewerynek, 1996)
Sin dudas, la propuesta acción antioxidativa de la melatonina merece
una discusión a fondo, con un basamento científico contundente que
permita esclarecer la controversial situación. Para comprender mejor el
razonamiento que apoyan las evidencias a favor y en contra de que la
melatonina es un antioxidante celular, hay que abrir un espacio para
presentar una explicación acerca de las características y acciones de un
antioxidante celular.
La oxidación de cualquier compuesto orgánico por el oxígeno
molecular (peroxidación lipídica si es un lípido la molécula atacada)
comienza por una reacción de iniciación donde se forma un compuesto
radical libre, altamente reactivo, con un electrón desapareado en su orbital
más externo, luego de lo cual esta reacción puede propagarse formando
otras especies radicales o finalizar gracias a la acción o la presencia de un
antioxidante (Halliwell – Gutteridge, 1990) y (Antunes, 1999). Para detalles
referirse al Anexo 1, donde encontrará una descripción detallada del
mecanismo de la peroxidación lipídica.
Los antioxidantes retardan o neutralizan la acción de los radicales
libres. Se han dividido a los antioxidantes, en base a su mecanismo
bioquímico de acción, en dos grandes grupos según (Ingold, 1968):
a) Antioxidantes Preventivos, que reducen la tasa de iniciación de las
reacciones por radicales libres. De este tipo hay varias subclases de
antioxidantes, según su mecanismo de acción.
a.1) Descomponedores de peróxidos, que estequiométrica o
catalíticamente descomponen moléculas de hidroperóxidos a productos no
radicales, previniendo así la formación de nuevas fuentes de generación de
radicales libres que inicien nuevas reacciones
a.2) Desactivadores de iones metálicos, los cuales actúan quelando un
electrón de metales redox-reactivos (caso del hierro y el cobre), retardando
la capacidad del metal de catalizar la formación de moléculas de
hidroperóxidos.
b) Antioxidantes interruptores de la cadena de reacción, que pueden
capturar una de las moléculas de la cadena portadora de los radicales para
producir productos que no propagarán la reacción o si la continúan lo
hagan con baja eficiencia. Estos deben su actividad generalmente a su
capacidad de reducir radicales peróxilo a compuestos más estables. Los más
efectivos de este grupo son los compuestos fenólicos y las diarilaminas, en
particular aquellos con enlaces O-H y N-H relativamente débiles:
ROO? + ArOH ROOH + ArO?
ROO? + Ar2NH ROOH + Ar2N?
Antunes en su trabajo de investigación enfatiza que, muchos
antioxidantes interruptores de la cadena de reacción deben esta propiedad a
su capacidad de atrapar los radicales alquil-peróxilos, que son muy poco
reactivos. El hecho que algún compuesto en particular reaccione con
radicales libres muy reactivos como el ? OH (hidróxilo), RO? (alcóxilo) o
Cl3COO? (triclorometilperóxilo), no significa que la molécula sea un
antioxidante del tipo que interrumpa la cadena de reacción (Antunes, 1999).
La mayoría de moléculas orgánicas reaccionan muy rápidamente con el
radical ? OH y casi también de forma rápida con los radicales RO? y
Cl3COO? . La característica esencial de un antioxidante que interrumpe la
cadena de reacción es que, debe donar su átomo lábil de hidrógeno a los
radicales alcoxi-peróxilos, mucho más rápido (= 100) de lo que el ROO?
puede reaccionar con sus sustratos orgánicos, y que el radical formado no
sea capaz de continuar la reacción de auto-oxidación.
¿Qué otras características se pueden agregar a las ya descritas para postular que
una molécula sea un antioxidante relevante in vivo?
Las pruebas que se han efectuado para examinar la posibilidad de que
un compuesto dado actúe como antioxidante in vivo en forma directa,
pueden claramente demostrar que una acción de este tipo sea improbable.
En forma alternativa, pudiera demostrar que una acción antioxidante sea
factible en base a que el compuesto muestre una acción protectora a
concentraciones fisiológicas, es decir, en el rango presente in vivo.
¿Cómo se puede probar entonces que un compuesto en
particular actúa como un antioxidante in vivo?
Las evidencias que se tienen hasta el presente apoyan el papel
antioxidante de un compuesto in vivo, siempre que satisfaga estos 2
planteamientos:
a) ¿Es el compuesto depletado o agotado bajo condiciones de estrés
oxidativo? Esto pudiera no suceder. La vitamina E y ciertos flavonoides
pueden ser reciclados por la presencia de ácido ascórbico.
b) Si un antioxidante remueve radicales libres, ¿es el antioxidante degradado
a productos cuya concentración puede ser medida y demuestra así, un
aumento bajo condiciones de estrés oxidativo?
Otros dos puntos, con frecuencia olvidados, deben ser tomados
siempre en cuenta a la hora de valorar o catalogar la actividad antioxidante
de una molécula dada:
.-Una sustancia debería ser verificada experimentalmente siempre en las concentraciones a
la que se haya disponible in vivo.
.-Al ensayar moléculas antioxidantes en particular, se deberían utilizar radicales libres
biológicamente relevantes.
Como corolario a los planteamientos efectuados, 4 preguntas son
fundamentales de responder cuando se evalúa una sustancia como
antioxidante celular:
1.- ¿Sobre qué sustancia actúa para ejercer su papel protector antioxidante?
¿El antioxidante alcanza ese blanco in vivo?
2.- ¿Cómo protege? Acaso, remueve radicales libres, previene su formación
o actúa reparando el daño causado.
3.- Si el antioxidante propuesto actúa en la remoción de radicales libres,
¿pueden los productos derivados del antioxidante por sí mismo, causar daño
celular?
4.- ¿Puede el antioxidante causar daño en otros sistemas biológicos? Se
deben plantear siempre estudios toxicológicos.
C.- ¿Qué características bioquímicas de la melatonina han
permitido postular a esta molécula como antioxidante celular?
Los hallazgos hasta ahora presentados sugieren que la hormona
remueve y detoxifica selectivamente oxidantes altamente reactivos por lo
menos in vitro, donando un electrón a estos compuestos electrofílicos. El
radical catión indolil formado a partir de la reacción de transferencia de un
electrón y oxidación parcial de la indolamina, es entonces rápidamente
convertida a kinuramina en presencia del radical anión superóxido.
Como se aprecia, los estudios han sido efectuados la gran mayoría de
ellos in vitro, lo que a juicio de muchos autores no hace de la melatonina una
candidata ideal para ser postulada como antioxidante celular.
Una ventaja de la melatonina sobre otros compuestos antioxidantes
como la vitamina C, es que la misma tiene la capacidad de atravesar las
membranas celulares con mucha facilidad (liposuble) y muestra además,
cierta solubilidad acuosa, propiedad que no posee la vitamina E. Siendo una
molécula anfifílica, la melatonina puede proteger contra el daño inducido
por radicales libres, limitando los mismos a nivel de membrana celular,
proteínas citosólicas y el propio ADN nuclear. Otro punto de interés que se
ha descrito con la melatonina, es que ella puede ser reciclada tanto por el
ácido ascórbico como por el ácido úrico. Esto refuerza una de las
interrogantes arriba planteadas: su eficiencia (Reiter, 2000) y (Reiter, 2001)
Ya se ha mencionado en varias oportunidades que, la melatonina tiene
la capacidad de remover radicales libres del tipo ? OH con un alto grado de
eficiencia. También se ha evidenciado que es capaz de neutralizar una
variedad de compuestos intermediarios derivados de los radicales,
reduciendo así la destrucción macromolecular. La melatonina puede
neutralizar moléculas de H2O2, de oxígeno singlete (1O2), de óxido nítrico
(NO? ), aniones peroxinitritos (ONOO? ) y sus metabolitos.
Adicionalmente, se ha identificado que la melatonina actúa en forma
sinérgica con otros antioxidantes en la destoxificación de radicales libres.
Esto apoya la idea que la hormona pudiera actuar como un removedor
directo e indirecto de radicales libres (Yi-Zang, 1998) y (Reiter, 2000)
En 1998 se identificó un producto intermediario de la interacción de
la melatonina con dos radicales hidrófilos: la 3-OH-melatonina cíclica. La
misma puede ser detectada en orina y su concentración varía
circadianamente y con el status oxidativo del organismo. Se ha considerado
así que, la 3-OH-melatonina (3-OHM) en orina puede ser considerado
como un biomarcador de la generación de radicales .OH in vivo, y pudiera
ser un indicador clínico útil del status oxidante de un individuo en
presencia de enfermedades relacionadas con la producción de radicales
libres (Tan, 1998)
Otra evidencia general a favor de la melatonina es que, por lo menos a
dosis farmacológicas empleadas en los ensayos, la hormona tiene la
capacidad de incrementar los niveles de ARNm o las actividades de las
principales enzimas antioxidantes (superóxido dismutasa, catalasa, glutatión
peroxidasa). Otros datos apoyan el hecho que, el incremento nocturno de la
hormona está correlacionado con un aumento en los niveles de enzimas
antioxidativas. La importancia relativa de estas acciones indirectas de la
melatonina están sujetas hoy día a intensa investigación (Reiter, 2000)
D.- Acciones protectoras de la melatonina en su papel de
antioxidante a nivel de órganos y tejidos corporales.
1.- Sistema nervioso central. Este sistema en particular es muy
susceptible a daño tisular por una variedad amplia de agentes biológicos.
Este hecho se complica aún más debido a que las neuronas no regeneran o
tienen poca capacidad de hacerlo in vivo, conduciendo a lo largo de la vida a
una significativa pérdida en el número de las mismas. Esta reducción en el
número neuronal y en las interconexiones sinápticas, eventualmente
compromete el funcionamiento integral del sistema nervioso.
De todos los órganos y sistemas, éste es uno de los más susceptibles
al ataque causado por los radicales libres; las razones para ello son diversas.
El cerebro, aunque constituye sólo un 2% del peso corporal total en el
humano, consume una gran cantidad de oxígeno inhalado (un 20%). Dado
que los subproductos derivados del oxígeno son tóxicos, no es
sorprendente que el tejido neural pueda ser dañado a una relativa mayor tasa
que otros órganos. El cerebro también posee regiones con altas
concentraciones de hierro y vitamina C, además de importantes cantidades
de ácidos grasos poli-insaturados que son proclives a la peroxidación.
(Halliwell – Guterridge, 1990) Considerando lo anterior, se debería esperar
que el cerebro contase con un complemento adicional de antioxidantes;
pero este no parece ser el caso, y más bien tiene una baja capacidad para
resistir agresiones oxidativas.
Un hecho interesante es que se ha descrito poca o ninguna
reactividad directa de la melatonina con el H2O2. Las dos enzimas
implicadas en la remoción de H2O2 son la catalasa y la glutatión peroxidasa.
La actividad catalasa dentro del cerebro se considera tiene mínima influencia
como mecanismo antioxidante a causa de su baja actividad tisular. La
glutatión peroxidasa, la cual requiere de selenio como cofactor, juega un rol
antioxidante muy importante a causa de que remueve moléculas de H2O2
cuando oxida glutatión reducido (GSH) a su forma GSSG (Reiter, 1998).
Las pruebas son claras en el sentido que la actividad de la glutatión
peroxidasa es estimulada por la melatonina administrada exógenamente, no
sólo en cerebro sino en otros órganos. La actividad glutatión reductasa
también es estimulada por melatonina, lo que permite regenerar GSH. De
igual forma, la enzima glucosa 6-fosfato dehidrogenasa se ve estimulada por
la acción de la melatonina. De esta forma, la hormona estimula la actividad
de tres enzimas que intervienen en la remoción de H2O2 de las células
convirtiendo la molécula en productos menos tóxicos, protegiendo las
células neuronales del daño oxidativo (Reiter, 1998) y (Reiter, 2001)
La melatonina también es efectiva en reducir los niveles de
peroxidación lipídica cerebral. Un agente que con frecuencia se ha utilizado
para inducir la peroxidación de ácidos grasos poli-insaturados en cerebro, es
el kainato (ácido kainico). Esta sustancia es un análogo no degradable del
aminoácido excitatorio glutamato, muy tóxico a ciertas estructuras neurales,
tales como hipocampo y corteza frontal. Estudios recientes han
puntualizado que la melatonina reduce el daño inducido por el kainato en el
ADN de células piramidales del hipocampo. Igual efecto se observa cuando
homogenizados de rebanadas de corteza cerebral son incubadas con
kainato; en este caso, los niveles de malondialdehído y 4-hidroxialquenales
(4-HDA), productos de la lipo-peroxidación, se incrementaron
drásticamente, pero en presencia de melatonina (0,1 a 4 mM), y de manera
dosis-dependiente, se redujeron los niveles de estos subproductos en
regiones como corteza cerebral, hipocampo, cuerpo estriado (Reiter, 1997)
El estudio más complejo realizado acerca del uso potencial de la
melatonina como antioxidante en la Enfermedad de Parkinson, proviene de
Miller y colaboradores. La pérdida de neuronas dopaminérgicas
nigroestriadas que ocurre en esta patología, envuelve la acción de los
radicales libres citotóxicos, derivados de la auto-oxidación de la dopamina,
como la dopamina-3,4-dihidro-fenetilamina. Utilizando la capacidad de
absorbancia de radicales libres derivados del oxígeno, Miller halló que la
melatonina contrarresta el incremento en la oxidación de la proteína
fluorescente ß-ficoeritrina, inducida por la acción de la dopamina o su
precursor L-Dopa (3,4-hidroxifenilalanina). La disminución de la oxidación
de la ß-ficoeritrina fue tomada como evidencia clara que la melatonina es
capaz de remover radicales libres generados durante la auto-oxidación de la
dopamina, y que la hormona puede ser un agente protector contra la
degeneración celular dopaminérgica (Miller, 1996)
La retina ocular de vertebrados posee una alta tasa de consumo de
oxígeno, unas 7 veces más que cualquier otro tejido. Este elevado consumo
y el alto número de mitocondrias presentes en las células retinianas, pueden
conducir en un momento dado a la producción de cantidades importantes
de radicales libres; además, las membranas celulares de fotorreceptores,
células fundamentales de la retina, son ricas en ácidos grasos poli-
insaturados y la exposición de este tejido a la luz comúnmente conduce a su
foto-oxidación. Estas características de la retina la hacen muy vulnerable al
daño por auto-oxidación. Aunque la retina posee mecanismos de defensa
antioxidantes en cantidades importantes, en relación a otros tejidos,
cualquier desbalance de éstos puede, y de hecho ocurre con el
envejecimiento, afectar severamente al tejido y causar lesiones a veces
irreversibles. Hay que recordar también que la retina es otro de los tejidos
que produce cantidades importantes de melatonina. Cuando se utilizaron
homogenizados de retina de ratas albinas, las cuales se incubaron a 37°C, un
aumento progresivo en las concentraciones de MDA y 4-HDA fue
observado. Al adicionar melatonina a la mezcla de reacción (0,1 a 2 mM), el
aumento en los niveles de peróxidos lipídicos fue significativamente
disminuido en una forma dependiente de la concentración de la hormona.
Los autores propusieron que la melatonina actuaba removiendo radicales
libres o regenerando biomoléculas deficientes en electrones, donándoles un
electrón a los mismos (Dun-Chen, 1995)
Por otro lado, en ratas recién nacidas tratadas con 1-Butionina-S-R-
Sulfoximina (BSO), un inhibidor de la producción de glutatión, el
suministro de melatonina previno la formación de cataratas oculares,
demostrándose que la melatonina tiene la capacidad de reducir el daño por
estrés oxidativo protegiendo no sólo a los lípidos, sino también a las
proteínas (Dun-Chen, 1995)
2.-Sistema gastrointestinal. En vesícula biliar, la melatonina
funciona como inhibidor en la producción de cálculos biliares, proceso que
inclusive se piensa es mediado por radicales libres (Shiesh, 2000). Otros
interesantes estudios han demostrado los efectos protectores de la
melatonina sobre la toxicidad oxidativa sobre el hígado. Hay experimentos
muy claros que involucran a los radicales libres en el daño que se produce al
tejido hepático en situaciones de isquemia-reperfusión. Este tipo de lesión
se ve disminuido cuando el tejido es previamente perfundido con
melatonina (Sewrynek, 1996). En un modelo experimental utilizando ratas, a
las cuales se les indujo isquemia por 40 minutos, seguido de 60 minutos de
reperfusión, marcados cambios oxidativos fueron observados en el tejido,
incluyendo niveles elevados de malondialdehído (MDA) y 4-HDA,
incrementada infiltración de leucocitos, disminución de los niveles de
glutatión reducido y aumentados de glutatión oxidado, con disminución de
la actividad de la enzima glutatión reductasa. Para cada uno de los
parámetros señalados, los cambios fueron contrarrestados
significativamente por la inyección de melatonina (10 mg/kg. peso), unos 15
minutos previos a la isquemia, y otra dosis al momento de reperfundir el
tejido (Sewrynek, 1996)
A nivel de intestino grueso, al inducir colitis en ratones por el
suministro de sulfato de sodio-dextrano (SSD) disuelta en el agua de beber,
la inyección diaria de melatonina redujo la severidad de las lesiones
inflamatorias del colon, evaluada por la presencia de diarrea, sangre oculta
en heces y lesiones de la mucosa intestinal. El SSD induce el sobre-
crecimiento de Escherichia coli en intestino, lo cual produce el
lipopolisacárido bacteriano, la endotoxina causante de las lesiones (Pentney,
1995). Otros ensayos han demostrado que la melatonina estimula la
actividad de la enzima glucosa 6-fosfato-dehidrogenasa hepática en ratones,
incrementando la biodisponibilidad de NADPH y la conversión de GSSG a
GSH mediante la glutatión reductasa (Pierrefiche, 1995)
En el aparte anterior, ya se describió que el intestino delgado
produce concentraciones importantes de melatonina, lo cual ha sido
indicativo de la probable acción antioxidante de esta hormona a ese nivel.
Otros estudios han demostrado que la melatonina minimiza los
efectos diabéticos causados por aloxano a nivel de páncreas endocrino. Al
compararla con el conocido antioxidante hidroxitolueno butilado (BHT), se
evidenció que éste tenía mayor propiedad antioxidante que la melatonina.
Es posible en este caso, que la hormona combine una actividad antioxidante
intrínseca in vivo con aquella de su metabolito hepático, la 6-OH-melatonina.
Esto último basado en la hipótesis de que la vida media corta de la
melatonina en el organismo, después de su administración intraperitoneal
(20 a 30 minutos), se corresponde al período de latencia observado entre la
inyección de la hormona y la de aloxano (Pierrefiche, 1993)
3.-Piel. En trabajos recientes utilizando un test para verificar la
capacidad de la melatonina para modificar la respuesta eritematosa de la piel
humana expuesta a exposición a luz ultravioleta (UV), Bangha y su equipo
reportaron una reducción en el grado de enrojecimiento (estimado por
cromometría e inspección visual) en aquellos sujetos quienes utilizaron
melatonina aplicada tópicamente en un gel no coloidal. Las concentraciones
utilizadas de melatonina fueron de 0.05, 0.1 y 0.5 %. Los autores proponen
una acción removedora de radicales libres generados por acción de la luz
UV a nivel de piel (Bangha, 1996)
4.- Otras acciones antioxidantes a nivel celular.
Relativamente se tienen pocos datos acerca de la acción protectora de
la melatonina a proteínas celulares, las cuales son susceptibles de daño
oxidativo. Experimentos efectuados tanto in vivo como in vitro , han
demostrado que las proteínas son protegidas de la acción de los radicales
libres cuando en el ensayo se encuentra presente la melatonina. Esto es
compatible con la noción que la hormona también previene la disminución
en las actividades de enzimas antioxidativas en los casos de estrés oxidativo
(Reiter, 2000)
Autores como (Tan, 1993) reportan protección al ADN nuclear por
parte de la melatonina, cuando se administra a los animales experimentales
carcinógenos tipo safrol. La fragmentación del ADN inducida con lipo-
polisacárido bacterial (LPS), se reduce al ser suministrada la melatonina en
dosis farmacológicas, indicado por el recuento de células sanguíneas
periféricas y médula ósea.
Se ha descrito que el daño oxidativo a alguna base en el ADN nuclear
es usualmente transferido a la guanina, puesto que su potencial de oxidación
es relativamente bajo en relación a las otras bases del ADN. La melatonina
es capaz de reparar el radical guanosina formado (G? ), presumiblemente vía
de la transferencia de un electrón y con un alto grado de eficiencia. Se ha
propuesto que la melatonina actuaría como molécula reparadora del ADN
en horas nocturnas, cuando sus niveles son más altos, y cuando las
concentraciones nucleares de la hormona son mayores referentes a los
niveles hallados en sangre u otros compartimientos subcelulares (Prior,
1995) y (Reiter, 2000)
Otros estudios muy interesantes, han mostrado que la adición de
FeCl3, ADP y NaDPH decrecen la fluidez de la membrana microsomal en
hígado de ratas, cuantificado por el índice de polarización y de anisotropía, e
incremento en los niveles de MDA y 4-HDA. Existe una relación inversa
entre fluidez de membrana y los parámetros de polarización y anisotropía.
La pre-incubación de microsomas hepáticos con melatonina a la
concentración de 300 µM o superior, incrementó significativamente la
fluidez de esta membrana subcelular y redujo los niveles de MDA y 4-HDA
en comparación a las muestras que no contenían la hormona pineal. A
concentraciones de 3 mM de melatonina se previno por completo la rigidez
de la membrana. De esta manera, la melatonina se ha postulado ejerce un
efecto estabilizante sobre la membrana celular (Poeggeler, 1994)
Otras investigaciones utilizando tamoxifeno, una droga
antiestrogénica utilizada en el tratamiento del cáncer de mama, en
combinación con la melatonina (150-200 µM), fueron capaces de reducir los
niveles de peroxidación lipídica y la rigidez de la membrana celular inducida
por especies radicales libres, en microsomas hepáticos de ratas Sprague-
Dawley. El modo se acción que se propuso para la melatonina es que,
aumentaría la actividad o respuesta del tamoxifeno, previniendo la rigidez de
la membrana. Hecho importante que se comprobó también es que, cuando
microsomas hepáticos fueron pre-incubados con la melatonina en ausencia
de agentes inductores de estrés oxidativo, aún a elevadas concentraciones de
la hormona, no alteró la fluidez de la membrana en forma significativa. El
tamoxifeno se ha reportado, causa disminución en la fluidez en liposomas,
presumiblemente duplicando el efecto rigidificante del colesterol. Esto
también apoya la idea que, la adición de la hormona a la solución con
tamoxifeno retornó la fluidez de la membrana a los niveles basales, quizás
los óptimos para este tipo de membrana (García, 1997) y (García, 1998)
Con las evidencias presentadas, los investigadores que han
propuesto que la melatonina puede actuar como un agente
antioxidante celular, y los que critican tal punto de vista, se apoyan
sobre la base que:
.-La melatonina es más un antioxidante de tipo preventivo, de la subclase
desactivadora de metales iónicos. Por lo menos, los datos experimentales in vitro
apuntan a que es cierto lo anterior para sistemas homogéneos y dispersiones
lipídicas-acuosas heterogéneas. Es probable que la melatonina forme un
enlace coordinado simple con el ion metálico; este enlace lo haría con el
átomo de hidrógeno del anillo nitrogenado de la melatonina. Por ello,
algunos autores la han considerado un antioxidante de menor potencia que
del tipo preventivo, queladores de metales iónicos (Antunes, 1999)
.-Se ha reportado también que la melatonina pudiera actuar en forma sinergística
con otros compuestos atrapadores de radicales libres, tales como la vitamina C,
vitamina E y glutatión en un sistema que tenga un alto contenido de H2O2 y
Fe+2. Los antioxidantes que funcionan por el mismo mecanismo de
remoción de radicales libres, tienen un efecto aditivo simple cuando son
usados en conjunto en un sistema determinado. Una verdadera acción
sinérgica entre dos antioxidantes requeriría que ellos funcionen por distintos
mecanismos, lo cual explicaría que la melatonina no clasifique como
atrapador de radicales libres en este sistema. Se propone más bien que se
comporte como un retardador de los sistemas de auto-oxidación en
presencia de iones metálicos.
.-Otros autores han propuesto que es improbable que esta supuesta
acción retardadora de los sistemas de auto-oxidación, envuelva la
transferencia de electrones desde la melatonina a los radicales peróxilo a
causa de que el proceso de retardación fue observado, no sólo en
dispersiones acuosas de lípidos (donde es favorecido el proceso), sino
también en soluciones homogéneas (donde es más bien desfavorecido)
(Antunes, 1999)
.-Es la opinión de la mayoría de investigadores que propugnan que la
melatonina no puede ser considerada un antioxidante celular que, las
concentraciones de melatonina utilizadas en todos los estudios sobre
propiedades antioxidantes son farmacológicas, mucho más elevadas que las
halladas en el plasma sanguíneo y cualquier otro tejido (Maestroni, 1996) y
(Antunes, 1999)
.-Estudios bioquímicos realizados con los precursores de la
melatonina, esto es, triptófano y serotonina, así como un número
importante de sus derivados oxidativos, han establecido que poseen una
importante actividad antioxidativa, algunos más que la propia melatonina.
Esta actividad esta basada en la estructura indólica de las moléculas, las
cuales también atrapan radicales libres, dando lugar a estructuras con
resonancia estabilizada sobre el anillo pirrólico y no ocasionando éstos,
efectos dañinos a nivel celular. Concluyen los autores que la melatonina no
pareciera ser un antioxidante de relevancia en comparación con la actividad
mayor que presenta su precursor indólico la serotonina, o el principal
metabolito hepático la 6-OH-melatonina, cuyas estructuras difieren de la
hormona por sólo un grupo hidróxilo en la posición seis. La 6-OH-
melatonina puede transferir con mayor facilidad el hidrógeno fenóxilo de su
estructura. Otros autores exponen el hecho que el grupo hidróxilo fenólico
estaría intra-molecularmente ligado al grupo 5-metoxi, y los fenoles con
tales enlaces de hidrógeno tienen aumentadas las entalpías de disociación del
enlace O-H y así, reducidas las reactividades hacia los compuestos radicales
libres. Es de interés señalar que, aquellas estructuras que poseen grupos
hidróxilos en su conformación química, incrementan su propiedad
antioxidante en forma significativa, mientras la deshidrogenación produce el
efecto opuesto (Pierrefiche, 1993) y (Fowler, 2003)
.-Se ha mencionado que la melatonina no posee dentro de su
estructura, un enlace débil O-H o N-H capaz de donar un átomo de
hidrógeno a un radical lipídico tipo peróxilo.
.-Muchos autores objetan que la melatonina pueda ser una molécula
removedora o atrapadora de radicales libres, pero la química brinda
sorpresas todos los días y la melatonina pudiera ser considerada
próximamente como un nuevo tipo de antioxidante, no clasificado dentro
de los esquemas bioquímicos actuales.
Con la intención de contribuir al esclarecimiento de las controversias
surgidas respecto al papel antioxidante de la melatonina, el autor del
presente trabajo ha querido exponer en el mismo, resultados experimentales
que ha obtenido a lo largo de varios meses de estudio acerca del papel de la
melatonina como posible agente protector contra la acción de los radicales
libres generados en condiciones patológicas o experimentales.
En primer lugar, se presentarán los resultados obtenidos en una serie
de ensayos realizados en el Decanato de Medicina de la Universidad
Centroccidental “Lisandro Alvarado” de Barquisimeto a principios del año
2004, estudiando el posible papel protector de la melatonina contra la
acción de radicales libres generados en la diabetes mellitus. Posteriormente,
se expondrán los resultados obtenidos en una serie de experimentos
realizados en el Laboratorio de Bioenergética Celular del Instituto
Venezolano de Investigaciones Científicas en Altos de Pipe, a finales del
año 2004 utilizando como modelo biológico glóbulos rojos irradiados con
luz ultravioleta, en los cuales se valoró el efecto protector de la melatonina.
E.- Evaluación del estrés oxidativo en ratas con diabetes
mellitus tipo I inducida por estreptozotocina: posible papel protector
de la melatonina ♦
Reportes efectuados por la Organización Mundial de la Salud (OMS)
en 1999, han establecido que la diabetes mellitus es una de las enfermedades
metabólicas crónicas de mayor tendencia de aparición de nuevos casos
clínicos en los seres humanos, con una prevalencia actual de 5 a 10% entre
la población mundial, y a juicio de un grupo notable de investigadores
proponen que en la misma, los radicales libres derivados del oxígeno juegan
un papel crucial como subproductos nocivos a los tejidos afectados. Dada la
importancia de lo señalado anteriormente, se propuso como objetivo central
el analizar el papel que juegan estas moléculas como agentes inductores del
estrés oxidativo evaluando además, el posible papel protector que pudiera
jugar la hormona melatonina como agente antioxidante. Los objetivos
específicos planteados fueron los siguientes:
.-Evaluación de algunos parámetros fisiológicos como peso corporal y
volumen excretado de orina en 24 horas en ratas con diabetes mellitus tipo I
.-Evaluación de los niveles de glicemia en ratas con diabetes mellitus tipo I.
.-Determinación de niveles de peroxidación lipídica en rebanadas de corteza
de riñones de rata con diabetes mellitus tipo I.
♦ Trabajo experimental desarrollado por el autor en la Unidad de Investigación en Fisiología. Decanato de Medicina de la UCLA. Barquisimeto. 2004
.-Identificación del posible efecto protector de la melatonina como agente
antioxidante en este tipo de afección.
En la diabetes mellitus, la hiperglicemia constituye la principal
manifestación de enfermedad y está implicada en la aparición de las diversas
complicaciones que se presentan asociadas con la misma, entre ellas, un
grupo heterogéneo de disfunciones clínicas que afectan el sistema nervioso,
el sistema cardiovascular, el riñón, la retina, el cristalino del ojo y la propia
piel. Los seres humanos diabéticos tienen 25 veces mayor probabilidad de
contraer ceguera, 20 veces más riesgo de amputaciones y de 6 a 10 veces
más riesgo de padecer enfermedades de las arterias coronarias que los
sujetos sanos. Esta situación de desequilibrio comienza en una etapa
temprana de la enfermedad, tal como se ha demostrado en varios estudios.
Estos desequilibrios por lo general comienzan con trastornos bioquímicos a
nivel celular.
En los recientes estudios de las causas implicadas en la aparición de la
diabetes mellitus y la aparición de sus complicaciones, se ha demostrado que
altos valores de glucosa en sangre conducen a la aparición del estrés
oxidativo. Las teorías que vinculan el estrés oxidativo con la diabetes
mellitus plantean que la hiperglicemia per se es esencial en el desarrollo de
las complicaciones derivadas de esta enfermedad. Una de tales teorías se
fundamenta en el hecho de que la glucosa en solución acuosa es capaz de
autooxidarse a ciertos compuestos llamados enedioles, en presencia de
metales de transición como el hierro (Fe+3) reduciéndolo a (Fe+2), a través
de la denominada Reacción de Fenton, y descompone el peróxido de
hidrógeno (H2O2) generando el radical libre inestable hidróxilo (OH? ), que
posee alto poder oxidante (Clapes, 2001), (Nuñez, 2001) y (Kiersztan, 2004)
Por otro lado, los productos finales de la glicosilación de proteínas
(PFG) también generan radicales libres de oxígeno y éstos, con su elevado
poder oxidante afectan las membranas celulares y lipoproteínas circulantes,
las cuales contienen productos de peroxidación altamente dañinos a las
células. Estos productos de la glicosilación de proteínas aumentan el estrés
oxidativo, afectando funciones biológicas de suma importancia, necesarias
para mantener la integridad de los tejidos vascular, nervioso, renal, entre
otros (Nuñe, 2001). El estrés oxidativo pudiera ser una vía común que
relacione los mecanismos fisiopatológicos en apariencia diversos, pero que
convergen en la explicación del papel que desempeña el incremento en los
radicales libres y los productos de la peroxidación lipídica en la explicación
de la fisiopatología de la diabetes mellitus y sus complicaciones.
Para el desarrollo de la investigación se seleccionaron por azar simple,
un total de 24 ratas adultas blancas, hembras, de la cepa Sprague-Dawley,
suministradas por el Bioterio Central de la Universidad Centroccidental
“Lisandro Alvarado”, las cuales fueron divididas en dos grandes grupos
(cada sub-grupo conformado por 6 animales) (n=6):
Grupo Control:
.-Animales Control (C) (n=6)
.-Animales Control inyectados con melatonina (C+M) (n=6)
Grupo Experimental:
.-Animales Experimentales con diabetes mellitus tipo I sin suministro
de melatonina (D-M) (n=6)
.-Animales Experimentales con diabetes mellitus tipo I con
suministro de melatonina (D+M) (n=6)
Los animales una vez recibidos del Bioterio Central, fueron
colocados en forma individual en jaulas metabólicas (los cuatro subgrupos),
en el Bioterio que funciona en las instalaciones del Decanato de Medicina, y
dejados los mismos por una semana para su adaptación a las condiciones
ambientales de este lugar; recibieron alimentación y agua ad libitum.
A la semana, todos los animales fueron pesados para obtener los
pesos corporales iniciales de referencia y medidos los volúmenes de orina
excretados en 24 horas. De igual manera, se les tomó una muestra de sangre
(obtenida de la punta de la cola de cada rata) para medirles los niveles de
glucosa basal, como índice de referencia. Al décimo día, a los animales de
los grupos Control (C+M) y Experimentales (diabetes mellitus con
suministro de melatonina) (D+M), se les comenzó a suministrar vía intra-
peritoneal (cavidad abdominal), una dosis de 4 mg/animal de la hormona
melatonina (suministrada por la empresa Sigma Chemical) diluida en
solución fisiológica, hasta el final de los ensayos experimentales. A partir del
día once, a los doce animales que se les induciría diabetes mellitus tipo I
(grupos D-M y D+M), se les inyectó vía intra-peritoneal, una dosis de 40
mg/Kg peso corporal de la droga Streptozotocina (proporcionada por
Sigma Chemical) por 5 días consecutivos para inducir la diabetes mellitus
tipo I. Cumplido el tratamiento con Streptozotocina, se tomó una nueva
muestra de sangre de las colas de las ratas para verificar los niveles de
glicemia y de esta manera, comprobar que la droga indujo la diabetes en los
animales experimentales.
Cumplidos los protocolos anteriores, a todos los animales (grupos
controles y experimentales) desde el día 15 se les comenzó a medir cada tres
días y hasta el final de los ensayos:
.-Peso corporal
.-Volumen de orina excretado en 24 horas
.-Niveles de glucosa en sangre
.-Niveles de peroxidación lipídica renal al final de los experimentos.
De acuerdo a los resultados obtenidos y la aplicación de los análisis
estadísticos (cálculo de la media aritmética y la desviación estándar, y para la
determinación de la significancia estadística el test de Análisis de Varianza
de una vía –ANOVA-) se diseñaron cuadros y gráficos, los cuales muestran
los resultados para cada una de las dimensiones analizadas en el laboratorio,
esto es, peso corporal, volumen de orina excretado en 24 horas y niveles de
glicemia y de peroxidación lipídica en rebanadas de corteza renal, tanto en
las ratas controles como experimentales. A continuación se presentan los
resultados obtenidos:
? Peso de los Animales: para la determinación de los pesos de los
animales controles y experimentales, se utilizó una balanza especial para
pesaje de animales de experimentación (Ohaus Instrument)
Como se puede observar en el Gráfico y Cuadro número 1 que, mientras
los animales de los grupos control (C) y los inyectados con melatonina
(C+M) experimentaron ligeras variaciones de peso pero, con tendencia al
incremento del mismo, los animales experimentales inyectados con
Estreptozotocina y convertidos en diabéticos tipo I, tratados o no con la
hormona melatonina, experimentaron una tendencia significativa a
disminuir su peso hasta en un 20% respecto a los animales controles. El
hecho que los animales controles que solo recibieron melatonina
increméntaran su peso, pudiera explicarse debido a que esta hormona es
inductora del sueño, lo que se evidenciaba cuando los animales permanecían
en su mayor parte en reposo, con poco ejercicio dentro de la jaula,
alimentándose ad libitum con la respectiva ganancia de peso.
Gráfico No. 1
Parámetro Fisiológico Analizado: Peso (g)
C C+M D-M D+M0
50
100
150
200
250
300
350Control (C)
Control + Melatonina (C+M)
Diabéticas - Melatonina (D-M)
Diabéticas + Melatonina (D+M)
Grupo
Pes
o (g
)
Cuadro No. 1. Pesos de los animales controles y experimentales
(en gramos)
Grupo Peso de los animales (g)
C 276 ± 8
C + M 308 ± 8 *
D – M 264 ± 12
D+ M 258 ± 25
Los valores representan el promedio ± D.E de 6 determinaciones
(* P < 0.0001 respecto a C)
Los animales experimentales diabéticos tipo I, tratados o no con
melatonina, disminuyeron sus pesos progresiva y significativamente en
referencia a los controles (P < 0.0001) desde el primer día de la inyección de
la droga estreptozotocina hasta el final de la fase experimental, indicando
esto que la melatonina no influyó sobre la conservación del peso de los
animales diabéticos. Se debe recordar que en la diabetes mellitus el
metabolismo proteico, lipídico y glucido se halla muy alterado lo que explica
la pérdida significativa de peso en estos animales.
? Volumen de Orina Excretado: la disminución de los volúmenes de
orina excretado en los animales controles y experimentales se realizó
basándose en la medición del volumen de orina producido por cada animal
en 24 horas.
Nótese en el Gráfico y Cuadro número 2, que los volúmenes de orina
excretados en 24 horas por los animales diabéticos, tratados o no con
melatonina, fueron significativamente superiores al de los animales
controles (P< 0.002). Esto se explica por el hecho que los sujetos diabéticos
presentan lo que se denomina poliuria, es decir excesiva producción y
eliminación de orina, motivado a que los niveles de glucosa circulantes en
sangre son muy elevados, y cuando esta glucosa pasa por los riñones para
ser filtrada y reabsorbida, el exceso de glucosa es excretado por orina y
debido a que por razones osmóticas la excreción excesiva de glucosa
arrastra agua consigo, se produce la eliminación abundante de orina. Este
aumento en la excreción de líquido coincidió con incrementos importantes
en la ingesta de líquidos por estos animales experimentales (datos no
cuantificados)
? Niveles de Glicemia: como se desprende del análisis del Gráfico y
Cuadro número 3, los animales diabéticos que no recibieron la hormona
melatonina presentaron cifras elevadas de glucosa circulante en sangre, pero
si se comparan con los animales que si recibieron la hormona, se puede
apreciar que este ultimo grupo, aunque presentó cifras elevadas de glicemia,
las mismas fueron significativamente menores respecto a los no tratados
con melatonina (P< 0.003), lo que indica claramente que la melatonina
ejerce algún efecto protector disminuyendo los niveles de glucosa en sangre
en animales diabéticos.
? Niveles de Peroxidación Lipídica en rebanadas de corteza de
riñones de rata controles y experimentales: Como se puede observar en
la Tabla No. IV, los niveles de peroxidación lipídica, cuantificados como
Sustancias Reactivas al Acido Tiobarbitúrico (SRAT) (ver Anexo 2 para
detalles del procedimiento experimental), se incrementaron en forma
significativa en aproximadamente un 25% en homogenizados totales de
rebanadas de corteza riñones de ratas diabéticas no tratadas con melatonina
(D-M), respecto a los riñones control (C) o los tratados con la hormona
(C+M). Es de destacar que, en los homogenizados de corteza renal de ratas
diabéticas y tratadas con melatonina (D+M), los niveles de peroxidación
lipídica, aunque fueron un poco más elevados respecto a los controles,
Gráfico No. 2
Parámetro Fisiológico Analizado: Volumen de orina (ml)
C C+M D-M D+M0
15
30
45
60
75
90
105
120 Control
Control + Melatonina
Diabéticas sin Melatonina
Diabéticas con Melatonina
Grupo
Vo
lum
en d
e O
rin
a (m
l)
Cuadro No. 2. Volúmenes de orina excretados en 24 horas de los
animales controles y experimentales (en mililitros)
Grupo Volúmen de Orina (ml)
C 2.02 ± 0.71
C + M 2.70 ± 0.73
D – M 83 ± 62 *
D+ M 79 ± 60 *
Los valores representan el promedio ± D.E de 6 determinaciones
(* P < 0.002 respecto a C y C+M)
Gráfico No. 3
Parámetro Bioquímico Analizado: Nivel de Glicemia (mg/dl)
C C+M D-M D+M0
100
200
300
400
500Control
Control + MelatoninaDiabéticas sin MelatoninaDiabéticas con Melatonina
Grupo
Niv
eles
de
Glic
emia
(mg/
dl)
Cuadro No. 3. Niveles de Glicemia de animales controles y
experimentales (mg/dl)
Grupo Nivel de Glicemia (mg/dl)
C 80 ± 6.5
C + M 76 ± 6.8
D – M 393 ± 49 *
D+ M 276 ± 86 *
Los valores representan el promedio ± D.E de 6 determinaciones
(* P < 0.003 respecto a C y C+M)
TABLA IV
Niveles de peroxidación lipídica en rebanadas de corteza de
riñones de animales controles y experimentales
(nmoles MDA/mg prot.)
Grupo Nivel de Peroxidación Lipídica
(nmol MDA/mg prot)
C 5.59 ± 0,60
C + M 4,90 ± 0.45 *
D – M 12,45 ± 2.40 £
D+ M 7,75 ± 0.36 ¥
Los valores representan el promedio ± D.E de 3 determinaciones £ P < 0.02 respecto a (C) ¥ P < 0.01 respecto a (C)
* P < n.s. respecto a (C)
fueron significativamente menores que los de riñones de ratas diabéticas no
tratadas con la melatonina.
En base a los resultados obtenidos en este trabajo, se pudo evidenciar
que la hormona melatonina suministrada a los animales diabéticos aunque
no logró prevenir la disminución de peso y el incremento de los volúmenes
urinarios en los mismos, si se apreció que la melatonina logró evitar la
elevación drástica en los niveles de glucosa en sangre en animales que
recibieron la hormona en referencia a aquellos que no fueron tratados con la
misma (comparar resultados en el gráfico y cuadro número 3). De igual
manera, la melatonina fue capaz de prevenir el incremento sustancial en los
niveles de peroxidación lipídica en riñones de rata diabéticas (homogenizado
de corteza renal) respecto a las no tratadas con esta hormona producida por
la glándula pineal. En los animales control inclusive, la melatonina no tuvo
efectos secundarios reflejados, bien sea en la elevación o en la disminución
de los niveles de peróxidos lipídicos, por lo menos a estas dosis
farmacológicas utilizadas en el presente trabajo.
De esta manera, se evidencia que la melatonina pudiera estar
ejerciendo un efecto protector o antioxidante en los animales que recibieron
la estreptozotocina y se convirtieron en diabéticos, previniendo la elevación
sustancial en los niveles de glucosa en sangre y aminorando el daño causado
por la oxidación de esta sustancia cuando circula en elevados niveles en el
organismo. Hay evidencias suficientes en cuanto a que la melatonina
estabiliza las membranas celulares, protege a lípidos y al ADN nuclear, de
forma tal que puede ser considerada una molécula que tiene efectos
protectores contra el daño oxidativo causado por los radicales libres. Se
plantea así una nueva perspectiva que deberá ser considerada en el futuro
inmediato por los investigadores biomédicos, tanto para conformar estudios
más controlados y rigurosos como para valorar una medida terapéutica
adicional en la clínica médica.
F.- Niveles de peroxidación lipídica en fantasmas de glóbulos
rojos sometidos a radiación ultravioleta, tratados o no con
melatonina♦
Este otro estudio fue realizado en la fecha comprendida entre los
meses de Octubre y Noviembre del año 2004, en las instalaciones del
Laboratorio de Bioenergética Celular del Centro de Biofísica y Bioquímica
del IVIC, Altos de Pipe, mediante un trabajo conjunto entre ese laboratorio
y la Unidad de Investigación en Fisiología del Decanato de Medicina de la
UCLA de Barquisimeto.
Al igual que otros tipos de antioxidantes, caso de la vitamina E, se ha
descrito que la melatonina es capaz de proteger a la célula contra posibles
reducciones en la fluidez de la membrana plasmática celular y procesos
asociados a la peroxidación lipídica. En otras palabras, sería capaz de ejercer
efectos estabilizantes sobre la membrana celular. Trabajos muy interesantes
♦ Trabajo experimental realizado en el Laboratorio de Bioenergética Celular. Centro de Biofísica y Bioquímica. IVIC. Altos de Pipe. Año 2004
han demostrado que, la melatonina debido a su propiedad de liposolubilidad
e hidrosolubilidad, puede difundir a través de la membrana plasmática
ejerciendo sus efectos antioxidantes a ese nivel. Se han efectuado ensayos
donde se evidencia que la hormona tiene diferentes valores de movilidad y
accesibilidad a liposomas de fosfatidilcolina (PC) (el fosfolípido más
predominante en las membranas celulares de mamíferos) inmersos en
soluciones conteniendo generadores de radicales libres, lo cual pudiera
involucrar un consumo diferencial de la melatonina por los radicales libres y
productos de la peroxidación lipídica. Resultados presentados por los
investigadores muestran que, un 35% de la melatonina (concentración de 30
µM) incorporada hacia liposomas unilamelares difunde hacia la fase acuosa.
La actividad antioxidante también fue evaluada cuando los radicales libres se
generaron en la fase lipídica; para ello, concentraciones variables de
melatonina (10 a 250 µM), fueron incorporadas en 10 mM de liposomas de
PC de soya multilamelares. A concentraciones de 10 µM, la melatonina fue
poco efectiva, mientras que a concentraciones de 50 a 250 µM causó efectos
antioxidantes variables (Livrea, 1997)
Estos interesantes experimentos reflejan la idea que la melatonina
puede actuar como antioxidante a nivel intramembranoso, reduciendo los
niveles de peroxidación de los fosfolípidos de la membrana, sobre todo
aquellos ricos en ácidos grasos insaturados. Es conocido también el efecto
de la radiación ultravioleta sobre diversos componentes celulares, entre ellos
la propia membrana plasmática (Halliwell-Guterridge, 1989). En este ensayo
se utilizaron glóbulos rojos humanos, para valorar el posible efecto
protector de la melatonina contra de la peroxidación de los lípidos de
membrana de este tipo de células.
? Obtención de muestras de sangre:
Para la realización de estos experimentos in vitro, se obtuvieron
glóbulos rojos de adultos masculinos sanos, mediante la extracción de 10 ml
de sangre venosa, que fueron colocados de inmediato en un tubo de ensayo
con heparina. Para la preparación de los fantasmas de glóbulos rojos se
siguió el siguiente procedimiento.
? Preparación de fantasmas de glóbulos rojos:
Se lavó la sangre heparinizada por 3 veces con una solución de NaCl
al 0,9% (140 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 a 0°C) hasta quedar el
sobrenadante transparente. Luego se centrifugó a 10.000 rpm en
ultracentrifuga refrigerada por una sola vez. El plasma y la capa de glóbulos
blancos eran removidos por aspiración. Los glóbulos rojos empaquetados
fueron resuspendidos en una solución salina como la descrita. Se procedió a
hemolizar con 9 volúmenes de una solución hipo-osmótica 17 mM Tris-
HCl pH: 7,5 y 0,1 mM EDTA por 10 minutos (solución de hemólisis).
Posteriormente, se centrifugó y lavó a 20.000 rpm por espacio de: 20, 15, 10
y 5 minutos respectivamente hasta obtener los fantasmas de glóbulos rojos,
es decir, células sin ningún contenido de hemoglobina en su interior. Esto
es, un precipitado de color crema, constituido por membranas de
eritrocitos. Obtenidas estas preparaciones, eran de inmediato congeladas a
una temperatura de -70°C hasta su utilización.
? Procedimientos experimentales:
Las preparaciones obtenidas de fantasmas de glóbulos rojos fueron
utilizadas para ensayar la capacidad antioxidante de la melatonina, y para ello
las membranas de glóbulos rojos eran sometidas a irradiación ultravioleta,
con o sin la adición de la melatonina en el medio de incubación.
Se empleó el método de (Kako et al., 1988), para lo cual una alícuota
de 250 µl de la suspensión de fantasmas (con una concentración de proteína
entre 0,6 y 0,8 mg/ml) fue colocada en un vial de vidrio (40 mm x 25 mm),
el cual se encontraba dentro de un vaso de precipitado con hielo. A este vial
se le agregaba según correspondía, 1 mM de melatonina, 30 minutos antes
de la irradiación con luz ultravioleta. Las membranas eran entonces
iluminadas por espacio de 30 minutos con una lámpara UV Mineralight
(USA), situada a una distancia de 4 cm de la preparación, a una longitud de
onda de 254 nm. El espesor de la suspensión no era mayor de 1 mm.
Una vez cumplido el anterior procedimiento, se procedía a
determinar de inmediato los niveles de Sustancias Reactivas al Acido
Tiobarbitúrico (SRAT) de acuerdo al método de (Feix et al., 1991). A tubos
de centrífuga se les agregaba 50 µl de hidroxitolueno butilado (BHT) (50
mM); 750 µl de ácido tricloroacético al 10% y, 250 µl de la suspensión de
membranas (tratadas o no con melatonina), las cuales habían sido lavadas
previamente en 10 ml de buffer fosfato 10 mM, centrifugadas a 48.000 x g y
resuspendidas en 1 ml del mismo buffer. Los tubos así preparados se
mantenían sobre hielo a una temperatura de 4°C, por aproximadamente 10
min. Luego se procedía a centrifugar a 1500 rpm en centrifuga clínica por 10
min. Y se tomaban después, 500 µl del sobrenadante y se colocaban en
tubos de vidrio, en donde se les añadían 250 µl del reactivo de ácido
tiobarbitúrico al 0,5%. De inmediato, los tubos eran colocados en un baño
de agua hirviente por 15 min. Transcurrido ese tiempo, se dejaban enfriar a
temperatura ambiente. Se determinaba su absorbancia a una longitud de
onda de 532 nm, contra un blanco tratado de igual forma, pero que no
contenía la suspensión de membranas. En cada caso, se preparaba al
instante, una curva de calibración usando como estándar el 1,1-3,3-
tetrametoxipropano (TMP). Los resultados son expresados como
nanomoles de malondialdehído por miligramo de proteína (nM MDA/mg.
prot). En todos los casos, la determinación de proteínas se realizó mediante
el método de (Bradford, 1976). Los análisis estadísticos se realizaron
mediante el empleo del Student t test.
? Resultados obtenidos:
Como se desprende del análisis de la Tabla No. V, la melatonina por
sí sola, no tiene algún efecto sobre los niveles de peroxidación lipídica en
membranas de glóbulos rojos cuando se comparan con los valores controles
comparar [(C+MLT) con (C)]. Cuando los fantasmas de glóbulos rojos
fueron irradiados con luz UV por 30 minutos, sin la adición previa de
melatonina, los valores de SRAT se incrementaron en casi 5 veces respecto
a los controles [compárese (C + UV) con (C)]
Al tratar previamente las membranas con la hormona melatonina y
luego ser sometidas a irradiación con luz UV, puede notarse que los valores
disminuyeron significativamente respecto a aquellas membranas que no
recibieron el pre-tratamiento con melatonina, compare [(MLT +UV) con el
grupo (C + UV)]
Dado que, el hidroxi-tolueno-butilado (BHT) es un excelente
antioxidante utilizado comúnmente in vitro, y el mismo está incluido en la
solución de determinación de niveles de SRAT en este procedimiento
experimental, se procedió a realizar un ensayo usando el BHT como
probable antioxidante, pre-incubándolo 30 minutos antes con las
membranas de glóbulos rojos, previo a la irradiación con luz UV,
comparando así la efectividad de esta sustancia antioxidante con la
melatonina. La concentración de BHT empleada fue 50 mM. Los resultados
presentados en la Tabla V muestran que el BHT efectivamente previene el
incremento en los niveles de SRAT, pero hay que tener en cuenta que las
dosis utilizadas fueron 50 veces superiores a las empleadas para la
melatonina.
TABLA V
Niveles de peroxidación lipídica en membranas de glóbulos rojos
sometidas o no a radiación ultravioleta (UV), tratadas o no con
melatonina (MLT) o hidroxi-tolueno-butilado (BHT)
Condición Niveles de Malondialdehído (nM MDA/mg prot.)
(C) 0,39 ± 0,02
(C + UV) 1,84 ± 0,27 ¶
(C + MLT) 0,42 ± 0,06 ¢
(MLT + UV) 0,94 ± 0,14 &
(C + BHT) 1,10 ± 0,17
(BHT + UV) 0,92 ± 0,01 *
Datos procesados con paquete estadístico GraphPad Prism 3.02 for windows
Los datos son expresados como la media ± E.S. obtenida de una serie de 3 ensayos
¶ p < 0.005 respecto a (C)
& p < 0.020 respecto a (C)
¢ p < 0.03 respecto a (C+ UV)
* p < n.s. respecto a (C + BHT)
Es conocido que alteraciones en la estructura química de las
membranas celulares, debido a la formación de enlaces covalentes cruzados
entre lípidos y proteínas, o entre lípidos adyacentes, causado por el proceso
de peroxidación lipídica, y la reducción en la relación de ácidos grasos
insaturados/saturados, son causas de la disminución de la fluidez de las
membranas. La irradiación con luz UV es causa directa del incremento en
los niveles de peroxidación lipídica detectados en los fantasmas de glóbulos
rojos, con las alteraciones descritas anteriormente. La melatonina como
molécula que neutraliza el proceso de peroxidación lipídica, también debe
prevenir la rigidez de la membrana inducida por el estrés oxidativo. Estos
resultados obtenidos con fantasmas de glóbulos rojos apoyarían la noción
que, la melatonina hace más resistente la membrana al daño peroxidativo.
En este caso, trabajando con un sistema biológico in vitro, esto es,
fantasmas de glóbulos rojos que no poseen los mecanismos enzimáticos
antioxidantes en su interior, se pudo comprobar que la melatonina, aparte
que pudiera ejercer un efecto indirecto, estimulando los mecanismos de
defensa antioxidantes propios de la célula, también actúa directamente
estabilizando la membrana celular al nivel óptimo.
G.- Otras acciones de la melatonina en el organismo
Desde hace varios años se conoce que durante el proceso de
envejecimiento celular, existe un incremento en la producción de radicales
libres derivados del oxígeno, concomitante con una reducción en la
actividad de las enzimas antioxidantes. Sucede también que durante el
envejecimiento existe una declinación progresiva en los niveles de
melatonina circulantes y alteraciones en el propio ritmo circadiano
(Huether, 1996). Numerosos son los ensayos que han descrito que la
melatonina suministrada exógenamente, tiene efectos inmuno-
estimulatorios, oncostáticos y rejuvenecedores en roedores seniles,
previniendo la degeneración celular, la desdiferenciación y carcinogénesis.
Asimismo, hay evidencias que postulan que la melatonina retrasa el inicio de
enfermedades relacionadas con el envejecimiento (Pierpaoli-Regelson, 1996)
Autores como (Sainz, 1995) han demostrado que, la apoptosis
inducida y la que ocurre en forma espontánea, es retardada por el
tratamiento previo con melatonina. Este grupo de trabajo encontró que la
apoptosis normal en el timo de rata, estuvo reducida cuando los animales
eran tratados con dosis diarias de hasta 500 µg/kg peso en edades
comprendidas entre 25 y 65 días. La adición de melatonina al medio de
cultivo con timocitos (10-9 M o 10-7 M) redujo la muerte celular programada
en un 20% y 35% respectivamente. Concluyeron los autores que,
probablemente la melatonina en estos estudios no protegió directamente al
ADN nuclear removiendo radicales libres próximos a esta estructura, sino
que la hormona actuó de manera indirecta envolviendo la remoción de
radicales libres, alterando los mecanismos de señalización, los cuales inician
los eventos apoptóticos (Sainz, 1995)
Papolla y col. en 1997, estudiando células apoptóticas de
neuroblastoma murino tipo N2a y utilizando proteína ß-amiloide
(constituyente de las placas seniles en pacientes con Alzheimer) para su
inducción, concluyeron que en este modelo experimental in vitro, la
melatonina fue muy efectiva en reducir apoptosis en esta línea celular.
Estudios muy recientes efectuados por un equipo de investigadores
venezolanos de la Universidad del Zulia, han demostrado que la melatonina
reduce los eventos apoptóticos y post-necróticos en riñones con falla renal
aguda, de ratas tratadas con cloruro de mercurio y en los cuales el estrés
oxidativo es evidente (Nava, 2000)
IV.- CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
En los estudios realizados in vivo en el presente trabajo, se encontró
que la melatonina a las dosis farmacológicas empleadas, efectivamente reduce
los niveles de peroxidación lipídica que se presentan a consecuencia de la
generación de radicales libres derivados del oxígeno en el desarrollo de la
diabetes mellitus. En los ensayos realizados in vitro, utilizando como modelo
biológico membranas de glóbulos rojos, la melatonina también fue efectiva
para prevenir o reducir el daño peroxidativo inducido por la radiación
ultravioleta.
En los reportes publicados por diversos investigadores y que fueron
expuestos en el presente trabajo, más los resultados obtenidos por este autor,
no deja lugar a dudas que la hormona melatonina ejerce un efecto protector
contra la peroxidación de los lípidos de la membrana celular. Recuérdese que
la destrucción de los ácidos grasos poli-insaturados de los fosfolípidos
integrantes de las membranas, compromete el funcionamiento celular y por
ende, el normal funcionamiento de los tejidos corporales. Puesto que la
melatonina es altamente liposoluble, cabe esperar que la misma difunda sin
problemas a través de la membrana e inhiba el proceso peroxidativo a ese
nivel.
¿Cuál sería el mecanismo bioquímico de acción de la melatonina?
Podrían postularse tres considerandos:
La melatonina podría actuar:
a) Directamente, removiendo los radicales libres generados.
b) Indirectamente, estimulando la producción de enzimas antioxidativas.
c) Ejerciendo efectos inmunomodulatorios
Con respecto a la primera opción, se ha comprobado su efecto
removedor o neutralizador de radicales libres; inclusive, se han efectuado
estudios comparativos entre diversas sustancias y la melatonina,
evidenciándose que la hormona realmente es más eficaz que otros
componentes o sustratos antioxidativos para ejercer un efecto antioxidante.
Una característica fundamental de la melatonina es su gran liposolubilidad e
hidrosolubilidad. Un punto de debate que continúa y deberá esclarecerse
prontamente, es el de las dosis empleadas de melatonina para los diversos
ensayos que se han realizado a lo largo de los años incluyendo el presente
trabajo. Las cantidades de melatonina que se suministran causan que los
niveles sanguíneos excedan en varias veces, los niveles fisiológicos.
Recuérdese que los niveles de la hormona en horas nocturnas, alcanza
valores en el rango de 100-150 pg/ml en plasma; con los niveles dados en
los experimentos, es probable que estos niveles plasmáticos se eleven en
varias veces los fisiológicos; una gran ventaja de la melatonina, es que no
posee efectos colaterales tóxicos, por lo menos a corto plazo. Esta primera
opción explicaría, las acciones como antioxidante de la melatonina en
glóbulos rojos sometidos a radiación UV, neutralizando los radicales libres
generados durante tal proceso. También en los estudios efectuados en ratas
con diabetes mellitus inducida por la Estreptozotocina, la acción
removedora de radicales libres fue evidente, aunque los experimentos deben
ser ampliados y un mayor número de órganos debe ser examinado.
Respecto a la segunda opción, se ha demostrado que la melatonina
también tiene la capacidad de estimular las defensas antioxidantes propias
de la célula. Hay dos enzimas relacionadas al sistema defensivo antioxidante
del organismo, que al parecer son reguladas por el ritmo circadiano
endógeno impuesto por la melatonina. Estas enzimas son estimuladas por la
hormona en horas nocturnas, incrementando los niveles de ARNm de
superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa (Reiter, 1997). Esta opción se
descarta para los ensayos efectuados in vitro con los glóbulos rojos, ya que al
ser hemolizados y naturalmente carecer de núcleo, no cabe la posibilidad de
estimulación de este tipo de sistema antioxidativo.
En lo referente al efecto inmuno-estimulatorio, hay resultados que
dan prueba de ello; para lograr este efecto se requieren que los tratamientos
sean efectuados a largo plazo. Se necesitarán mayor cantidad de ensayos
para corroborar la inmuno-estimulación por la melatonina y su relación con
la capacidad antioxidante del organismo (Huether, 1996)
En opinión de muchos investigadores, la melatonina debido a sus
propiedades y estructura bioquímica, puede ser catalogada como un débil
antioxidante in vivo, más aún con las concentraciones a las que se le
encuentra en los fluidos corporales. Muchos autores la han catalogado
como una molécula que puede retardar la auto-oxidación en sistemas libres
de metales iónicos (Fe++, Cu++), o ser un antioxidante preventivo de la
subclase desactivador de metales iónicos. También tiene la capacidad de
actuar en forma sinérgica con otros antioxidantes celulares (Antunes, 1999),
(Reiter, 2000) y (Hayter, 2004)
El que la melatonina pueda ser clasificada como una molécula
antioxidante, requerirá de muchas más investigaciones en el campo; debe
quedar claro que la melatonina es una hormona producida por la glándula
pineal y otros tejidos del cuerpo, diseñada para cumplir una función crucial,
cual es el control y sincronización de los ritmos biológicos. El autor del
presente trabajo concluye que, aún es muy temeroso proponer que la
melatonina deba ser incluida como una sustancia antioxidante celular
dentro de los esquemas actuales. Se necesitan más ensayos experimentales
tanto in vivo como in vitro para poder obtener conclusiones más sólidas. No
hay duda de la capacidad neutralizadora o removedora de radicales libres
que posee la hormona; las evidencias lo demuestran, pero para que una
sustancia sea catalogada como antioxidante debe cumplir y satisfacer una
serie de requisitos que ya fueron presentados en detalle y con anterioridad
en este mismo trabajo. Ello debe ser demostrado fehacientemente.
La melatonina tiene sus ventajas farmacológicas; posee una muy baja
toxicidad aguda, es de fácil administración, es muy económica, no induce
efectos colaterales indeseables, es bien tolerada en todas las edades, no se
han evidenciado interacciones con otros medicamentos y no produce
dependencia, lo que resulta útil y todo ello sugiere que posee un enorme
potencial para ser incluida dentro de la terapia contra los radicales libres
producidos en diversas patologías.
Hay más interrogantes que respuestas. La atención pública se sigue
centrando en los efectos benéficos reportados de la melatonina, sobre todo
como retardador del envejecimiento, como sustancia anti-tumoral, para
combatir el insomnio y contra muchas otras patologías, incluyendo la
remoción de radicales libres. Mientras tanto, la melatonina se sigue vendiendo
sin prescripción médica y está al alcance de las personas en los estantes de los
establecimientos expendedores de medicina de todo el mundo ?
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ANEXO 1
Bioquímica y Mecanismos de Acción de los Radicales Libres
Un radical libre (R? ) constituye una molécula o fragmento molecular
que contiene uno o más electrones no apareados en su orbital más externo.
Una molécula puede convertirse en radical libre tanto por ganancia como por
pérdida de electrones, y también por fisión de enlaces homolíticos. Cuando un
enlace covalente se rompe simétricamente, ambos fragmentos retienen un
electrón, y por tanto, se convierten en radicales libres. El estudio de los
radicales libres se ha enfocado desde el punto de vista médico y biológico, ya
que las interacciones de los radicales libres con moléculas orgánicas han sido
implicadas en un gran número de estados patológicos, los cuales pueden jugar
un papel significante en el daño tisular (de Zwart, 1999) y (Tiskow, 1996). Los
radicales libres han sido detectados por métodos como la resonancia de spin
del electrón o métodos más sofisticados como el atrapamiento del spin del
electrón (Spin Trapping) (Southorn, 1988)
Muchos organismos requieren del oxígeno para su sobrevivencia, en
donde el oxígeno es utilizado por las células para oxidar compuestos
orgánicos. El oxígeno molecular (O2) actúa como elemento oxidante al
aceptar hasta cuatro electrones en su orbital más externo (reducción
tetravalente) para dar lugar a dos moléculas de agua:
O2 + 4H+ + 4e- à 2 H2O [1]
El oxígeno también puede sufrir reducción univalente, divalente o
trivalente (al aceptar uno, dos o tres electrones) dando lugar a la formación de
especies activadas de oxígeno. Los productos respectivos son: radical anión
superóxido (O2? ), el intermediario peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical
hidróxilo (OH? ):
e- e- e- e-
O2 à O2? à H2O2 à 2OH? à 2H2O [2]
Estas especies activadas tienen la particularidad de que pueden
reaccionar con relativa facilidad con sustratos endógenos de las células.
La reducción univalente del oxígeno fue descrita en el año de 1931 por
(Haber y Willstatter, 1934). En otro orden de ideas, (Haber y Weiss, 1935)
describieron que la reducción secuencial trivalente del oxígeno molecular, en
combinación con un catalizador en presencia de hierro, daba lugar a la
producción de intermediarios oxigenados muy reactivos que eran especies
fuertemente oxidantes. La importancia biológica de este descubrimiento tuvo
que esperar hasta 1969 cuando (McCord y Fridovich, 1959) identificaron una
enzima, la superóxido dismutasa, que cataliza la producción de peróxido de
hidrógeno (H2O2) a partir del anión superóxido (O2? )
A lo largo de la evolución, mientras las células desarrollaban los
mecanismos de utilización de oxígeno, desarrollaban simultáneamente
mecanismos de defensa contra la toxicidad del mismo. Un incremento o una
disminución significativa del oxígeno disponible para las células, resulta en
alteraciones bioquímicas profundas, las cuales pueden culminar en daño
estructural e inclusive hasta la muerte celular (Halliwell, 1987)
Se han descrito numerosos mecanismos bioquímicos celulares
responsables de la generación de radicales libres:
1. Las mitocondrias, peroxisomas y microsomas celulares, producen estos
compuestos aunque en cantidades muy pequeñas (1 a 2 % de los radicales
libres generados por las células). Las mitocondrias y sus sistemas de transporte
de electrones son el sitio de mayor oxidación celular, donde se promueve la
reducción tetravalente del oxígeno hasta agua (ver ecuación 1). La reducción
del oxígeno hasta agua por la enzima Citocromo C Oxidasa mitocondrial
envuelve una transferencia de cuatro electrones con ningún radical libre
intermediario. Menos del 1 % del flujo de electrones resulta en producción de
radical superóxido (Cadet, 1988)
2. La autooxidación de catecolaminas. En ciertos procesos, como la
isquemia cerebral, hay liberación regional de noradrenalina y dopamina ß-
hidroxilasa de las terminaciones nerviosas en la zona de isquemia. Las
catecolaminas son degradadas por la enzima monoamino-oxidasa (MAO), y
ello envuelve un paso oxidativo con producción de un exceso de electrones.
El oxígeno, sobre todo al darse el proceso de reperfusión, puede actuar como
agente aceptor de electrones y producir algunos radicales hidróxilo y peróxido
de hidrógeno (Ikeda, 1990)
3. Los neutrófilos activados poseen una enzima, la nicotinamida adenina
dinucleótido fosfato oxidasa (NADPH oxidasa), responsable de la producción
del radical anión superóxido (Weiss, 1982):
NADPH
oxidasa
2O2 + NADPH ----------à 2O2? + NADP+ + H+ [3]
También, los neutrófilos, poseen una mieloperoxidasa, la cual genera el
radical ClO? Al reaccionar con peróxido de hidrógeno:
Cl? + H2O2 à ClO? + H2O [4]
4. El ácido araquidónico puede ser metabolizado por ciclooxigenasas o
por lipooxigenasas, produciendo diversas sustancias con propiedades
vasoactivas, entre ellas: prostaglandinas, trombóxano, prostaciclina,
leucotrienos (Samuelson, 1983)
5. La oxidación de hipoxantina y xantina a ácido úrico catalizada por la
xantina oxidasa, está acoplada a la reducción del oxígeno molecular a anión
superóxido (McCord, 1985):
xantina + H2O2 + 2O2 à ácido úrico + 2O2? + 2H+ [5]
6. Otras probables fuentes de radicales libres son la radiación ionizante,
como la radiación ultravioleta, productos de la reacción de drogas y toxinas
con sustratos celulares, contaminantes atmosféricos, fotosensibilizadores, y
productos de la combustión de materia orgánica (Bulkley, 1983)
En condiciones normales, las células cuentan con mecanismos de
protección, enzimáticos y no enzimáticos, contra los radicales libres. Entre los
mecanismos celulares de protección enzimáticos se cuentan:
a) La enzima superóxido dismutasa (SOD). La misma se encarga de la
reacción de dismutación del radical anión superóxido intracelular. La enzima,
perteneciente a la familia de metaloenzimas, cataliza la conversión del anión
superóxido a peróxido de hidrógeno más oxígeno a través de la siguiente
reacción:
SOD
O2? + O2
? + 2e- + 2H+ -------à H2O2 + O2 [6]
La superóxido dismutasa se ha encontrado en varias formas activas;
una conteniendo manganeso, la cual se encuentra en la matriz mitocondrial y
otra conteniendo cobre y zinc, la cual se localiza en el citoplasma (McCord
1981)
b) La catalasa y la glutatión peroxidasa (GP), conforman el principal
sistema intracelular de catálisis del peróxido de hidrógeno. El mayor peligro de
la presencia de H2O2 es la producción del radical OH., que es una especie
oxidante muy reactiva e inestable. La producción de radicales OH? se realiza a
través de la reacción de Haber-Weiss en presencia de un agente quelante
metálico, o por intermedio de la reacción de Fenton:
Fe3+ + quelante
H2O2 + O2? ---------------------à O2 + OH?+ OH– (Haber-Weiss)
H2O2 + Fe2+ à complejo intermedio à Fe3+ + OH? + OH- (Fenton)
El radical OH? Es muy inestable y reacciona con una variedad de
compuestos orgánicos y con componentes diversos de las membranas
biológicas. En condiciones normales, no se producen o no existen
concentraciones importantes de radicales hidróxilo y no existe sistema
enzimático capaz de remover cantidades excesivas de este tipo de compuesto,
de allí la importancia de la catalasa y la glutatión peroxidasa en la remoción del
H2O2 intracelular. A bajas concentraciones de H2O2, éste es removido por la
glutatión peroxidasa, en presencia de glutatión reducido (GSH) el cual es
oxidado hasta glutatión oxidado (GSSG):
2 GSH + H2O2 à GSSG + 2H2O [9]
A altas concentraciones de H2O2, la catalasa se vuelve primordial en su
remoción:
2 H2O2 à O2 + 2H2O [10]
Entre los mecanismos celulares no enzimáticos de protección contra
los radicales libres, se cuentan:
a) El a-tocoferol o vitamina E, que se le ha descrito como antioxidante de
la fase lipídica, ya que por ser liposoluble, se particiona con mucha facilidad
hacia las membranas y transforma especies reactivas como los radicales
hidróxilo o peróxilo en componentes menos reactivos. Actúa donando H+ al
radical y por tanto, confinando el efecto del radical; en adición se produce una
forma de radical estable de vitamina E (Halliwell-Gutteridge, 1989).
b) El ácido ascórbico o vitamina C, antioxidante de fase acuosa, la cual se
localiza en altas concentraciones en ciertos órganos, especialmente en el ojo
(Halliwell, 1986). A este compuesto se le ha reconocido por mucho tiempo,
que posee propiedades antioxidantes y protege contra daños oxidativos a
aceites de origen vegetal, grasas animales, alimentos conteniendo grasas, tales
como leche, pescados, margarinas, entre otros. Estas funciones de la vitamina
C son mayormente derivadas de sus propiedades Redox. El compuesto actúa
donando hidrogeniones al radical libre, transformandose el ácido ascórbico
(AH2) en ácido dehidroascórbico (A), con la concomitante formación del
radical ascórbilo (A? –) como intermediario, molécula que actúa como un
radical libre, pero que es normalmente mantenido a una baja concentración en
el plasma. Se ha demostrado que la vitamina C suprime la oxidación de
liposomas de fosfatidilcolina de soya y membranas de fantasmas de eritrocitos
en dispersiones acuosas, oxidación inducida por radicales libres. Por el
contrario, se ha notado que la vitamina C no suprime en forma eficaz, como
lo hace la vitamina E, radicales dentro de las regiones lipídicas de las
membranas (Halliwell-Gutteridge, 1989)
c) Ceruloplasmina, proteína circulante portadora de cobre, puede actuar
como antioxidante extracelular (Halliwell, 1986)
d) Otros: Cisteína, Manitol, Alopurinol, Tiourea, Hidroxitolueno-butilado,
Desferroxamina, Dimetilsulfóxido, Dimetiltiourea, Fosfatidilcolina de soya,
entre otros (Tiskow, 1996)
? El Proceso de Peroxidación Lipídica:
El ataque a los fosfolípidos de membrana por los radicales libres se
centra fundamentalmente en el proceso de peroxidación lipídica de los
residuos de ácidos grasos de los fosfolípidos.
Se considera que el proceso de peroxidación lipídica ocasiona cambios
en la composición química y deterioros en la organización ultraestructural de
las membranas celulares, disminuyendo la fluidez de las mismas, alterando su
permeabilidad e inactivando receptores y enzimas unidas a la membrana.
(Halliwell-Guteridge, 1989), (Tiskow, 1996)
El proceso de peroxidación lipídica como tal es complejo y puede
entenderse como un mecanismo por el cual los lípidos insaturados reaccionan
con el oxígeno para producir hidroperóxidos lipídicos:
LH + O2 à LOOH [11] donde LH es un lípido y LOOH es el hidroperóxido resultante.
El mecanismo intrínseco de peroxidación lipídica puede describirse
como sigue: la reacción es iniciada por el ataque de radicales libres, los cuales
sustraen un átomo de hidrógeno de un carbono metileno en la cadena lateral
de un ácido graso de un fosfolípido (ver Fig. No. 9). El átomo de hidrógeno
es un radical libre de por sí (puesto que tiene un electrón singlete desapareado)
y su remoción deja un electrón desapareado en el átomo de carbono
atacado. A este proceso descrito se le ha denominado iniciación de la
peroxidación lipídica.
El radical carbonilo (L? ) resultante sufre rearreglos moleculares
originando un dieno conjugado, y en presencia de oxígeno molecular da lugar
al radical peróxilo.
R? + LH RH + L? (Fase de Iniciación)
El radical carbonilo resultante (L) sufre rearreglos moleculares originando un dieno conjugado, y en presencia de oxígeno molecular da lugar al radical peróxilo (LOO):
L? + O2 LOO?
El radical peróxilo puede sustraer un átomo de hidrógeno de otra molécula vecina (LH), la cual puede ser otro ácido graso insaturado, formándose así un hidroperóxido (LOOH) y un nuevo radical lipídico (L), entrando la peroxidación en una Fase de Propagación:
LOO? + LH L? + LOOH (Fase de Propagación)
LOOH LO? + OH? (Fase de Ramificación)
Reacciones de Terminación:
L? + L? P* P + h?
LOO? + L? P* P + h?
LOO? + LO? P* P + h?
Figura No. 9
Representación esquemática del proceso de peroxidación lipídica.
Los radicales peróxilo pueden sustraer un átomo de hidrógeno de otra
molécula vecina (LH), la cual puede ser otro ácido graso poliinsaturado,
formándose así un hidroperóxido (LOOH) y un nuevo radical lipídico (L? ),
entrando la peroxidación lipídica en un proceso de propagación. El grado de
propagación de la reacción depende de muchos factores, entre ellos, la
relación lípido/proteína en la membrana (la oportunidad de reaccionar un
radical con una proteína se incrementa cuando el contenido de proteína
aumenta), de la composición de ácidos grasos, concentración de oxígeno y de
la presencia dentro de la membrana de antioxidantes que inhiban la
propagación de la reacción. El hidroperóxido lipídico puede en adelante
degradarse a una variedad de productos. Además, en presencia de metales de
transición, como Fe++, Cu+, el hidroperóxido produce un radical alcóxilo
(LO? ) y un radical hidróxilo (OH? ), los cuales causan la ramificación de la
reacción, involucrando un mayor número de moléculas del sustrato en el
proceso de peroxidación. Cuando la concentración de moléculas de sustrato
se hace pequeña, los radicales libres comienzan a reaccionar entre sí, en
distintas combinaciones provocando la formación de productos excitados
(P*). El paso de estos productos excitados a su estado estable (P) ocurre con la
emisión de cuantos de luz visible. Estas reacciones reciben el nombre de
reacciones de terminación y con ellas concluye la reacción en cadena mediada
por radicales libres (Halliwell-Gutterige, 1989), (de Zwart, 1999)
• ANEXO 2
Determinación de Sustancias Reactivas al Acido Tiobarbitúrico mediante la cuantificación de malondialdehído producido
Método de Ohkawa et.al
Para determinar los niveles de peroxidación lipídica, se cuantificaron los
niveles de Sustancias Reactivas al Acido Tiobarbiturico (SRAT), por el
método de (Ohkawa, 1979). A los tubos experimentales se les agregó 700 µl
de agua destilada, 200 µl de SDS al 8,1%, 1500 µl de ácido acético (pH 3.5)
al 20%, 1500 µl de ácido tiobarbitúrico al 0,8 % y 100 µl del homogenizado.
Los tubos se colocaron en un baño de agua hirviendo por 45 minutos.
Luego los tubos fueron enfriados en baño de agua a temperatura ambiente
por unos 5 minutos, y se les añadió luego 1 ml de agua destilada y 5 ml de
butanol. La suspensión fue agitada vigorosamente y sometida a
centrifugación a 4000 rpm por 10 minutos en centrífuga clínica. El
sobrenadante se removió con sumo cuidado y se determinó su absorbancia
a 532 nm en contra de un blanco tratado de igual manera, pero que no
contenía la suspensión de membranas. Se preparó una curva de calibración
usando como estándar 1,1,3,3-tetrametoxipropano (TMP). Los resultados
fueron expresados como nanomoles de malondialdehído (MDA) por mg de
proteína.
