PERFIL DE ANTEPROYECTO DE TESIS

1

“Año de la Promoción de la Industria Responsable y del Compromiso Climático”

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONÍA PERUANA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

PROYECTO DE TESIS

TÍTULO:

Desarrollo y validación de un método analítico para la cuantificación de Permetrina

1% en Shampoo mediante Cromatografía Liquida de alta Resolución (HPLC).

PRESENTADO POR LOS BACHILLERES:

Bach: Ruddy Verónica Guardia Vargas.

Bach: Susan Lizeth Elias Da Silva.

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE:

QUÍMICO FARMACÉUTICO

ASESOR:

Q. F. Luis Domingo Nonato Ramírez.

Iquitos - Perú

2014

2

DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO PARA LA

CUANTIFICACIÓN DE PERMETRINA 1% EN SHAMPOO MEDIANTE

CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC).



RESUMEN

Se desarrolló y validó una nueva técnica de análisis por Cromatografía Líquida de Alta

Resolución (HPLC) para la cuantificación de Permetrina 1% en Shampoo, de acuerdo a la

exigencia y normatividad vigente referida a Buenas Prácticas de Fabricación de productos

farmacéuticos (USP 36). La técnica de análisis se realizó mediante el tipo de muestreo

aleatorio al azar, se tomó en cuenta la preparación de la muestra para que el principio

activo pueda ser cuantificado en un sistema (fase móvil, columna cromatográfica y

longitud de onda). Como paso previo a la validación de la técnica de análisis, se evaluó la

aptitud del sistema cromatográfico, asegurando de esta manera, el funcionamiento

adecuado del mismo. Posteriormente, se procedió a la validación del método de análisis

evaluando los parámetros que indican las obras oficiales, como son: selectividad,

linealidad, precisión, exactitud y robustez. Seguidamente, se elaboró el Protocolo de

validación del método, para lo cual se contó con el diseño experimental y los

procedimientos estadísticos, concluyéndose así que el método analítico propuesto es

selectivo, porque permite el análisis del principio activo sin la interferencia de los

excipientes presentes en la formulación del Shampoo, es lineal, porque los resultados

obtenidos son directamente proporcionales a la concentración de analito en la muestra, es

preciso, porque nos permite obtener resultados repetitivos y reproducibles, cuando este es

aplicado en análisis repetitivos de la misma muestra y es exacto, ya que permite la

recuperación de la totalidad de analito presente en la muestra, comprobándose así su

validez.

Palabras claves:

- Permetrina.

- Cromatografía líquida de alta resolución.

- Método analítico.

- Validación.

3

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF A QUANTITATIVE ANALYTICAL

METHOD FOR permethrin 1% SHAMPOO IN LIQUID CHROMATOGRAPHY

(HPLC).



ABSTRACT

Was developed and validated a new analysis technique for liquid chromatography (HPLC)

for the quantification of Permethrin 1% by Shampoo, according to the requirement and

current regulations relating to good manufacturing practices for pharmaceutical products

(USP 36). The technique of analysis was performed using the type of random sampling

randomly, took into account the sample preparation for the active substance can be

quantified in a system (mobile phase chromatographic column and wavelength). Prior to

the validation of analytical technique it was evaluated the system suitability

chromatographic, thus ensuring the proper functioning thereof was evaluated.

Subsequently, we proceeded to validate the method of analysis evaluating the parameters

that indicate the official work, such as: selectivity, linearity, precision, accuracy and

robustness. Then, Protocol validation method was developed, for which it had the

experimental design and statistical procedures, thus concluding that the proposed analytical

method is selective, it allows the analysis of the active ingredient without interference from

the excipients present in the formulation of the shampoo, is linear in that the results

obtained are directly proportional to the concentration of analyte in the sample, it is

necessary, because it enables us for repeatable and reproducible results, when this is

applied in repetitive analyzes of the same sample and exact because it allows the recovery

of all of the analyte present in the sample and checked for validity.

Keywords:

- Permethrin

- High Performance liquid Chromatography

- Analytical method

- Validation

4

DEDICATORIA

.

Con todo mi cariño y mi amor para

las personas que hicieron todo en la

vida para que yo pudiera lograr mis

sueños, por motivarme y darme la

mano cuando sentía que el camino se

terminaba, a ustedes por siempre mi

corazón y mi agradecimiento.

Susan Lizeth Elías Da Silva.

A DIOS, por ser el principal sustento de

Aliento, Fe y Esperanza en mi vida y sin el

cual no hubiese sido posible todo esto ni

ningún otro logro. A mis amados padres,

Victor Guardia Rodríguez y Norma

Vargas De Guardia, por formar en mí esos

principios y valores que han hecho de mí una

gran persona, capaz de salir adelante en

beneficio propio, de mi familia y de la

sociedad.

Ruddy Verónica Guardia Vargas

5

AGRADECIMIENTOS

A la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de la Amazonía

Peruana por la excelente formación profesional recibida.

A Laboratorios PORTUGAL S.R.L. en la persona de su jefe de control de calidad Dra:

Nolly Huanca, por el apoyo y facilidades brindadas.

A nuestras familias, por su apoyo incondicional, permanente aliento que hizo posible la

realización de este trabajo.

A la Ing. María Milagros Manrique Nina por su confianza y apoyo brindado.

Al asesor de esta tesis, nuestro profundo agradecimiento por sus valiosos aportes y tiempo

brindado.

A los catedráticos de la Facultad, que con sus conocimientos brindados, forjaron y

fortalecieron nuestro desarrollo profesional.

Gracias.

6

ÍNDICE DE CONTENIDOS

RESUMEN…………………………………………………………………………… 02

ABSTRACT………………………………………………………………………….. 03

DEDICATORIA……………………………………………………………………... 04

AGRADECIMIENTO……………………………………………………………….. 05

CAPÍTULO I

1.1 INTRODUCCIÓN…………………………………………………………............ 15

1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA……….................................................... 17

1.3 OBJETIVOS………………………….…………………………………….….…. 19

1.3.1 General………………………………...…………………………………….. 19

1.3.2 Específicos……………………………………………………...…………… 19

CAPÍTULO II

2.1 MARCO TEÓRICO…………………………………………………………..….. 21

2.1.1 Antecedentes………………………………………………………………………. 21

2.1.2 Consideraciones teóricas…………………………………………………………... 23

2.1.2.1 Piretrinas y Piretroides…………………………………………………………... 23

2.1.2.1.1 Generalidades………………………………………………………………...... 23

2.1.2.1.2 Piretroides……………………………………………………………………... 24

2.1.2.1.2.1 Definición…………………………………………………………………… 24

2.1.2.1.2.2 Clasificación………………………………………………………………… 24

2.1.2.1.3 Permetrina……………………………………………………………………... 27

2.1.2.1.3.1 Propiedades Físicas y Químicas de Permetrina……………………………... 28

2.1.2.2 Cromatografía Liquida de Alta Resolución (HPLC)……………………………. 28

2.1.2.2.1 Definición……………………………………………………………………... 28

2.1.2.2.2 Partes…………………………………………………………………………... 29

a. Bomba………………………………………………………………………………… 29

7

b. Inyectores……………………………………………………………………………... 29

c. Detectores…………………………………………………………………………….. 30

d. Sistema de toma y procesamiento de datos…………………………………………... 30

2.1.2.2.3 Parámetros cromatográficos…………………………………………………... 31

a. Tiempo de Retención (tR)……………………………………………………………... 31

b. Tiempo muerto………………………………………………………………………... 31

c. Factor de Retención (K)………………………………………………………………. 32

d. Selectividad (α)……………………………………………………………………….. 32

e. Eficiencia (N)…………………………………………………………………………. 32

f. Resolución (R)………………………………………………………………………… 33

2.1.2.3 Validación de técnicas analíticas……………………………………………….. 33

2.1.2.3.1 Razones que justifican la validación de métodos analíticos…………………... 34

2.1.2.3.2 Métodos susceptibles de ser validados………………………………………... 35

2.1.2.3.3 Tipos de validación……………………………………………………………. 35

a. Validación Prospectiva……………………………………………………………….. 35

b. Validación Retrospectiva……………………………………………………………... 36

c. Revalidación………………………………………………………………………….. 36

2.1.2.3.4 Características de desempeño analítico……………………………………….. 36

a. Exactitud……………………………………………………………………………… 36

b. Precisión……………………………………………………………………………… 37

c. Selectividad……………………...…………………………………………………… 38

d. Linealidad…………………………………………….………………………………. 39

e. Intervalo………………………………………………………………………………. 40

2.1.2.3.5 Datos requeridos para la validación…………………………………………… 40

2.2 DEFINICIONES OPERACIONALES…………………………………………... 41

2.2.1 Variables independientes………………………………………………………….. 42

2.2.2 Variables dependientes……………………………………………………………. 43

2.3 HIPÓTESIS………………………………………………………………………... 46

8

CAPITULO III

3.1 METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN…………………………………... 48

3.1.1 Método de investigación…………………………………….…………………….. 48

3.1.2 Población y Muestra……………………………………………………………….. 49

3.1.2.1 Población……………………………………………………………………….... 49

3.1.2.2 Muestra……………………………………………….………………………….. 49

3.1.2.2.1 Tipo de muestreo………………………………………………………………. 49

3.1.2.2.2 Tamaño de la muestra…………………………………………………………. 49

3.1.2.2.3 Identificación de muestra…………………………… …………………………50

3.1.2.2.4 Procesamiento de muestra…………………………………………………….. 50

3.1.2.3 Placebo……………………………………..……………………………………50

3.1.3 Parte experimental………………………………………………………………… 50

3.1.3.1 Desarrollo y validación de la técnica analítica………………………………….. 50

1. Objetivo…………………………………………………………………………. 52

2. Alcance………………………………………………………………………….. 52

3. Método de Validación………………………………………………………….... 52

4. Técnica analítica……………………………………….………………………... 52

4.1 Desarrollo de la técnica analítica……..…………………………. 52

4.2 Materiales, reactivos, producto de referencia y equipos………… 53

4.3 Procedimiento analítico………………………………………….. 56

4.3.1 Preparación de fase móvil…………………………………………………………. 56

4.3.2 Preparación de solución estándar………………………………………………….. 56

4.3.3 Preparación de solución prueba…………………………………………………. 56

4.3.4 Ensayo de aptitud del sistema………………………………………………….... 57

5. Parámetros de validación………………………………………………………... 57

5.1 Desarrollo de los parámetros de validación…………………………………. 57

5.1.1 Selectividad de la técnica analítica………………………………….. 57

5.1.1.1 Interferencia del método………………………………………… 57

5.1.1.2 Prueba de estresamiento de muestras………….…………………58

5.1.2 Linealidad de la técnica analítica…………………………………… 59

5.1.2.1 Linealidad del sistema……………………………..…….……… 59

5.1.2.2 Linealidad método………………………………………………. 61

9

5.1.3 Exactitud de la técnica analítica……………………………………… 62

5.1.4 Precisión……………………………………………………………… 63

5.1.5 Robustez……………………………………………………………… 64

5.1.6 Intervalo……………………………………………………………… 65

5.2 RESULTADOS…………..………………………………………………………… 66

5.2.1 Aptitud del Sistema……………………………………………………………… 66

5.2.2 Selectividad……………………………………………………………………… 68

5.2.3 Linealidad……………………………………….………….………….………… 70

5.2.3.1 Linealidad del sistema ……………………………………………………………71

5.2.3.2 Linealidad del Método…………………………………………………………….72

5.2.4. Exactitud………………………………………………………………..………......79

5.2.5 Precisión………………………………………………………………………...... 81

5.2.5.1 Repetibilidad del sistema…………………………………………………………82

5.2.5.2 Repetibilidad del método………………………………………………………… 84

5.2.5.3 Precisión Intermedia………………………………………………………………85

5.2.6 Robustez de la técnica analítica …………………………………………………..87

5.2.7. Intervalo…………………………………………………………………………...89

6. Informe Técnico………………………………………………………………….....90

CAPITULO IV

4.1 DISCUSIONES…………………………………………………………………….. 92

4.2 CONCLUSIONES…………………………….…………………………………….93

4.3 BIBLIOGRAFÍA……………………………….………………………………...... 94

4.5 ANEXOS…………………………………………………………………………….98

10

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1: Características Generales

Tabla 2: Propiedades Físicas y Químicas de Permetrina.

Tabla 3: Datos Requeridos para la validación de técnicas analíticas

Tabla 4: Variable Independiente

Tabla 5: Variable Dependiente

Tabla 6: Estresamiento de Muestras

Tabla 7: Aptitud del Sistema (HPLC).

Tabla 8: Interferencia de las muestras.

Tabla 9: Muestras Estresadas

Tabla 10: Linealidad del Sistema-Isómero Trans

Tabla 11: Linealidad del Sistema-Isómero Cis

Tabla 12: Linealidad del Método Analítico.

Tabla 13: Exactitud de la técnica analítica.

Tabla 14: Repetibilidad del Sistema

Tabla 15: Repetibilidad del Método

Tabla 16: Precisión Intermedia-Analista A

Tabla 17: Precisión Intermedia-Analista B

Tabla 18: Robustez de la técnica analítica.

Tabla 19: Intervalo de la técnica analítica.

Tabla 20: Resumen de Resultados

11

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Piretro

Figura 2: Degradación del piretro

Figura 3: Alcohol Elliot

Figura 4: Fenotrina

Figura 5: Permetrina

Figura 6: Cipermetrina

Figura 7: Deltametrina

Figura 8: Fenvalerato

Figura 9: Cifenotrin

Figura 10: Esquema de una posible configuración de un cromatógrafo liquido isocrático

12

ÍNDICE DE GRÁFICOS

Gráfico 1: Linealidad del Sistema-Isómero Trans

Gráfico 2: Linealidad del Sistema-Isómero Cis

Gráfico 3: Linealidad del Método

13

ANEXOS

ANEXO 1: Ensayo de Aptitud del Sistema (HPLC).

ANEXO 2: Interferencia del Método.

ANEXO 3: Prueba de Estresamiento de Muestras.

ANEXO 4: Linealidad del Sistema.

ANEXO 5: Linealidad del Método.

ANEXO 6: Exactitud de la técnica analítica.

ANEXO 7: Repetibilidad del Sistema.

ANEXO 8: Repetibilidad del Método.

ANEXO 9: Precisión intermedia.

ANEXO 10: Robustez de la técnica analítica.

ANEXO 11: Criterios de Aceptación de los Parámetros de Validación.

14

CAPITULO I

15

1.1 INTRODUCCIÓN

La industria farmacéutica se ha caracterizado desde sus inicios por la necesidad de

alcanzar altos niveles de calidad, para lo cual fue desarrollando procedimientos que han

evolucionado con una reglamentación estricta: en este avance por conseguir un alto

dominio de la calidad, es cuando surge el concepto de validación.

El desarrollo y validación de técnicas analíticas, es una tarea que se viene realizando en

diferentes laboratorios farmacéuticos peruanos en los últimos años, debido al mayor

énfasis que ha puesto la industria en los temas de Aseguramiento de la Calidad y mejora de

la productividad; así mismo, es parte integral de las Buenas Prácticas de Manufactura y

del desarrollo de un método de análisis, puesto que sin fiabilidad de los resultados

analíticos es imposible asegurar que un medicamento cumple con las especificaciones

exigidas, además contribuye a garantizar la calidad de un producto determinado.

En el presente trabajo se ha desarrollado una técnica de análisis para cuantificar Permetrina

1% en shampoo por Cromatografía Liquida de Alta Resolución (HPLC). Las razones de la

preferencia de este tipo de cromatografía son su sensibilidad, su fácil adaptación a las

determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies volátiles

o termolábiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial

interés en la industria y en muchos campos de la ciencia.

El desarrollo y validación de la presente técnica analítica fue realizada en Laboratorios

Portugal S.R.L. en el Departamento de Control de Calidad de acuerdo a la exigencia y

normatividad vigente referida a las Buenas Prácticas de Fabricación de productos

farmacéuticos (USP 36).

Este trabajo aportará conocimientos técnico-científicos que pueden ser aplicados en la

actividad de las áreas de control de calidad e investigación de los laboratorios

farmacéuticos del país, ya que al validar este método analítico, se obtendrá un

procedimiento específico para el análisis en las condiciones propuestas, así mismo se

creará evidencia documentaria de un alto grado de confianza y seguridad, que a su vez

16

minimizará el número de fallos y repeticiones, permitiendo un importante ahorro de costos

por análisis y garantizando la calidad y mejora de la productividad.

17

1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La investigación y el desarrollo son muy importantes en la industria farmacéutica ya que

de ello depende que se puedan desarrollar nuevos productos. (1)

El departamento de desarrollo farmacéutico por lo general trabaja con fármacos,

excipientes, tecnología y formas farmacéuticas, para poder así alcanzar la innovación

mediante la selección, modificación, combinación de lo ya conocido, con el objetivo de

obtener una mejor calidad, disponibilidad, aceptación, eficacia y estabilidad en el

medicamento. (2,3)

En el mercado farmacéutico actual, existen varios medicamentos de gran demanda por la

población, cuyas técnicas de análisis no se encuentran publicadas en las obras oficiales que

generalmente se consultan a saber: Farmacopea americana, británica, europea y japonesa.

Esto hace necesario desarrollar nuevas técnicas de análisis en el laboratorio con el fin de

separar y cuantificar los principios activos de dichos medicamentos. (4,5)

La literatura sobre el desarrollo y validación de métodos analíticos para la determinación

de Permetrina (plaguicida sintético), en productos farmacéuticos es escasa, y la mayoría

están destinados para el análisis de múltiples residuos de piretroides en diferentes y

complejas matrices, por lo tanto, el pre-tratamiento de las muestras. (6)

Usualmente, cada método desarrollado es propuesto especialmente para un tipo de

formulación, no habiendo un método universal propuesto como aplicable para el análisis

de formulaciones de varios usos. (7,8)

Por lo tanto, el objetivo de este estudio será el desarrollo y validación de una metodología

de análisis que emplea la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) para la

determinación de Permetrina 1% en Shampoo y se pueda aplicar al control de calidad de

estos productos.

Por lo anteriormente manifestado es que en el presente trabajo de investigación nos

planteamos la siguiente interrogante:

18

¿El método analítico por Cromatografía Liquida de Alta Resolución para la

cuantificación de Permetrina 1% en shampoo, cumplirá con los parámetros de

desempeño de validación?

19

1.3 OBJETIVOS

1.3.1 GENERAL

Desarrollar y validar un método analítico por Cromatografía Líquida de Alta

Resolución (HPLC) para cuantificar Permetrina 1% en Shampoo.

1.3.2 ESPECÍFICOS

Desarrollar una metodología de análisis capaz de cuantificar el principio activo del

Shampoo de Permetrina.

Demostrar que el método analítico propuesto cumple con las características de

desempeño: selectividad, Precisión, linealidad y exactitud.

Proveer una metodología analítica validada, que sirva como guía a la industria

farmacéutica, para la cuantificación del principio activo.

20

CAPÍTULO II

21

2.1 MARCO TEÓRICO

2.1.1 ANTECEDENTES

García García y Barbas (2001): Desarrollaron y validaron una técnica analítica

utilizando un método de Cromatografía Líquida con Alta Eficiencia para el control de

calidad de lociones y champús que contienen Permetrina como ingrediente activo. En el

trabajo de este grupo, Cis y Trans- permetrina se separaron e identificaron en la misma

serie cromatográfica, que hizo posible la cuantificación de cada isómero. Sin embargo,

según los mismos autores, sólo el isómero Cis se considera activo para el uso previsto. (9)

Rezende, Oliveira y Siqueira. (2008): En el trabajo que desarrollaron para la

cuantificación de Cis Permetrina por HPLC, refieren que Choi, Hoddgson y Rose (2002)

obtuvieron 9,39 y 19,17 mg/ml en los límites de detección y de cuantificación,

respectivamente, cuando se trabaja con una muestra de fluido biológico. Estos valores son

significativamente más altos en comparación con los encontrados en este estudio. (Límite

de Detección = 1,6 mg / ml y Limite de cuantificación = 2,4 mg /ml), que pone de relieve

la necesidad de validación mediante la variación de la matriz de la muestra. También en

relación con los límites de confianza del método para la cuantificación de Cis- permetrina

en loción capilar, se tiene que el valor medio obtenido para la prueba de precisión, medida

en concentraciones de 6,4 a 38,4 mg de Cis- permetrina/ml de muestra fue de 103% (93,0-

107,7%). Este valor es similar a la encontrada por Wang, Moorman y Burleson (2003),

que es 98,8% (94,6%-103%).

En comparación con los resultados de la prueba de precisión intra-ensayo llevado a cabo

por Wang, Moorman y Burleson (2003), que se encontró que el coeficiente de variación

de 0,43%, el promedio de los coeficientes medios de variación obtenidos en el método

propuesto fue mayor (0,96%). Sin embargo, esta diferencia no pone en peligro la exactitud

del método publicado, ya que el valor recomendado por la Agencia Nacional de Vigilancia

Sanitaria (ANVISA) es hasta 5% (BRASIL, 2003). (10)

Modamio et al. (2008-2009): En su investigación, el ensayo de especificidad del método

fue corroborado a través de los cromatogramas realizados, en los cuales los tiempos de

retención fueron entre 9,2 min para el isómero trans y 11,5 min para el isómero cis. En el

22

ensayo de linealidad se obtuvieron coeficientes de correlación de r= 0,9998 para el

isómero trans y r= 0,9997 para el isómero cis. La precisión se demostró a través del CV%

(coeficiente de variación) de la serie de medidas con un valor de 2,07 y 1,73% para el interdia de

los isómeros trans y cis y 2,1 y 0,73% para el intradia respectivamente. La exactitud se

comprobó por el ER% (error relativo porcentual) con valores de -0,2% y -2,05% para el

interdía para los isómeros trans y cis y -0,37% y -0,3% para el intradía de los isómeros. (11)

Tarinas et al. (2010): En su investigación, el ensayo de especificidad del método fue

corroborado a través de los cromatogramas realizados, en los cuales los tiempos de

retención fueron entre 8,8 y 9,2 min para el isómero trans y entre 10,7 y 11,2 min para el

isómero cis. El coeficiente de correlación determinado para ambos isómeros fue mayor que

0,99; el coeficiente de variación fue menor que 3 % y el error relativo porcentual estuvo

entre -3 y 1 %, tanto para los estudios interdía como intradía. Se determinó que la media de

la concentración de permetrina en lotes de solución tópica 1 % resultó de 6 780,14 μg/mL.

En el ensayo de linealidad se obtuvieron coeficientes de correlación de r= 0,9991 para el

isómero trans y r= 0,9988 para el isómero cis. La precisión se demostró a través del CV%

(coeficiente de variación) de la serie de medidas con un valor de 2,48 y 2,0 % para el

ensayo interdía de los isómeros trans y cis y de 2,62 y 2,90 % para el intradía,

respectivamente. La exactitud se comprobó por el ER% (error relativo porcentual) con

valores de -1,02% y -2,71% para los isómeros Trans y Cis en el ensayo interdía, 0,59 y -

0,94 % para el intradía de los isómeros. (12)

Maja Shishovska y Marina Stefova (2010): Concluyeron en un artículo que las

condiciones para el análisis de Permetrina utilizando una columna C18 de rápida

resolución de 5cm x 4.6mm id con partículas de 1.8m son: fase móvil (Acetonitrilo: Agua

en proporción 75:25); Velocidad de Flujo: 1,0mL/min, temperatura: 45°C y Detector: UV

a 215nm. Afirmando que el método propuesto es rápido, simple, exacto y preciso para el

análisis de ambos isómeros de Permetrina en varios tipos de formulaciones aplicables con

el sistema de HPLC convenientes. (13)

En otro artículo acerca de la determinación de permetrina en residuos de vino, Maja

Shishovska y Marina Stefova (República de Macedonia, 2010), concluyeron que el

método directo para la cuantificación de residuos de los isómeros de permetrina en la

23

fabricación de vino son: columna de HPLC RP18 (25cm x 4mm id, 5m); fase móvil

(Acetonitrilo: agua en proporción 70:30); Velocidad de flujo de 2ml/min; temperatura:

25°C y detector: UV a 215nm. En estas condiciones los isómeros de permetrina fueron

bien separados de los componentes naturales del vino y también uno del otro. (14)

M. Saeed Arayne, et al (2011): En el estudio que realizaron para la determinación de

Permetrina, concluyeron que se puede determinar este principio activo usando el método

a 272nm. Teniendo la ventaja de simplicidad, estabilidad, reproducibilidad y precisión y se

asocia con una mayor sensibilidad y precisión. La no interferencia de excipientes hace que

el método sea adecuado para la determinación de la droga en forma de crema y por lo

tanto se puede utilizar para el control de rutina de la calidad de la formulación de

Permetrina de todas las potencias. (15)

Los trabajos mencionados muestran la necesidad de la validación de las técnicas analíticas

y la importancia de su inclusión dentro de los programas de validación en los laboratorios

de Control de Calidad, así como la ventaja en la reducción de costos por análisis y su

aplicación a productos que se comercializan en el mercado.

2.1.2 CONSIDERACIONES TEÓRICAS

2.1.2.1 Piretrinas y Piretroides.

2.1.2.1.1 Generalidades

Las Piretrinas se obtienen del extracto de oleorresina de las flores del crisantemo,

Chrysanthemum cineriaefolium, los piretroides tienen la misma estructura pero se obtienen

por síntesis química modificando su estructura básica para incrementar su estabilidad en el

ambiente natural.

Son insecticidas muy populares y se calcula que existen aproximadamente 2000 productos

que los contienen. En general son insecticidas de baja toxicidad por lo que se les

recomienda para uso en salud pública, para fumigar hospitales, restaurantes, comedores y

para el propio hogar. (16)

24

Tabla 1. Características Generales de Piretrinas y Piretroides.

PIRETRINAS PIRETROIDES

Insecticidas de origen natural (flor del

crisantemo).

Poco soluble en agua.

Inestables a la luz y al calor No

persistentes.

Insecticidas sintéticos.

Se disuelven mejor en agua.

Fórmula química modificada para

mejorar la estabilidad Más persistente.

Fuente: Piretrinas y piretroides. Dr. Diego Gonzales Machin.

2.1.2.1.2 Piretroides

2.1.2.1.2.1 Definición

Se definen como ésteres de ácidos derivados del ciclopropano. Son poco tóxicos para los

mamíferos, quienes los metabolizan y excretan con rapidez. Dejan residuos muy bajos o

nulos: en el suelo, se descomponen; son solubles en agua. (17)

2.1.2.1.2.2 Clasificación

a) Piretroides de Primera Generación

Se generaron en las décadas 40 al 60. Aletrinas y sus isómeros, Partrina, Dimetrina,

Benatrina, Tetrametrina, etc. (17)

Figura1. Piretro

El piretro se halla constituido por seis ésteres de dos ácidos: crisantémico y piretrico. El

pirétrico se degrada. (1 7)

25

Figura 2. Degradación del Piretro

El alcohol Elliot es más efectivo y no tan tóxico (17)

.

Figura 3.Alcohol Elliot

El primero fue la FENOTRINA:

Figura 4. Fenotrina

b) Piretroides de Segunda Generación

En la década del 70 los japoneses reemplazaron los metilos de la cadena lateral del carbono

3 del ciclopropano por cloro, obteniéndose el primer piretroide totalmente fotoestable: la

PERMETRINA: (17)

26

Figura 5. Permetrina

Su acción insecticida es aumentada fuertemente por los ingleses por el grupo ciano en el

carbono del hidroxilo alcohílo: (17)

Figura 6. Cipermetrina

Luego aparece la deltametrina (muy aplicado en el uso de cucarachas). No es muy tóxico.

(17)

Figura 7. Deltametrina

Finalmente, manteniendo la estructura alcohólica, pero modificando la ácida, eliminando el

ciclopropano, se llegó al: (17)

Figura 8. Fenvalerato

27

c) Piretroides de Tercera Generación

Buscando fotoestabilidad, poca volatilidad, fuerte acción letal, buena estabilidad, pero

eliminando los halógenos, por considerarlos causantes de residuos. Nace así el

CIFENOTRIN. (17)

Figura 9. Cifenotrin

2.1.2.1.3 Permetrina

Es un plaguicida sintético de amplio espectro perteneciente al grupo químico de los

piretroides, cuyo mecanismo de acción es la neurotoxicidad. (18)

Se usa principalmente para matar insectos, arañas y orugas, como también para repeler una

amplia gama de insectos. Produce reacciones de hipersensibilidad en mamíferos,

incluyendo a los seres humanos. (19)

La permetrina es elegida por la OMS (organización mundial de la salud) como

tratamiento de primera elección para combatir los piojos. (20)

28

2.1.2.1.3.1 Propiedades Físicas y Químicas de Permetrina.

Tabla 2. Propiedades Físicas y Químicas de Permetrina.

Fuente: es.wikipedia.org/wiki/permetrina

2.1.2.2 Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC).

2.1.2.2.1 Definición

La Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución - HPLC (por sus siglas en inglés), es una

técnica utilizada para la separación, identificación cualitativa y determinación cuantitativa

de componentes químicos en mezclas complejas. (21)

Ampliamente utilizada en la industria farmacéutica por las ventajas que la técnica presenta,

obteniendo un análisis cuantitativo rápido y preciso, es una operación automatizada, tiene

una alta sensibilidad de detección pudiendo detectar nanogramos, picogramos, inclusive

niveles de femtogramos; y una de las ventajas más importantes es la susceptibilidad a la

detección de un 60% a 80% de todos los componentes existentes. Por otra parte, las

PERMETRINA

Nombre (IUPAC) sistemático

3-Phenoxybenzyl

(1RS)-cis,trans-3-(2,2-dichlorovinyl) -2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate

General

Fórmula semidesarrollada C21H20Cl2O3

Identificadores

Número CAS 52645-53-11

Propiedades físicas

Apariencia cristales incoloros

Densidad 1190 kg/m3; 1.19g/cm

3

Punto de fusión 307 K (34 °C)

Punto de ebullición 473 K (200 °C)

Propiedades químicas

Solubilidad en agua Insoluble (5.5 x 10-3

ppm)

Compuestos relacionados

Piretroides Bifentrín

Deltametrín

http://es.wikipedia.org/wiki/Uni%C3%B3n_Internacional_de_Qu%C3%ADmica_Pura_y_Aplicada

http://es.wikipedia.org/wiki/F%C3%B3rmula_semidesarrollada

http://es.wikipedia.org/wiki/N%C3%BAmero_CAS

http://es.wikipedia.org/wiki/Permetrina#cite_note-1

http://es.wikipedia.org/wiki/Densidad

http://es.wikipedia.org/wiki/Kilogramo

http://es.wikipedia.org/wiki/Metro_c%C3%BAbico

http://es.wikipedia.org/wiki/Gramo

http://es.wikipedia.org/wiki/Cent%C3%ADmetro_c%C3%BAbico

http://es.wikipedia.org/wiki/Punto_de_fusi%C3%B3n

http://es.wikipedia.org/wiki/Punto_de_ebullici%C3%B3n

http://es.wikipedia.org/wiki/Solubilidad

http://es.wikipedia.org/wiki/Partes_por_mill%C3%B3n

http://es.wikipedia.org/wiki/Piretroide

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Bifentr%C3%ADn&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/Deltametr%C3%ADn

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Permethrin-2D-skeletal.png

29

limitaciones que presenta, son que el sistema no cuenta con un detector universal como en

otros sistemas, por lo tanto la detección es problemática si el analito no absorbe haces de

luz UV, otra desventaja se da cuando el analito no es fácilmente ionizado; y por último, la

técnica por HPLC, tiene muchos parámetros operacionales que lo hace dificultoso para un

principiante. (22)

Existiendo cuatro tipos principales de técnicas de HPLC que responden a las fuerzas

moleculares básicas: fuerzas iónicas, fuerzas polares y fuerzas de dispersión; cada técnica

específica a cada una de ellas: las fuerzas polares son el tipo dominante de las

interacciones moleculares empleadas en HPLC de fase normal; las fuerzas de dispersión

son empleados en HPLC de fase reversa; las fuerzas iónicas son empleados en HPLC de

intercambio iónico; y el cuarto tipo de técnica de HPLC de exclusión de tamaño, se basa en

la separación dinámica de las moléculas de acuerdo al tamaño que presente, sin la

interacción del analito con la fase estacionaria. (23)

2.1.2.2.2 Partes

a. Bomba

El sistema de bombas puede ser considerado como el corazón del HPLC; las

características de funcionamiento y rendimiento de la bomba fundamentalmente definen

y limitan el tipo de separaciones que pueden ser realizadas; las características más

importantes son: a) la reproducibilidad de caudal, b) el rango de caudal, c) la estabilidad

de la presión. (24)(25)

Existen cuatro tipos de bombas: Las bombas de presión constante, las bombas de caudal

constante, las bombas alternativas y las bombas de jeringa. (25)

b. Inyectores

La muestra a analizar debe ser introducida en la fase móvil; una válvula de inyección

adecuadamente diseñada y utilizada de manera correcta, asegura máxima eficiencia

durante la cromatografía. Hoy en día la inyección manual es poco frecuente y sólo es

30

justificado cuando la cantidad de muestra es limitada; la utilización de inyectores

automáticos facilita la transferencia de muestras y el procesamiento automático de

variables operativas como el control de volumen, número de inyecciones, el intervalo

entre las inyecciones, ciclos de enjuague de las muestras; suprimiendo factor del error

humano y mejorando la precisión del método. (24)

c. Detectores

El propósito de un detector en un sistema de HPLC es identificar la presencia de

componentes de interés del eluyente proveniente de la columna del HPLC. El analito es

reconocido por interacciones fisicoquímicas como por ejemplo la de absorbancia de

radiación UV en una cierta longitud de onda.

Los detectores pueden ser clasificados dentro de dos categorías; los detectores basados

en una propiedad de disolución que responden cualquier cambio de la alguna propiedad

física de la fase móvil, tal como el índice de refracción, la constante dieléctrica, o la

densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por contraste, los detectores

basados en una propiedad del soluto responden únicamente a propiedades del analito,

como la absorbancia UV, fluorescencia, o actividad electroquímica, que no son propias

de la fase móvil.

d. Sistemas de toma y procesamiento de datos

Para toma de datos, procesamiento de datos y el reporte, el uso de un sistema

informático integrado es esencial. Este sistema integrado, recibe y almacena la señal de

los detectores e imprime cromatogramas completos, e incluso controla la mayoría de

variables operativas como selección de muestras, válvulas de muestreo, condiciones del

detector, entre otros; simplificando el trabajo tedioso de una selección manual de las

condiciones operativas cromatográficas; con el objetivo de obtener el cromatograma

con fracciones separadas e identificadas de cuya interpretación puede extraerse

conclusiones cualitativas y cuantitativas de mezclas complejas. (26)

31

Figura 10. Esquema de una posible configuración de un cromatógrafo liquido isocrático

2.1.2.2.3 Parámetros Cromatográficos

a. Tiempo de Retención (tR)

Cada analito específico está representado por un pico en el cromatograma; estos picos

son simétricos y se asemejan a una curva de distribución normal tipo Gaussiana.

La distancia máxima del pico desde el punto de inyección, expresado en unidades de

tiempo se llama tiempo de retención (tR). El tiempo de retención de analito es

dependiente del caudal de fase móvil; a mayor velocidad del caudal de flujo, más

pequeño es el tiempo de retención de analito. El producto del tiempo de retención de

analito y el caudal de fase móvil es el volumen de retención (VR). (27)

b. Tiempo muerto

Es el tiempo requerido por un compuesto inerte para migrar desde la inyección en la

columna sin retraso por la fase estacionaria. Por consiguiente, el tiempo muerto es

idéntico con el tiempo de residencia del compuesto en la fase móvil. (26)(27)

32

c. Factor de Retención (K)

La retención del analito se compone de dos partes: 1) El tiempo que el analito eluye en

la fase móvil; 2) el tiempo que el analito es retenido en la fase estacionaria. La

diferencia entre el tiempo total de retención (tR) y el tiempo de demora, se denomina

tiempo de retención reducido (t’R), y la correspondiente diferencia entre el volumen de

retención del analito y el volumen muerto se llama volumen de retención neta (V’R).

La relación entre el volumen de retención reducido y del volumen muerto da un

parámetro adimensional llamado factor de retención, (K) llamado también factor de

capacidad. (27)

d. Selectividad (α)

La capacidad del sistema Cromatográfico para discriminar diferentes analitos se llama

selectividad (α). La selectividad se determina como la relación de los factores de

retención de dos analitos, o la relación de los tiempos de retención reducida.

La retención relativa describe la capacidad de un sistema Cromatográfico de discriminar

entre dos compuestos; es independiente de la longitud de columna y la velocidad de

flujo; por el contrario es dependiente de la temperatura y las propiedades de la fase

móvil y la fase estacionaria. (26)(27)

e. Eficiencia (N)

La eficiencia es la medida del ensanchamiento de cinta cromatográfica y el número de

los platos teóricos (N) en la columna.

El número de los platos teóricos caracteriza la calidad de la columna y los fenómenos de

transferencia de masas. Valores grandes para N califican la columna para separar

mezclas complejas. (27)

33

f. Resolución (R)

La resolución (R) está definida como la proporción de la distancia entre dos picos a la

anchura media de los mismos y este descriptor abarca tanto eficacia como selectividad.

(27)

2.1.2.3 Validación de Métodos analíticos

Es el establecimiento de la evidencia documental de que un procedimiento analítico

conducirá con un alto grado de seguridad a la obtención de resultados precisos y exactos,

dentro de las especificaciones y los atributos de calidad previamente establecidos. (28)

Aunque los estudios de validación de técnicas analíticas se han realizado en la industria

farmacéutica durante mucho tiempo, hoy en día es de uso rutinario debido a un mayor

énfasis de la industria en los últimos años de garantía de calidad y mejora de la

productividad. La validación de técnicas analíticas es una parte necesaria del programa de

gestión de calidad y es fundamental para una operación de producción eficiente y es parte

integral de las Buenas prácticas de manufactura; todo el conjunto de procesos de

validación están descritos en un Plan Maestro de Validaciones, este plan considera el

desarrollo de actividades como la Calificación del Sistema que viene a ser la ejecución de

pruebas para determinar si un componente de un proceso posee los atributos requeridos

para trabajar correctamente la técnica analítica elegida, esta primera etapa considera:

Calificación del diseño (DQ):

Define los datos específicos funcionales y operacionales del instrumento y sistemas

auxiliares, de acuerdo a los requerimientos de las Buenas Prácticas de Manufactura.

Es sumamente importante la selección cuidadosa de los procedimientos de prueba y

límites de la aceptación definidos.

34

Calificación de la Instalación (IQ):

Establece que el equipo y los sistemas auxiliares son entregados de acuerdo al

diseño y especificación del fabricante, instalados en el ambiente seleccionado, y

que este ambiente es conveniente para la operación y el empleo del instrumento.

Calificación operacional (OQ):

Es el proceso de demostración que un instrumento funcionará según su

especificación operacional en el ambiente seleccionado, el objetivo principal es de

asegurar que el hardware y software del equipo se encuentran funcionales según los

datos específicos requeridos en el documento DQ.

Calificación del performance (PQ):

Establece por evidencia objetiva que el proceso, bajo condiciones delimitadas,

produce constantemente un producto que cumple con las características de calidad

deseadas y que las especificaciones del proceso no afectan al producto final.

Los métodos analíticos deben ser validados antes de su introducción en el uso de rutina; y

revalidados al cambio de las condiciones del método validado (por ejemplo, un

instrumento con características diferentes o muestras con una matriz diferentes); al cambio

en el procedimiento analítico que se encuentra fuera del alcance de aplicación inicial del

método; al cambio en la síntesis del principio activo, al cambio de la composición del

producto terminado. (29-33)

2.1.2.3.1 Razones que justifican la validación de métodos analíticos

Demostrar que los métodos son adecuados a los análisis propuestos en las

condiciones descritas, la validación es la herramienta que permite obtener las

pruebas documentales al respecto.

Trabajar con métodos que ofrezcan confianza y seguridad en los resultados, lo cual

a su vez minimizara el número de fallos y repeticiones, permitiendo un importante

ahorro de costes.

35

Trabajar con métodos validados, permite no sólo el conocimiento del método

analítico, sino también cumplir con las exigencias legales tanto de registro de

especialidades farmacéuticas como las buenas prácticas de laboratorio, con el fin de

asegurar la calidad y eficacia del producto.

La validación es también un paso o requisito previo de los procesos de

transferencia de métodos analíticos. (28)

2.1.2.3.2 Métodos susceptibles de ser validados

Son validables los métodos analíticos clasificados en la siguiente forma:

Ensayos de identificación.

Ensayos para la determinación del analito de interés de una materia prima o de una

especialidad farmacéutica.

Ensayos para la determinación de características farmacotécnicas inherentes.

Ensayo de límite de impurezas y de cuantificación de impurezas.

Ensayo para la determinación de analitos en fluidos biológicos y en productos

naturales.

Ensayos microbiológicos.(28)

2.1.2.3.3 Tipos de validación

a) Validación Prospectiva

Se realiza cuando la verificación del cumplimiento de las condiciones establecidas para un

proceso o método analítico se lleva a cabo antes de la comercialización del producto. Este

tipo de validación se aplica cuando se elabora un nuevo método analítico. Es típico en los

laboratorios de investigación y desarrollo, y se realiza de acuerdo con un protocolo

perfectamente planificado. Comprende el estudio de todos los criterios necesarios para

demostrar el buen funcionamiento del método. (34)

36

b) Validación Retrospectiva

Se realiza cuando la idoneidad del método o proceso analítico se basa en la garantía

constatada a través de los datos analíticos del producto ya comercializado, se aplica a

métodos no validados previamente y de los que se tiene una amplia historia de resultados.

(34)

c) Revalidación

La introducción de un cambio que pueda afectar la idoneidad del método analítico

establecido por la validación, podrá exigir una nueva validación, es decir una revalidación

total o parcial de dicho método analítico. Los criterios a estudiar se deciden en función del

tipo de cambio efectuado.

Entre los motivos que exige una nueva validación tenemos:

Cambios importantes en la matriz del producto.

Cambios importantes en el método analítico.

Cambios en las especificaciones. (34)

2.1.2.3.4 Características de desempeño analítico.

a. Exactitud

La exactitud está definida como la concordancia entre el resultado obtenido mediante el

método elegido y el valor verdadero. La falta de exactitud puede ser por exceso o por

defecto; las desviaciones por exceso suelen producirse cuando existen interferencias

analíticas y la selectividad del método no es la adecuada obteniéndose valores superiores al

valor verdadero; las desviaciones por defecto suelen darse en métodos analíticos muy

laboriosos, con varias fases, extracciones, purificaciones, etc., que se traducen en una

disminución de la recuperación.

Matemáticamente, la exactitud se expresa en forma de porcentaje de recuperación de la

cantidad de analito presente en la muestra o bien en forma de diferencia entre el valor

hallado y el valor verdadero (error o error porcentual).

37

Estadísticamente, suele efectuarse un test de “t” de student para determinar si el valor

medio del error y valor considerado verdadero no difieren significativamente para un grado

de probabilidad determinado.

Las pautas de validación de los métodos analíticos descritos por la ICH recomiendan que

se evalúe realizando un mínimo de nueve determinaciones de tres niveles de

concentración, cubriendo así, el intervalo especificado. (28)(31)(35)(36)

b. Precisión

La precisión de un método analítico es el grado de concordancia entre los valores de una

serie repetida de ensayos analíticos efectuados sobre una muestra homogénea o expresado

de otra forma, es la distribución de los valores analíticos alrededor de su media. La

precisión de un método analítico habitualmente se expresa como la desviación estándar o

la desviación estándar relativa de una serie de mediciones. (28)

Dentro del término precisión se pueden distinguir el grado de reproducibilidad o de

repetibilidad del método analítico en condiciones normales de operación. En este contexto,

la reproducibilidad se refiere a la medida de precisión de los resultados de un método

analítico efectuado por laboratorios diferentes y en condiciones diferentes (diferentes

analistas, equipos, días, etc.). Una precisión intermedia expresa la variación dentro de un

laboratorio, por ejemplo en diferentes días, con diferentes analistas o con equipos

diferentes dentro del mismo laboratorio.

La repetibilidad se refiere a la medida de la precisión de un método efectuado en las

mismas condiciones, sobre la misma muestra, por el mismo analista, en el mismo

laboratorio, con el mismo equipo y en el curso de la misma serie de análisis efectuados

durante un periodo de tiempo corto.

La precisión de un método analítico matemáticamente se expresa por la desviación

estándar de la desviación estándar relativa.

38


se evalúe la repetibilidad analizando un mínimo de nueve determinaciones que cubran el

intervalo especificado para el procedimiento. (28)(31)(35)(36)

c. Selectividad

Se define como la capacidad para medir y/o identificar simultáneamente el analito en

presencia de aquellos componentes cuya presencia resulta previsible, como impurezas,

productos de degradación y componentes relacionados o productos de degradación que

puedan estar presentes en la matriz.

La selectividad de un método analítico, se determina comparando los resultados de análisis

de muestras conteniendo impurezas, siendo un parámetro crucial para conseguir una buena

exactitud por lo que es, en todos los casos, un criterio clave.

Los estudios de selectividad varían según el método aplicado:

Métodos de identificación. Debe demostrar que el método funciona en presencia

de otras sustancias que pueden interferir y de aquéllas de composición similar.

Ensayos de pureza. Debe garantizar que el método analítico permite la evaluación

de impurezas cualitativa o cuantitativamente.

Determinación cuantitativa de un componente. Debe asegurar que la señal

medida con el método analítico procede únicamente de la sustancia analizada sin

interferencia de excipientes, productos de degradación y/o impurezas cuando se

determina el contenido en principio activo u otro componente (conservador,

antioxidante) en un medicamento.

Para la determinación de la selectividad, se pueden plantear diferentes alternativas. Una de

ellas es por la adición de interferencias, en estos casos se puede comprobar la selectividad

comparando los resultados del análisis de muestras con o sin analito en presencia o

ausencia de dichas interferencias; para la determinación de una forma farmacéutica el

39

grupo de muestras a preparar serían: matriz, analito, matriz + analito, matriz + analito +

impurezas + productos de degradación.

La otra aplicación es utilizando pruebas confirmatorias con muestras sometidas a estrés

para generar compuestos potencialmente interferentes, por lo cual, adquiere importancia

para métodos que se desea evaluar la estabilidad de un principio activo o forma

farmacéutica; estas condiciones, para lograr una degradación se somete a degradaciones de

luz, humedad relativa, calor, hidrólisis ácida, hidrólisis básica y oxidación.

La selectividad se confirma cuando un pico de la absorbancia es puro y no hay ninguna

interferencia del placebo en el tiempo de retención correspondiente al analito. (28)(35)(36)

d. Linealidad

La linealidad de un método analítico incluye la proporcionalidad entre la concentración del

analito y su capacidad de respuesta, así como el intervalo de concentraciones del analito

para los cuales el método es satisfactorio. La linealidad se relaciona además, con la

sensibilidad de calibrado (representación gráfica del cociente entre la señal del analito y la

señal del patrón frente a la concentración de analito de los patrones).

La determinación de la linealidad se realiza calculando la curva de calibración que

relaciona respuesta (áreas, alturas, absorbancias, etc.) con una concentración de analito

determinado. Generalmente se pretende obtener una recta de calibración, determinándose

los parámetros de la recta de regresión; para algunos casos, la obtención del parámetro de

linealidad entre la respuesta de un analito y su concentración, se tienen que someter a una

transformación matemática. Los datos obtenidos a través de la línea de regresión pueden

ser útiles para proporcionar estimaciones matemáticas del grado de linealidad. Se debería

presentar el coeficiente de correlación, la intersección del eje de ordenadas, la pendiente de

la línea de regresión y la suma de los cuadrados residuales.


para establecer la linealidad se utilice normalmente un mínimo de 5 concentraciones.

También recomienda que para la valoración de un fármaco (o de un producto terminado) se

realice dentro del intervalo de 80% a 120% de la concentración de prueba. (28)(31)(36)

40

e. Intervalo

El intervalo del procedimiento se valida verificando que el procedimiento analítico

proporciona precisión, exactitud y linealidad aceptables cuando se aplica a muestras que

contienen el analito en los extremos del intervalo, al igual que dentro del intervalo. (37)

2.1.2.3.5 Datos Requeridos para la Validación

Los requisitos de las pruebas farmacopeicas varían desde determinaciones analíticas muy

rigurosas hasta evaluaciones subjetivas de atributos. Considerando esta amplia variedad, es

lógico que diferentes procedimientos de prueba requieran diferentes esquemas de

validación.

Las categorías de prueba más habituales para las que se exigen datos de validación se

indican a continuación: (37)

Categoría I: Procedimientos analíticos para la cuantificación de los componentes

principales de fármacos a granel o ingredientes activos (incluyendo conservantes) en

productos farmacéuticos terminados.

Categoría II: Procedimientos analíticos para la determinación de impurezas en fármacos a

granel o productos de degradación en productos farmacéuticos terminados. Estos

procedimientos incluyen análisis cuantitativos y pruebas de límite.

Categoría III: Procedimientos analíticos para la determinación de las características de

desempeño (p.ej. disolución, liberación de fármacos, etc.).

Categoría IV: Pruebas de identificación.

Para cada categoría, se requiere diferente información analítica. En la Tabla 3 se indican

los datos que normalmente se requieren para cada una de estas categorías.

41

Tabla 3. Datos requeridos para la validación de técnicas analíticas

Características de Desempeño

Analítico Categoría I

Categoría II

Categoría III Categoría IV Análisis Cuantitativos Pruebas de Límite

Exactitud Sí Sí * * No

Precisión Sí Sí No Sí No

Especificidad Sí Sí Sí * Sí

Límite de Detección No No Sí * No

Límite de Cuantificación No Sí No * No

Linealidad Sí Sí No * No

Intervalo Sí Sí * * No

*Pueden Requerirse, dependiendo de la naturaleza de la prueba específica. (USP 36)

2.2. DEFINICIONES OPERACIONALES

2.2.1 Variables Independientes.

Cuantificación de Permetrina.

2.2.2 Variables Dependientes.

Validación de un método analítico.

42

Tabla 4: Variable Independiente

Variable

Independiente

Definición Conceptual

Definición Operacional

Indicador

Escala

Cuantificación de

Permetrina

Permetrina es un plaguicida sintético de amplio

espectro, indicada para erradicar parásitos

dérmicos como los piojos y los causantes de la

escabiosis (sarna), que se cuantificara mediante

el método de HPLC.

HPLC, es una técnica utilizada para la separación,

identificación cualitativa y determinación

cuantitativa de componentes químicos en mezclas

complejas, el cual permite obtener un análisis

cuantitativo rápido y preciso.

Método analítico:

HPLC

Intervalo tipo

cuantitativo.

Conforme-No

conforme.

43

Tabla 5: Variable Dependiente

Variables

Dependientes

Definición Conceptual Definición Operacional Indicador Escala

Validación de

un método

analítico.

Pruebas documentadas

que proporcionan un alto

grado de certeza de que

un proceso específico

coherentemente

producirá un producto

que cumpla sus datos

específicos

predeterminados y

atributos de calidad,

utilizando la

Cromatografía Líquida

de Alta Resolución

(HPLC), según normas

establecidas en

Farmacopea

Estadunidense 36 y

normas ICH.

Selectividad:

Capacidad para

medir y/o identificar el analito en presencia

de aquellos componentes cuya presencia

resulta previsible, como impurezas, etc

Solución estándar [0,5mg/ml]

Linealidad:

Proporcionalidad entre la concentración del

analito y su capacidad de respuesta.

Se trabajará a concentraciones de 50%,

75%, 100%, 125%, 150%

r= indica el grado de correlación entre “x” y

“y”. Si “r” es cercano a la unidad significa que

existe correlación con una probabilidad

elevada.

r2= Expresa la proporción de la variación total

de “Y” explicada por el modelo lineal.

Selectividad

Por adición de interferencias

Lectura del Placebo

Linealidad

Coeficiente de Correlación (r)

∑ ∑ ∑

√ ∑ ∑ ) ) ∑ ∑ )

Coeficiente de Determinación (r)2

r2

Selectividad

El TR del pico

principal en el

cromatograma de la

muestra debe ser

similar al TR del

estándar.

No debe interferir.

Linealidad

Mayor o igual que

0,999

Mayor o igual que

0,998

44

Precisión:

Grado de concordancia entre los valores de

una serie repetida de ensayos analíticos.

CV(%)=expresa la relación entre la lectura

o respuesta y la concentración.

Estudia la variabilidad del método

efectuando una serie de análisis sobre la

misma muestra pero en condiciones

operativas diferentes.

Exactitud:

Concordancia entre el resultado obtenido

mediante el método elegido y el valor

verdadero

%R= Determina la fracción de analito

adicionada a una muestra de prueba

(muestra fortificada o

adicionada) previa al análisis

Precisión

Repetibilidad del Sistema: estudia la variabilidad

debida únicamente al instrumento.

Repetibilidad del Método: El ensayo se efectúa

sobre una muestra homogénea.

)

(Coeficiente de variación)

Precisión Intermedia:

)

Exactitud

El % de recuperación promedio

Precisión

CV o RSD < 2,0

CV o RSD < 2,0

Exactitud

Máximo 3,0 %

45

Se utiliza el test de student para confirmar

la recuperación del estudio.

Determina si las varianzas son homogéneas,

es decir si el factor de concentración no

influye en la variabilidad de resultados.

Se trabajará con concentraciones al 50%,

100% y 150%

Test de recuperación promedio y el 100% y n-1

Grados de Libertad

| |

Test de igualdad de variancias de varios grupo

muéstrales del mismo Tamaño.

Gtabla (α=0.05, k, n)

Según farmacopea estadunidense 36, y normas ICH

T exp. < T tabla

(2,306)

G exp < G tab

(0,871)

46

2.3. HIPÓTESIS

La técnica analítica desarrollada para la cuantificación Permetrina 1% por cromatografía líquida de alta Resolución, cumple con los

parámetros de desempeño de la validación.

47

CAPÍTULO III

48

3.1 METODOLOGÍA

3.1.1 Método de Investigación

a) De acuerdo al tipo de estudio:

Experimental: Porque existirá manipulación deliberada de variables, con el fin

de investigar las posibles relaciones causa – efecto.

b) De acuerdo al periodo en que se capta la información:

Prospectiva: Porque se registrará la información según van ocurriendo los

fenómenos.

c) De acuerdo a la evolución del fenómeno estudiado:

Transversal: Porque se estudiarán las variables simultáneamente en un

determinado momento.

d) De acuerdo con la comparación de las poblaciones:

Descriptivo: porque se estudiará solo a una población, la cual se pretenderá

describir en función de un grupo de variables.

e) De acuerdo con la interferencia del investigador en el fenómeno que se analiza:

De observación: porque el investigador solo podrá describir o medir el

fenómeno estudiado

49

3.1.2 Población y Muestra.

3.1.2.1 Población

SHAMPOO DE PERMETRINA 1%, fabricado en Laboratorios Portugal S.R.L.

3.1.2.2 Muestra

3.1.2.2.1 Tipo de muestreo.

Aleatorio al azar.

3.1.2.2.2 Tamaño de la muestra

Se utilizó la fórmula para cálculo de datos globales:

Donde:

N: es el tamaño de la población o universo.

k: Constante que depende del nivel de confianza.

e: es el error muestral deseado, en tanto por uno.

p: proporción de individuos que poseen en la población la característica de estudio.

Este dato es generalmente desconocido y se suele suponer que p=q=0.5 que es la

opción más segura. q: proporción de individuos que no poseen esa característica, es

decir, es 1-p.

n: tamaño de la muestra.

Datos:

N: 1 Litro de Shampoo de Permetrina 1% (1,96)2x1x0.5x 0.5

k: 1,96 (nivel de confianza 95%) (0)2

(28-1) + (1,96)2

x 0,5 x 0,5

e: 0 , porque la muestra es homogénea.

p: 0.5 n = 1,0 L

n: tamaño de muestra

n =

50

3.1.2.2.3 Identificación de muestra

Las muestras se rotularon con la siguiente información: nombre del producto,

lote, fecha de muestreo y nombre del muestreador.

3.1.2.2.4 Procesamiento de muestra

Las muestras se almacenaron en la sección del área de Desarrollo y Validación

de Técnicas Analíticas, en un ambiente cerrado y protegido de la luz (si se

considera necesario) hasta su respectivo análisis.

3.1.2.3 Placebo

Se preparó de acuerdo a su respectiva fórmula cuali-cuantitativa, 300ml de

placebo del producto Shampoo de Permetrina 1%, el cual fue sumistrado en su

totalidad al área de Desarrollo y Validación de Técnicas Analíticas.

Uso del placebo: Determinar si el producto tiene o no impurezas y si interviene con el

principio activo.

3.1.3 PARTE EXPERIMENTAL

3.1.3.1 DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE LA TÉCNICA ANALÍTICA

Departamento de Control

de Calidad PROTOCOLO DE VALIDACION DE

METODOS ANALITICOS VERSION: 01

PVT – 0304 - GEN

PERMETRINA 1% SHAMPOO

CONTENIDO

1. Objetivo

2. Alcance.

3. Método de Validación.

4. Técnica analítica.

4.1 Desarrollo de la técnica analítica.

4.2 Materiales, reactivos, producto de referencia y equipos.

4.3 Procedimiento analítico.

51

4.3.1 Preparación de fase móvil.

4.3.2 Preparación de solución estándar.

4.3.3 Preparación de solución prueba.

4.3.4 Ensayo de aptitud del sistema.

5. Parámetros de validación.

5.1 Desarrollo de los parámetros de validación.

5.1.1 Selectividad de la técnica analítica.

5.1.1.1 Interferencia del método.

5.1.1.2 Prueba de estresamiento de muestras.

5.1.2 Linealidad de la técnica analítica.

5.1.2.1 Linealidad del sistema.

5.1.2.2 Linealidad método analítico.

5.1.3 Exactitud de la técnica analítica.

5.1.4 Precisión de la técnica analítica.

5.1.5 Robustez de la técnica analítica.

5.1.6 Intervalo de la técnica analítica.

5.2 Resultados

5.2.1 Aptitud del Sistema



5.2.3.1 Linealidad del sistema.

5.2.3.2 Linealidad del Método.



5.2.5.1 Repetibilidad del sistema.

5.2.5.2 Repetibilidad del método.

5.2.5.3 Precisión Intermedia



6. Informe Técnico

52

1. Objetivo

Establecer y demostrar que el método analítico para la valoración del analito Permetrina

por cromatografía líquida de alta resolución, cumpla con las características de

desempeño: selectividad, precisión, linealidad, exactitud, rango y robustez, cumpliendo

en forma consistente y repetitiva las especificaciones establecidas, proporcionando

resultados confiables.

2. Alcance

El Protocolo de Validación tiene por alcance realizar la valoración de todos los

productos que tengan en su composición como analito Permetrina, y estén fabricados

bajo la misma fórmula cuali-cuantitativa.

3. Método de Validación

3.1 Tipo de Validación

Se aplica la validación de tipo PROSPECTIVA al método analítico.

4. Técnica Analítica

La técnica analítica descrita se desarrolló y validó por Cromatografía Líquida de Alta

Resolución (HPLC).

4.1 Desarrollo de la técnica analítica

Para armar la técnica analítica se procedió a desarrollar una serie de parámetros, con la

finalidad de encontrar los adecuados y más afines al principio activo a evaluar.

De acuerdo a la naturaleza del principio activo, soluble en metanol, se preparó una fase

móvil a base de metanol y agua en una proporción de 83:17 v/v descartándose así

cualquier precipitación de la muestra dentro del equipo. Posteriormente se seleccionó la

columna cromatográfica Nucleosil 100 C18 de 125mm x 4,0mm x 5m, permitiendo de

esta manera una mejor separación de los compuestos.

Para determinar la longitud de onda con la cual se realizará la lectura, se utilizó un

cromatógrafo líquido de alta resolución con un detector DAD (Detector Diodo - Array)

cuyo rango de longitud de onda es de 200nm a 400nm. La lectura del pico del principio

activo se detectó en una longitud de onda de 254nm.

53

Por último se preparó la muestra de Permetrina y se realizó el ensayo para seleccionar

el volumen de inyección, flujo adecuado y estimar el tiempo de retención para los picos

del principio activo. Una vez determinados estos parámetros se procedió a realizar la

validación de la técnica analítica.

4.2 Materiales, Reactivos, Producto de referencia y Equipos

Materiales:

Pipetas graduadas de 1mL.

Vaso de precipitado de 250mL.

Probeta de 1000mL.

Probeta de 100mL.

Frascos vidrio con tapa azul de 2000mL.

Fiolas de 5mL y 10mL.

Fiolas de 25mL y 20mL.

Fiolas de ámbar de 100mL.

Pipeta volumétrica de 1mL, 2mL, 3mL y 5mL.

Viales para HPLC de color ámbar.

Jeringas de 10mL.

Membranas filtrantes con tamaño de poro de 0,45 µm.

Reactivos:

Metanol, grado gradiente para cromatografía líquida, marca MERCK.

Lote: I664707.

Lote: I670207.

Lote: I687507.

Hidróxido de sodio en pellets GR para análisis, marca MERCK.

Lote: 0000015080.

Ácido Clorhídrico al 37% para análisis, marca MERCK.

Lote: K44364917.

Peróxido de Hidrógeno al 30% para análisis, marca MERCK.

Lote: K40128210.

54

Agua grado HPLC.

Lote: No aplica.

Producto de referencia:

Estándar:

Nombre del estándar: Permetrina.

Tipo de estándar: Secundario.

Código: SSTD-60-01-12.

Lote: 1203047.

Fecha de vencimiento: 2014-06-30.

Potencia: Isómero Cis 27.89% e Isómero Trans 68.38%

Equipos:

LÁMPARA ULTRAVIOLETA

Marca PHILIPS

Modelo TUV-15W/G15T8

Serie N.A.

Calibración CONFORME

Código LAM – 007

BALANZA ANALÍTICA

Marca METTLER TOLEDO

Modelo XP105DR

Serie B107112658


Código BAL – 006

BALANZA ANALÍTICA

Marca METTLER TOLEDO

Modelo ML204

Serie B229124486


Código BAL – 010

55

HPLC – 005 Marca: HITACHI

Modelo: Chromaster

Se encuentra equipado con:

Autosampler Serie 1102-023

Detector RI Serie 1104-007

Detector UV – VIS Serie 1101- 003

Bomba Serie 1102-014

Horno Serie 1102-043


BAÑO TERMOSTÁTICO

Marca ZHICHENG

Modelo ZSBB – 726

Serie E00E5619


Código BAÑ- 002

ULTRASONIDO

Marca BRANSON

Modelo 3510R DHT

Serie EMC080271723E


Código BUS- 001

BOMBA AL VACÍO

Marca GAST

Modelo DOA – P704 – AA

Serie ----------

Calibración N.A.

Código COM – 001

56

COLUMNA: Nucleosil 100 C18 de 125mm x 4,0mm (5,0m)

Código 82 Lote 201309162

Marca Agilent Serie USM001870

Dimensiones 125mm x 4,0mm x 5,0m Otros --------

4.3 Procedimiento analítico:

Tomando en cuenta el siguiente sistema cromatográfico:

Se procedió de la siguiente manera:

4.3.1 Preparación de fase móvil:

Metanol y agua (83:17), filtrar y desgasificar con filtro de membrana de PVDF de 0,45

µm.

4.3.2 Preparación de solución estándar:

Calentar el estándar de Permetrina a 40°C, hasta que se disuelva, luego dejar enfriar a

temperatura ambiente por 5 minutos. Posteriormente pesar 50,0mg de Permetrina,

transferirlo a un matraz volumétrico de 100mL, agregar 90mL de metanol y llevar a

volumen con agua. Concentración final aproximada de 0.5mg/ml de Permetrina.

4.3.3 Preparación de solución prueba:

Pesar el equivalente a 50mg de Permetrina (aproximadamente 5ml de la muestra) a un

matraz volumétrico de 100ml, agregar 90ml de metanol y llevar a volumen con agua.

Concentración final aproximada de 0.5mg/ml de Permetrina.

Detector UV, 254 nm.

Columna Columna Nucleosil C18 100 de 125mm x 4,0mm x 5m

Velocidad de flujo 1,3mL/minuto

Volumen de

inyección

20 µL

Temperatura 25 ºC

%DSR no es más del 2% para inyecciones repetidas

Tiempo de corrida 10 minutos aproximadamente.

Tiempo de

retención

4,9 minutos para el Isómero Trans, aproximadamente y 6,0

minutos para el isómero Cis aproximadamente.

57

Filtrar una porción de la solución estándar y de la solución prueba a través de filtro de

membrana de PVDF de 0,45 µm descartando los primeros mililitros del filtrado.

4.3.4 Ensayo de aptitud del sistema:

Preparar una solución estándar (ver punto 4.3.2). Filtrar e inyectar 5 veces como

mínimo la solución estándar en el HPLC. Obtener cromatrograma respectivo [Anexo 1]

y resultados de aptitud del sistema (ver punto 5.2.1.1).

5. Parámetros de validación

5.1 Desarrollo de los parámetros de validación


Este ensayo se realizó con la finalidad de evaluar de manera inequívoca el analito

en presencia de aquellos componentes, cuya presencia resulta previsible, tales como

impurezas, productos de degradación y componentes de la matriz.

5.1.1.1 Interferencia del método

Muestra 1: (Fase Móvil)

Proceder según preparación de fase móvil (ver punto 4.3.1) y filtrar por membrana

PVDF de 0,45 µm en un vial de HPLC.

Muestra 2: (Placebo)

Transferir 5,0mL de placebo y proceder según la preparación de solución prueba

(ver punto 4.3.2)

Muestra 3: (Estándar de Permetrina)

Proceder según preparación de solución estándar (ver punto 4.3.2)

Muestra 4: (Muestra)

Proceder según la preparación de solución prueba (ver punto 4.3.3)

Procedimiento: Filtrar e inyectar todas las muestras preparadas por triplicado en el

HPLC, obtener las áreas y los cromatogramas respectivos [Anexo 2].

58

5.1.1.2 Prueba de estresamiento de muestras

Una vez preparadas las muestras se someterán a las siguientes condiciones:

Tabla 6: Estresamiento de muestras

Preparación de las muestras:

Muestra a condiciones normales: transferir aproximadamente 5,0mL de la

muestra (± 50,0mg de Permetrina) a un matraz volumétrico de 100mL, adicionar 90

mL de metanol y llevar a volumen con agua, mezclar. (Concentración final

aproximada de 0,5mg/ml de Permetrina)

Muestra sometida a Degradación térmica: transferir aproximadamente 5,0mL de

la muestra (± 50,0mg de Permetrina) a un matraz volumétrico de 100mL, adicionar

90 mL de metanol y llevar a 100ml con agua, mezclar. Luego llevar a baño maría a

una temperatura de 70°C por una hora, dejar enfriar a temperatura ambiente y

mezclar. (Concentración final aproximada de 0,5mg/ml de Permetrina)

Degradación alcalina: transferir aproximadamente 5,0mL de la muestra (± 50,0mg

de Permetrina) a un matraz volumétrico de 100mL, adicionar 90 mL de metanol,

1mL de NaOH 2N, disolver y llevar a volumen con agua, mezclar. (Concentración

final aproximada de 0,5mg/ml de Permetrina)

Muestras sometidas a: Muestra problema

Condiciones Normales Preparar muestras a condiciones normales

Condición Térmica Someter a las muestras a una temperatura mayor del

estudio de estabilidad (Tprom = 70 °C x 1h)

Condición Alcalina Atacar a las muestras con solución de NaOH 2N.

Condición Ácida Atacar a las muestras con solución de HCl 2N.

Condición Oxidativa Atacar a las muestras con solución de peróxido de

hidrogeno 3%.

Exposición luz UV Someter a las muestras a exposición de luz UV x 5h

59

Muestra sometida a Degradación ácida: transferir aproximadamente 5,0mL de la

muestra (± 50,0mg de Permetrina) a un matraz volumétrico de 100mL, adicionar 90

mL de metanol, 1mL de HCl 2N, disolver y llevar a volumen con agua, mezclar.

(Concentración final aproximada de 0,5mg/ml de Permetrina)

Muestra sometida a Degradación oxidativa: transferir aproximadamente 5,0mL

de la muestra (± 50,0mg de Permetrina) a un matraz volumétrico de 100mL,

adicionar 90 mL de metanol, 1mL de H2O2 3%, disolver y llevar a volumen con

agua, mezclar. (Concentración final aproximada de 0,5mg/ml de Permetrina)

Muestra sometida a Degradación por luz UV 254 nm: transferir

aproximadamente 5,0mL de la muestra (± 50,0mg de Permetrina) a un matraz

volumétrico de 100mL, adicionar 90 mL de metanol y llevar a volumen con agua,

mezclar. Exponer a la luz UV 254 nm por 5 horas. (Concentración final

aproximada de 0,5mg/ml de Permetrina)

Procedimiento:

*Preparar una solución estándar (ver punto 4.3.2). Filtrar e inyectar al sistema por

quintuplicado como mínimo.

*Filtrar e inyectar todas las muestras por triplicado en el HPLC, obtener los

cromatogramas respectivos [Anexo 3] y las áreas.


Este ensayo se realizó con la finalidad de determinar la proporcionalidad entre la

concentración del principio activo y su respuesta (áreas) y nos demuestra la

capacidad que tiene el método de obtener resultados linealmente proporcionales a la

concentración del principio activo en la muestra.

5.1.2.1 Linealidad del sistema

Se preparan 3 curvas de calibración correspondientes a 5 concentraciones que

cubran el intervalo del analito (50%, 75%, 100%, 125% y 150%)

Preparación:

Proceder a preparar los estándares (el cual será el 100%) de manera

independiente (ver punto 4.3.2).

60

Tomar como referencia el peso del estándar al 100% y calcular el peso a las

diferentes concentraciones que formarán la curva de calibración.

Estándar al 50%:

Calentar el estándar a 40°C hasta que se disuelva, luego dejar enfriar a

temperatura ambiente por 5 minutos. Pesar luego aproximadamente 25,0mg de

Permetrina, transferirlo a un matraz volumétrico de 100mL, agregar 90mL de

metanol y llevar a volumen con agua. (Concentración final aproximada de

0,25mg/ml de Permetrina)

Estándar al 75%:






Estándar al 100%:






Estándar al 125%:






Estándar al 150%:



61




Procedimiento: Filtrar e inyectar los 15 estándares preparados por triplicado en el

HPLC, de preferencia colocarlos en sentido creciente a la concentración.

Obtener las áreas y los cromatogramas respectivos [Anexo 4].

5.1.2.2 Linealidad método

Se preparan 3 curvas de calibración correspondientes a 5 concentraciones que

cubran el intervalo del analito en la muestra (50%, 75% 100%, 125% y150%)

Preparación:

Proceder a preparar las muestras (el cual será el 100%) de manera

independiente (ver punto 4.3.3).

Tomar como referencia el peso de la muestra al 100% y calcular el peso a las

diferentes concentraciones que formarán la curva de calibración.

Muestra al 50%:

Pesar aproximadamente 2,5mL de la muestra (± 25,0mg de Permetrina) llevar a un

matraz volumétrico de 100mL, adicionar 90mL de metanol llevar a volumen con

agua y mezclar. (Concentración final aproximada de 0,25mg/ml de Permetrina)

Muestra al 75%:

Pesar aproximadamente 3,75mL de la muestra (± 37,5mg de Permetrina) llevar a

un matraz volumétrico de 100mL, adicionar 90mL de metanol llevar a volumen

con agua y mezclar. (Concentración final aproximada de 0,375mg/ml de

Permetrina)

Muestra al 100%:




62

Muestra al 125%:

Pesar aproximadamente 6,25mL de la muestra (± 62,5mg de Permetrina) llevar a

un matraz volumétrico de 100mL, adicionar 90mL de metanol llevar a volumen

con agua y mezclar. (Concentración final aproximada de 0,625mg/ml de

Permetrina)

Muestra al 150%:




Procedimiento:

Preparar una solución estándar (ver punto 4.3.2). Filtrar e inyectar por triplicado

en el HPLC.

Filtrar e inyectar las 15 muestras preparados por triplicado en el HPLC, de

preferencia colocarlos en sentido creciente a la concentración.

Obtener las áreas de cada inyección y los cromatogramas respectivos [Anexo 5].


Este ensayo se realizó con la finalidad de determinar la proximidad entre los

resultados obtenidos y el valor verdadero.

Preparar 3 curvas de calibración correspondientes a 3 concentraciones que cubran

el intervalo del analito (50%, 100% y 150%).

Preparación de las 9 muestras: Preparar por triplicado las muestras, para lo cual

se pesa cantidades conocidas de analito que cubran los tres niveles de la curva

(50%, 100% y 150%).

Estándar + Placebo al 50%:

Pesar en un matraz volumétrico de 100mL, aproximadamente 25mg de estándar de

referencia de Permetrina y 2,5mL de placebo, agregar 90mL de metanol y llevar a

volumen con agua.

63




volumen con agua.




volumen con agua.

Procedimiento:

Preparar una solución estándar (ver punto 4.3.2). Filtrar e inyectar por

quintuplicado en el HPLC.

Filtrar e inyectar las 9 muestras preparadas por triplicado en el HPLC, de

preferencia colocarlos en sentido creciente a la concentración.

Obtener las áreas de cada inyección y los cromatogramas respectivos tanto del

estándar y de las muestras [Anexo 6].


Este ensayo se realizó con la finalidad de determinar el grado de concordancia entre

los resultados de las pruebas individuales cuando se aplica el procedimiento

repetidamente a múltiples muestreos de una muestra homogénea.

5.1.4.1 Repetibilidad del sistema

Preparar una solución estándar (ver punto 4.3.2).

Procedimiento:

Filtrar e inyectar 6 veces la solución estándar.


64

5.1.4.2 Repetibilidad del método

Realizar los análisis de contenido de Permetrina en el producto a evaluar; preparar

una solución estándar (ver punto 4.3.2) y 6 muestras (ver punto 4.3.3) de manera

independiente.

Procedimiento:

Filtrar e inyectar 5 veces como mínimo la solución estándar y las muestras por

duplicado en el HPLC.

Obtener las áreas y los cromatogramas respectivos [Anexo 8]

5.1.4.3 Precisión intermedia:

Un primer analista debe realizar el análisis de contenido de Permetrina en el

producto a evaluar. Preparar una solución estándar (ver punto 4.3.2) y 6 muestras

(ver punto 4.3.3)

Un segundo analista debe realizar el análisis de contenido de Permetrina en el

mismo producto a evaluar. Preparar una solución estándar (ver punto 4.3.2) y 6

muestras (ver punto 4.3.3)

Procedimiento para cada analista:

Filtrar e inyectar la solución estándar 6 veces como mínimo y las 6 muestras por

duplicado en el HPLC.



Realizar los análisis de contenido de Permetrina en el producto a evaluar, una

solución estándar (ver punto 4.3.2) y una muestra (ver punto 4.3.3)

Se evaluará una muestra a condiciones normales vs una muestra cuantificada

modificando:

Velocidad de flujo de 1,3ml/ min a 1,5ml/ min

Volumen de inyección de 20ul a 10 l

65

Cambio de columna Nucleosil C18 de 125mm x 4,0mm x 5,0m a

Purospher RP18e 125mm x 4,0mm x 5,0m.

Combinación de la Fase Móvil a través de la bomba

Procedimiento:

Filtrar e inyectar 5 veces la solución estándar y las muestras por duplicado en el

HPLC.



Se valida verificando que el procedimiento analítico proporcionado por la

precisión, exactitud y linealidad son aceptables.

66

5.2 RESULTADOS

Se verificará la conformidad de las pruebas respecto a los criterios de aceptación en

cada una de las etapas de la Validación.

Los resultados y la conformidad de los mismos se encuentran en el punto 6

5.2.1 Aptitud del Sistema (HPLC)

Producto : Permetrina 1% Shampoo

Método : Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)

Técnica analítica : Metodología Propia

Tabla 7: Áreas y Tiempos de retención obtenidos con la muestra.

Estándar de Referencia de Permetrina

Nombre Permetrina

Código SSTD-60-01-12

Pot. Tal cual Isómero Cis: 27,89% Isómero Trans: 68.38%

F. vencimiento 30- 06- 2014

N° Inyección Áreas Tiempos de Retención (min)

Isómero

Trans

Isómero

Cis Isómero Trans Isómero Cis

1 4005937 1501206 4.90 6.03

2 4005668 1515832 4.90 6.03

3 4004739 1518325 4.90 6.04

4 4008541 1505436 4.90 6.03

5 4004780 1516642 4.90 6.03

Promedio 4005933 1511488 4.90 6.03

Coef. de Variación (CV) 0.0407 0.5065 0.0000 0.074

67

Tabla 8: Aptitud del Sistema (HPLC)

Al correr el estándar durante todas las pruebas, comprobamos que los parámetros

cromatográficos evaluados en el método para HPLC son:

Tiempo de retención < 1%

Coeficiente de variación < 2%

Factor de asimetría entre 0.8 y 2.0

Factor de Capacidad > 1

Resolución > 1.5

Platos teóricos > 1000

Por lo que queda definido el System Suitability Test, para los ensayos correspondientes a

realizar durante la validación.

CONFORME X NO CONFORME

Parámetros

Cromatográficos Especificaciones

Resultados Observaciones

Isómero Trans Isómero Cis

Coef. De Variación (CV) %RSD < 2 0.039 0.507 Conforme

Factor de Asimetría (T) 0.8 < T < 2.0 1.099 1.107 Conforme

Tiempo de retención (rt) % RSD < 1 0.000 0.025 Conforme

N° de platos teóricos (N) N > 1000 2634 2871 Conforme

Factor de capacidad (K) K > 1 8.793 11.068 Conforme

Resolución (R) R >1.5 --- 2.734 Conforme

68





5.2.2.1 Interferencia del placebo y fase móvil con respecto a la muestra.

Tabla 9: Interferencia de placebo y fase móvil con respecto a la muestra

Al evaluar la interferencia del método, se pudo comprobar que al inyectar el placebo y la

fase móvil en el equipo, no existe interferencia en el mismo tiempo de retención del

estándar de referencia, por lo tanto: No existe interferencia alguna en la cuantificación del

analito en estudio.

Estándar de Referencia de Permetrina

Nombre Permetrina




MUESTRAS

ÁREAS

%interferencia en relación con

el SSTD

%interferencia en relación con

el producto

RESULTADO

Isómero

Trans

Isómero

Cis Isómero Trans Isómero Cis Isómero Trans Isómero Cis

Fase móvil 0 0 0 - 0 - Conforme

Placebo 34777 0 0.87 - 0 - Conforme

Muestra 2253013 1144742 - - 100 - -

Estándar 4005933 1511488 100 - - - -

69

5.2.2.2 Muestras sometidas a estresamiento

Tabla 10: Estresamiento de las muestras.

Asimismo se evaluó el estresamiento de las muestras, observando que los

productos de degradación de las muestras, no interfieren con el tiempo de retención

del principio activo.

Por lo tanto el método es selectivo y no presenta interferencia alguna al momento

de cuantificar el analito.


ESTRESAMIENTO DE MUESTRAS Interferencia <2% RESULTADO

Condiciones normales < 2% Conforme

Estresamiento térmico < 2% Conforme

Estresamiento Alcalina NaOH 2N < 2% Conforme

Estresamiento ácido HCL 2N < 2% Conforme

Estresamiento oxidativo H2O2 3% < 2% Conforme

Estresamiento luz UV 254nm < 2% Conforme

70


5.2.3.1 Linealidad del sistema (HPLC)




Estándar de Referencia de Permetrina.

Nombre Permetrina




Diluciones para Isómero Trans

Muestra1

Peso Fiola Factor Área 1 Área 2 Área 3

Dilución al 50% 24.73 100 0.169104 1827222 1822439 1821335

Dilución al 75% 35.32 100 0.241518 2627496 2625643 2624061

Dilución al 100% 52.29 100 0.357559 3875166 3880497 3881502

Dilución al 125% 65.02 100 0.444607 4572403 4577695 4582279

Dilución al 150% 78.24 100 0.535005 5751729 5817423 5793669

Muestra2


Dilución al 50% 21.17 100 0.144760 1558693 1554610 1554858

Dilución al 75% 40.54 100 0.277213 3008119 3012047 3005531

Dilución al 100% 50.45 100 0.344977 3722212 3713898 3711300

Dilución al 125% 61.74 100 0.422178 4554080 4552063 4542644

Dilución al 150% 79.14 100 0.541159 5786384 5817677 5804042

Muestra3


Dilución al 50% 29.64 100 0.202678 2078586 2070472 2082489

Dilución al 75% 40.76 100 0.278717 3031699 3027804 3029844

Dilución al 100% 54.96 100 0.375816 4093599 4089906 4090364

Dilución al 125% 68.01 100 0.465052 4907886 4931759 4937011

Dilución al 150% 79.13 100 0.541091 5755352 5762534 5751095

71

0

2000000

4000000

6000000

8000000

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

AR

EAS

mg/mL

LINEALIDAD DEL SISTEMA

Tabla 11: Linealidad del Sistema - Isómero Trans

Gráfico 1: Linealidad del Sistema – Isómero Trans

Concentración Muestras

mg/mL Áreas (y) Xy x2 y2

f (factor respuesta)

Varianza Teórica (x)

50%

mp1 0.169104 1823665 308388.628375 0.028596 3325755248001.78 10784299

89772463850 mp2 0.144760 1556054 225255.044571 0.020956 2421303013546.78 10749162

mp3 0.202678 2077182 420999.825654 0.041079 4314686445912.11 10248666

75%

mp1 0.241518 2625733 634162.283317 0.058331 6894475537777.78 10871784

110893513.5 mp2 0.277213 3008566 834012.070042 0.076847 9051467370645.44 10852921

mp3 0.278717 3029782 844451.479026 0.077683 9179580987378.78 10870466

100%

mp1 0.357559 3879055 1386991.104326 0.127848 15047067693025.00 10848712

3452691940 mp2 0.344977 3715803 1281867.058104 0.119009 13807194412011.10 10771159

mp3 0.375816 4091290 1537574.081187 0.141238 16738651136573.40 10886403

125%

mp1 0.444607 4577459 2035159.215023 0.197675 20953130896681.00 10295523

58853520311 mp2 0.422178 4549596 1920739.745313 0.178234 20698820730152.10 10776484

mp3 0.465052 4925552 2290639.680414 0.216274 24261062504704.00 10591392

150%

mp1 0.535005 5787607 3096399.377548 0.286230 33496394786449.00 10817853

8063039028 mp2 0.541159 5802701 3140185.727323 0.292853 33671338895401.00 10722722

mp3 0.541091 5756327 3114696.387377 0.292779 33135300530929.00 10638373

5.341435 57206372 23071531.707601 2.155633 246996230189188.00 160413334562 160252608642

72

Ecuación de la recta:

Coeficiente de correlación (r): r = 0.998905

Coeficiente de Determinación (r2): r

2 = 0.997811

Test de Linealidad

Coeficiente de variación de los factores de respuesta (f ): 1.855085458 %

Variación del error experimental total : 4853208425.759610

Varianza de la Pendiente : 19139430123.729

Desviación Estándar de la pendiente : 38345.3292444

Desviación Estándar Relativa de la pendiente : 1.299%

Prueba de T-Student : 76.9829 > 2.1604

Test de Proporcionalidad

Varianza del intercepto (a) : 2750506186.407460

Desviación Estándar del intercepto (a) : 52445.268484

Intervalo de confianza del intercepto (a) : -92021.095 < a < 134542.464

Prueba de T-Student : 0.405388 < 2.160

Test de Cochram : 0.5602 < 0.6830

Diluciones para Isómero Cis

Muestra1


Dilución al 50% 24.73 100 0.068972 664299 660224 659718

Dilución al 75% 35.32 100 0.098507 953336 952128 953178

Dilución al 100% 52.29 100 0.145837 1459409 1462462 1455661

Dilución al 125% 65.02 100 0.181341 1692528 1677754 1695236

Dilución al 150% 78.24 100 0.218211 2146771 2154280 2173784

Muestra2


Dilución al 50% 21.17 100 0.059043 563570 563358 561585

Dilución al 75% 40.54 100 0.113066 1122248 1097982 1096514

Dilución al 100% 50.45 100 0.140705 1390900 1390768 1383240

Dilución al 125% 61.74 100 0.172193 1681857 1698458 1704803

Dilución al 150% 79.14 100 0.220721 2158763 2172880 2170632

73

Muestra 3

Tabla 12: Linealidad del Sistema – Isómero Cis


mg/mL Áreas (y) Xy x2 y2

f (factor respuesta)

Varianza Teórica (x)

50%

mp1 0.068972 661414 45619.003600 0.004757 437468038453.44 9589601

41309792559 mp2 0.059043 562838 33231.697500 0.003486 316786239018.78 9532653

mp3 0.082666 761565 62955.529400 0.006834 579981756935.11 9212563

75%

mp1 0.098507 952881 93865.873200 0.009704 907981564907.11 9673181

2758069607 mp2 0.113066 1105581 125003.725400 0.012784 1222310084615.11 9778189

mp3 0.113680 1105381 125659.352000 0.012923 1221867892081.78 9723653

100%

mp1 0.145837 1459177 212801.767500 0.021268 2129198490113.78 10005549

4835394756 mp2 0.140705 1388303 195341.196100 0.019798 1927384294273.78 9866758

mp3 0.153283 1524225 233638.451300 0.023496 2323261850625.00 9943833

125%

mp1 0.181341 1688506 306194.995100 0.032884 2851052512036.00 9311232

1.11134E+11 mp2 0.172193 1695039 291873.670600 0.029650 2851052512036.00 9843842

mp3 0.189680 1882550 357081.813700 0.035978 2873158341547.11 9924877

150%

mp1 0.218211 2158278 470960.850400 0.047616 3543993247466.78 9890770

7427248411 mp2 0.220721 2167425 478397.210400 0.048718 4658165364136.11 9819729

mp3 0.220694 2144975 473382.263900 0.048706 4697731130625.00 9719247

2.178599 21258139 3506007.400200 0.358603 34291259987443.30 167610005798 167464170121


Dilución al 50% 29.64 100 0.082666 7565155 759485 768696

Dilución al 75% 40.76 100 0.113680 1105652 1105382 1105110

Dilución al 100% 54.96 100 0.153283 1528546 1530996 1513133

Dilución al 125% 68.01 100 0.189680 1891766 1875400 1880483

Dilución al 150% 79.13 100 0.220694 2152534 2141703 2140689

74

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

AR

EAS

mg/mL

LINEALIDAD DEL SISTEMA

Gráfico 2: Linealidad del Sistema – Isómero Cis

Ecuación de la recta: )



2 = 0.9970

Test de Linealidad

Coeficiente de variación de los factores de respuesta (f): 2.352 %

Variación del error experimental total : 965625289.24

Varianza de la Pendiente : 22891268278.14







Intervalo de confianza del intercepto (a) : - 74168.342 < a < 26891.800


Test de Cochram : 0.6636 < 0.6830


75

5.2.3.2 Linealidad del método analítico.




Muestra1

Muestra2


Nombre Permetrina




Peso Fiola Factor Área 1 Área 2 Área 3 T. Áreas Área 1 Área 2 Área 3

Dilución al 50% 23.99 100 0.239870 1125388 1103289 1105290 1653954 546769 538357 542768

Dilución al 75% 35.98 100 0.359800 1619946 1620775 1634319 2435250 809185 805544 815982

Dilución al 100% 47.95 100 0.479540 2113662 2124244 2120344 3186461 1060336 1070317 1070519

Dilución al 125% 60.00 100 0.599950 2707034 2704735 2705791 4089853 1383851 1382469 1385680

Dilución al 150% 71.94 100 0.719400 3176269 3239597 3188965 4853210 1639654 1673449 1641695


Dilución al 50% 24.09 100 0.240920 1094736 1100012 1099712 1639068 542501 538290 541952

Dilución al 75% 35.93 100 0.359300 1600243 1605194 1605591 2403119 799031 798576 800721

Dilución al 100% 48.01 100 0.480090 2120877 2131657 2133529 3202437 1071349 1075359 1074540

Dilución al 125% 60.01 100 0.600060 2649442 2662255 2641868 4005339 1355559 1365282 1341612

Dilución al 150% 72.01 100 0.720050 3049092 3216539 3219224 4791898 1565196 1661781 1663862

76

Muestra3


Dilución al 50% 24.05 100 0.240480 1086576 1086771 1081086 1618275 534703 533542 532146

Dilución al 75% 36.01 100 0.360060 1584486 1590883 1592228 2383832 791512 794885 797502

Dilución al 100% 47.95 100 0.479480 2178552 2180020 2179007 3280682 1101896 1102766 1099806

Dilución al 125% 60.02 100 0.600220 2662269 2668803 2682504 4036905 1362258 1365809 1369073

Dilución al 150% 71.98 100 0.719830 3159549 3156127 3162867 4827152 1672269 1663029 1667616

Tabla 13: Linealidad del Método


mg/mL Áreas (y) Xy x

2 y

2

f (factor

respuesta) Varianza

Teórica (x)

50%

mp1 0.239870 1653954 396733.8660 0.057538 2735562731480.11 6895209

6903533460 mp2 0.240920 1639068 394884.1823 0.058042 2686542815912.11 6803369

mp3 0.240480 1618275 389162.6918 0.057831 2618812896775.11 6729352

75%

mp1 0.359800 2435250 876203.0699 0.129456 5930444186000.11 6768344

5465919754 mp2 0.359300 2403119 863440.5369 0.129096 5774979326081.78 6688335

mp3 0.360060 2383832 858322.5499 0.129643 5682655004224.00 6620652

100%

mp1 0.479540 3186461 1528035.3481 0.229959 10153531580213.80 6644828

11512270316 mp2 0.480090 3202437 1537457.9793 0.230486 10255602738969.00 6670493

mp3 0.479480 3280682 1573021.5652 0.229901 10762876572245.40 6842167

125%

mp1 0.599950 4089853 2453707.5073 0.359940 16726900288177.80 6816990

5184032436 mp2 0.600060 4005339 2403443.9204 0.360072 16042743175147.10 6674898

mp3 0.600220 4036905 2423031.3192 0.360264 16296604670295.10 6725709

150%

mp1 0.719400 4853210 3491399.0342 0.517536 23553644068626.80 6746191

2090827050 mp2 0.720050 4791898 3450406.1549 0.518472 22962286442404.00 6654952

mp3 0.719830 4827152 3474729.0641 0.518155 23301399649205.40 6705962

7.199050 48407435 26113978.7896 3.886392 175484586145758.00 31257570468 31156583017

77

0

2000000

4000000

6000000

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

AR

EAS

mg/mL

LINEALIDAD DEL MÉTODO

Gráfico 3: Linealidad del Método

Ecuación de la recta: )



2 = 0.9992

Test de Linealidad

Coeficiente de variación de los factores de respuesta (f ): 1.179%

Variación del error experimental total : 1172504547

Varianza de la Pendiente : 2718510070







Intervalo de confianza del intercepto (a) : - 36545.447 < a < 78105.303


Test de Cochram : 0.3695 < 0.6830

78

*El gráfico de respuesta (áreas) vs. Concentración del analito, demuestra que el método

por cromatografía liquida de alta resolución, produce una respuesta lineal para el analito.

*La ecuación de la recta que se obtiene tanto en linealidad del sistema como linealidad del

método, nos demuestran que el método responde linealmente en el rango de trabajo

empleado.

*Los factores de respuesta son semejantes entre si y cercanos al valor de la pendiente.

*Usando el test de Cochram, se pudo apreciar que tanto en la linealidad del sistema como

del método los resultados Gexp son menores que Gtabla, lo que nos indica que las

varianzas de las concentraciones evaluadas son homogéneas y que el factor de

concentración no influye en la variabilidad de los resultados.

*Mediante el test de linealidad se pudo observar que el texp > t tabla, lo cual significa que

la probabilidad de ser b diferente de cero es elevada, confirmando la linealidad del método.

*Para el caso de test de proporcionalidad, aplicando el t student, nos indica que el valor

experimental es menor al de la tabla con lo cual, nos indica que el valor de “a” es igual o

cercano a cero, comprobándose así la proporcionalidad entre la concentración del principio

activo y su respuesta


79





Tabla 14: Porcentaje de recuperación del método analítico.


Nombre Permetrina




N° INYECCIÓN ÁREAS

TIEMPPOS DE RETENCIÓN

(min)

Isómero

Trans

Isómero


1 3716490 1297118 4.88 6.02

2 3756979 1329204 4.87 6.01

3 3779727 1332570 4.87 6.00

4 3776790 1303625 4.86 5.99

5 3704219 1315677 4.85 5.97

PROMEDIO 3746841 1315639 4.87 6.00

Suma de áreas 5062480 - -


Porcentaje de mg de analito Suma de áreas

mg de analito Porcentaje de Varianza

analito teórico Añadido Hallado recuperación (%R)

Exactitud 80%

29.15 2933324 29.1512 100.0043

1.535012 31.32 3073729 30.5466 97.5306

26.93 2679813 26.6319 98.8929

Exactitud 100%

55.50 5457661 54.2380 97.7261

1.143252 52.19 5238298 52.0580 99.7470

52.00 5198041 51.6579 99.3421

Exactitud 120%

67.53 6409211 63.6945 94.3202

10.12683 72.98 7287008 72.4180 99.2299

73.07 7373389 73.2764 100.2825

Promedio (Rprom) 98.5640

Desviación Estándar (S) 1.849

Coeficiente de variación (CV) 1.876

80

Porcentaje de recuperación total : 98.5640%


*Al ser texp menor que ttabla no existe diferencia significativa entre la recuperación y el

100%, confirmando así la exactitud del método.


81


5.2.5.1 Repetibilidad del sistema (HPLC)




Tabla 15: Repetibilidad del Sistema (HPLC)

*Al realizar repetidamente los ensayos se obtuvo un coeficiente de variación menor

al 2% entre las áreas obtenidas, corroborándose así la repetibilidad del sistema.



Nombre Permetrina




N° INYECCIÓN ÁREAS

TIEMPPOS DE RETENCIÓN

(min)

Isómero

Trans

Isómero


1 4010309 1501206 4.90 6.03

2 4031399 1515832 4.90 6.03

3 4005529 1518325 4.90 6.04

4 4001430 1505436 4.90 6.03

5 4004436 1516642 4.90 6.03

6 4009615 1502777 4.90 6.03

PROMEDIO 4010453 1510036 4.90 6.03


82

5.2.5.2 Repetibilidad de la técnica analítica.




Tabla 16: Repetibilidad del Método (HPLC)

Concentración (g/100ml)

Estándar de Referencia de ´Permetrina.

Nombre Permetrina




Peso (mg) 53.94mg

Área M1 Área M2 Área M3 Área M4 Área M5 Área M6

Isómero

Trans Isómero

Cis Isómero

Trans Isómero

Cis Isómero

Trans Isómero

Cis Isómero

Trans Isómero

Cis Isómero

Trans Isómero

Cis Isómero

Trans Isómero

Cis

Lectura1 2173805 1138397 2228998 1171919 2179812 1144119 2209966 1162123 2189748 1146998 2222173 1170643

Lectura2 2196089 1150305 2195589 1155584 2175719 1144548 2189187 1148693 2175855 1144000 2218756 1164209

Promedio 2184947 1144351 2212294 1163752 2177766 1144334 2199577 1155408 2182802 1145499 2220465 1167426

Lectura1

Lectura2

1.0097

1.0202

1.0375

1.0223

1.0134

1.0123

1.0260

1.0155

1.0177

1.0126

1.0261

1.0231

Promedio 1.0150 1.0299 1.0129 1.0208 1.0152 1.0246

83

Lectura de Repetitividad del Método (HPLC).

*Al realizar repetidamente los ensayos se obtuvo un coeficiente de variación menor al 2% entre las áreas y las concentraciones

obtenidas, corroborándose así la repetibilidad del método.


N° Muestras Concentrac.

(g/100ml)

% Concent.

1 1.0150 101.4950

2 1.0299 102.9900

3 1.0129 101.2850

4 1.0208 102.0750

5 1.0152 101.5150

6 1.0246 102.4600

Promedio 1.0187 101.9700

S 0.0066 0.6623

RSD 0.6495 0.6495

84

5.2.5.3 Precisión Intermedia de la técnica analítica.




ANALISTA A:

Tabla 16: Precisión Intermedia – Analista A


Nombre Permetrina




Peso (mg) 53.93mg

Estándar Áreas Isómero Trans Áreas Isómero Cis

1 4011562 1521126

2 4012555 1516025

3 4003426 1519827

4 4003177 1513455

5 4006986 1518337

6 4004328 1509704

Promedio 4007006 1516412

RSD 0.10360 0.28210

M1 M2 M3 M4 M5 M6

Suma de Áreas del Isómero Trans e Isómero Cis

Lectura1 3312202 3400917 3323931 3372089 3336746 3392816

Lectura2 3346394 3351173 3320267 3337880 3319855 3382965

Promedio 3329298 3376045 3322099 3354985 3328301 3387891

Promedio total áreas 3349770

S 27628

%RSD 0.8248


Lectura1 1.0097 1.0375 1.0134 1.0260 1.0177 1.0261

Lectura2 1.0202 1.0223 1.0123 1.0155 1.0126 1.0231

Promedio 1.0150 1.0299 1.0129 1.0208 1.0152 1.0246

S 0.0066 Promedio de la concentración

%RSD 0.6495 1.0197

85

ANALISTA B:

Tabla 17: Precisión Intermedia – Analista B

Promedio total entre analistas: 1.01284

Desviación Estándar entre analistas: 0.0096

Coeficiente de Variación entre analistas: 0.949

*En el análisis de precisión intermedia, los resultados obtenidos por ambos analistas, dan

un coeficiente de variación menor al 2%, lo que nos demuestra la fiabilidad del método.

Estándar de Referencia

Nombre Permetrina




Peso (mg) 53.93mg

Estándar Áreas Isómero Trans Áreas Isómero Cis

1 3986832 1561200

2 4002256 1563817

3 4004514 1569620

4 4004953 1567244

5 4006508 1566271

6 4005244 1569362

Promedio 4001718 1566252

RSD 0.1855 0.2088

M1 M2 M3 M4 M5 M6

Suma de Áreas del Isómero Trans e Isómero Cis

Lectura1 3336465 3298475 3355435 3340355 3318686 3316086

Lectura2 3351117 3290466 3351783 3330996 3327802 3392145

Promedio 3343791 3294471 3353609 3335676 3323244 3354116

Promedio total áreas 3334151

S 22654

%RSD 0.6794


Lectura1 1.0070 0.9952 1.0121 1.0072 1.0017 0.9997

Lectura2 1.0114 0.9928 1.0110 1.0043 1.0044 1.0227

Promedio 1.0092 0.9940 1.0116 1.0058 1.0031 1.0112

S 0.0066 Promedio de la concentración

%RSD 0.6603 1.0058

86

Asimismo haciendo un análisis global con todos los resultados obtenemos una desviación

estándar relativa menor al 3%. Esto demuestra la Precisión del método analítico.


87






Nombre Permetrina




Peso (mg) 53.30mg

88

Tabla 18: Robustez de la técnica analítica.

*Luego de evaluar las concentraciones modificando parámetros cromatográficos del sistema HPLC obtenemos concentraciones similares

En comparación con la concentración del producto a condiciones normales, por lo que el método evaluado es robusto frente al cambio

Cromatografico estudiado.


Muestras Factores Modificados Condiciones

Suma áreas

Iso Trans e

Iso Cis

Concentración

g/100mL %Alteración

Muestra 100 %

- Normal 3283568 0.9750 100 100

Volumen de inyección 20µl a 10µl 1649496 0.9766 100.16 0.16

Combinación de la fase móvil a

través de la bomba Bomba: 83:17 3312259 0.9745 99.95 0.05

Variando marca de la columna

NucleosilC18

125mmx4.0mmx5.0µm a

Purospher RP 18e

125mmx4.0mmx5.0µm

3219224 0.961 98.56 1.44

Flujo 1,3mL/min a 1,5 mL/min 2775587 0.9568 98.13 1.87

Estándar 100 %

- Normal 5281537 Coef. de variación CV %

Volumen de inyección 20µl a 10µl 2684887

Combinación de la fase móvil a

través de la bomba Bomba: 83:17 5364847

0.947% Variando marca de la columna

NucleosilC18

125mmx4.0mmx5.0µm a

Purospher RP 18e

125mmx4.0mmx5.0µm

5751612

Flujo 1,3mL/min a 1,5 mL/min 4606728

89





Tabla 19: Intervalo de la técnica analítica.

PARÁMETROS RANGO RESULTADO

LINEALIDAD 50% - 150% CUMPLE

EXACTITUD 50% - 150% CUMPLE

PRECISIÓN 100%

CUMPLE


90

6. Informe Técnico

Tabla 20: Resumen de Resultados

PARÁMETRO DE

VALIDACIÓN

ESPECIFICACION

RESULTADOS

Isómero Trans Isómero Cis

SELECTIVIDAD Interferencia no mayor a 2 % CONFORME

LINEALIDAD DE

SISTEMA

Coeficiente de correlación : r > 0,997

Coeficiente de determinación: r2 > 0.995

Ecuación de la recta. y = bx + a

Test de Linealidad

CV Factor de Respuesta: CV (f) < 5 %

RSD de la pendiente (b): menor a 2 %

Test de Student: t exp > t tablas


Test de Student: t exp < t tabla

Test de Cochram: Gexp < Gtabla

0.9989

0.9978

y =10650220.15X + 21260.68

1.855%

1.299%

76.9829 > 2.1604

0.4054 < 2.1604

0.5602 < 0.6830

0.9985

0.9970

y =9920461.80X + (-23638.27)

2.352%

1.525%

65.5688 > 2.1604

1.0105 < 2.1604

0.6636 < 0.6830

LINEALIDAD DE

MÉTODO




Test de Linealidad

CV Factor de Respuesta: RSD < 5 %






0.9996

0.9992

y = 6680844X + 20779.93

1.179%

0.780%

128.1345 > 2.1604

0.7830 < 2.1604

0.3695 < 0.6830

EXACTITUD

Porcentaje de recuperación: 97%-103%

Test de G de Cochran: G exp < G tablas

Test de T de Student: T exp < T tablas

98.5640%

0.7908 < 0.8709

2.296 < 2.306

PRECISION

Repetibilidad del sistema: RSD < 2 %

Repetibilidad del método: RSD < 2 %

P. Intermedia: RSD entre analistas < 3 %

0.38% 0.38%

0.649%

0.951%

ROBUSTEZ RSD < 2 % 0.95%

91

CAPÍTULO IV

92

4.1 DISCUSIONES:

Se validó la técnica analítica con un sistema cromatográfico similar al referido por P.

Modamio: columna: Nucleosil C18x 125mm x 4,0mm x 5,0µm; flujo: 1,3mL/min;

fase móvil: metanol: agua (83:17); detección: 254nm, diferente de P. Modamio que

detectó las muestras a una longitud de onda de 272nm. Esta diferencia pone de relieve

la necesidad de validar técnicas de acuerdo a la variación de la matriz de la muestra.

La Selectividad del método fue corroborada a través de los cromatogramas realizados,

en los cuales los tiempos de retención fueron 4.90 min para el isómero trans y 6.03

para el isómero Cis, y aunque los tiempos fueron inferiores a lo referido por Tarinas

et al. y P. Modamio, el método cumple con el parámetro de Selectividad ya que no

existen interferencias en los tiempos de retención de los picos mencionados.

Los resultados del ensayo de Linealidad mostraron una buena correlación entre el área

y la concentración dentro del rango estudiado dado por los coeficientes de correlación

(r), que es r > 0.99 para ambos isómeros y cumple con lo establecido en la literatura,

dato similares encontrados por Tarinas et al. Esto demuestra que existe relación lineal

entre las variables de concentración y sus respuestas.

El método es también Exacto y Preciso dentro del rango de concentraciones

estudiado, cumpliendo con lo establecido por la literatura, CV < 2%

93

4.2 CONCLUSIONES

El método es selectivo, porque permite el análisis del principio activo sin la

interferencia de los excipientes presentes en la formulación del Shampoo.

El método es lineal, porque los resultados obtenidos son directamente proporcionales a

la concentración de analito en la muestra.

El método es preciso, porque nos permite obtener resultados repetitivos y reproducibles,

cuando este es aplicado en análisis repetitivos de la misma muestra.

El método es exacto, ya que permite la recuperación de la totalidad de analito presente

en la muestra.

El método de análisis propuesto cumple con los parámetros establecidos para una

validación demostrando que es posible la cuantificación de Permetrina por HPLC.

El método de análisis para la cuantificación del analito en estudio cumple con los

parámetros de selectividad, Linealidad, exactitud y precisión; por lo tanto dicho método

se encuentra validado y es apto para su utilización.

94

11. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.

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98

ANEXOS

99

Anexo 1. Aptitud del Sistema

Cromatograma N°1: Primera Inyección

Cromatograma N°2: Segunda Inyección

100

Cromatograma N°3: Tercera Inyección

Cromatograma N°4: Cuarta Inyección

101

Cromatograma N°5: Quinta Inyección

Anexo 2: Interferencia del método

Cromatograma N°6: Interferencia de la fase móvil

102

Cromatograma N°7: Interferencia de la muestra

Cromatograma N°8: Interferencia del placebo

103

Cromatograma N°9: Interferencia del estándar

Anexo 3: Prueba de Estresamiento de muestras.

Cromatograma N°10: Muestra en condiciones normales

104

Cromatograma N°11: Muestra con degradación térmica

Cromatograma N°12: Muestra con degradación Alcalina

105

Cromatograma N°13: Muestra con degradación acida

Cromatograma N°14: Muestra con degradación oxidativa

106

Cromatograma N°15: Muestra expuesta a luz UV

Anexo 4: Linealidad del Sistema

Cromatograma N°16: Linealidad 50% - I

107

Cromatograma N°17: Linealidad 50% - II

Cromatograma N°18: Linealidad 50% - III


108




109




110




111



112

Anexo 5: Linealidad del Método




113




114




115




116




117

Anexo 6: Exactitud

Cromatograma N°46: Exactitud 50% - I

Cromatograma N°47: Exactitud 50% - II

Cromatograma N°48: Exactitud 50% - III

118




119




120

Anexo 7: Repetibilidad del Sistema

Cromatograma N°55: Primera Inyección

Cromatograma N°56: Segunda Inyección

Cromatograma N°57: Tercera Inyección

121

Cromatograma N°58: Cuarta Inyección

Cromatograma N°59: Quinta Inyección

Cromatograma N°60: Sexta Inyección

122

Anexo 8: Repetibilidad del Método

Cromatograma N°61: Primera Muestra

Cromatograma N°62: Segunda Muestra

Cromatograma N°63: Tercera Muestra

123

Cromatograma N°64: Cuarta Muestra

Cromatograma N°65: Quinta Muestra

Cromatograma N°66: Sexta Muestra

124

Anexo 9: Precisión Intermedia

Analista A




125




126

Analista B




127




128

Anexo 10: Robustez

Cromatograma N°79: Muestra a condiciones normales

Cromatograma N°80: Muestra con Volumen modificado

Cromatograma N°81: Muestra con variación de flujo

129

Cromatograma N°82: Muestra Refrigerada

Cromatograma N°83: Muestra con cambio de columna

Cromatograma N°84: Muestra con fase móvil modificada

130

Anexo 11: Criterios de Aceptación de los Parámetros de Validación

Fuentes: Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria (AEFI), Validación de Métodos Analíticos, Madrid: Gráficas Gispert S.A., 2001.

States Pharmacopeial Conv. Inc., United States Pharmacopeia 35 NF 30, Monografías Oficiales, 2012.

PARÁMETRO DE

VALIDACIÓN ESPECIFICACION

SELECTIVIDAD Interferencia no mayor a 2 %

LINEALIDAD DE SISTEMA




Test de Linealidad

CV Factor de Respuesta: CV (f) < 5 %






LINEALIDAD DE MÉTODO




Test de Linealidad

CV Factor de Respuesta: RSD < 5 %






EXACTITUD

Porcentaje de recuperación: 97%-103%

Test de G de Cochran: G exp < G tablas

Test de T de Student: T exp < T tablas

PRECISION

Repetibilidad del sistema: RSD < 2 %

Repetibilidad del método: RSD < 2 %

P. Intermedia: RSD entre analistas < 3 %

ROBUSTEZ RSD < 2 %

PERFIL DE ANTEPROYECTO DE TESIS

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