El PCR es una Técnica desarrollada en los años 80 por el científico Kary Mullis , esta técnica de laboratorio permite multiplicar una cadena de DNA varias veces si dañar su estructura o hacerlo de manera incorrecta , como el nombre lo dice se basa en la actividad de la DNAplimeraza que como ya sabemos es una enzima que replica el DNA de manera idéntica, es decir que la sensibilidad y especificidad de el procedimiento es impecable Entonces en grandes rasgos lo necesario para este procedimiento es que se debe de tener en un medio , el fragmento de DNA que se quiera ser replicado , nucleótidos y una molécula de DNA que funcione como primer. Entonces ¿En que nos beneficia la técnica de PRC en tiempo real “cuantitative polymerase chain reaction"? Esto nos sirve para que el fragmento de DNA se amplifique se puede observar a mas detalle los componentes de este , utilizando marcadores de florescencia y marcadores antígeno puede ayudar o determinar el diagnostico de enfermedades virales. El procedimiento se lleva acabo en ciclos donde se alterna entre temperaturas altas y bajas , así que para evitar que la DNA polimerasa se desnaturalice por el cambio de temperaturas se utiliza DNApolimerasas termoestables extraídas de microorganismos capaces de adaptarse a esas temperaturas

¿Qué consideraciones deben tomarse en este procedimiento? • Consideraciones de la muestra ; Tipo ,Volumen de muestra a procesar , Nivel de ácido nucleico , Propiedades físicas de la muestra ,Presencia o ausencia de inhibidores de la amplificación

• Características de los ácidos nucleicos : Si la muestra es de DNA o RNA La consideración mas importante es que este procedimiento solo s puede llavar acabo con DNA ,pero si en algún momento se llega a tener solo RNA se pueden utilizar una enzmia llamada retrotranscriptasa que como los dice su nombre transcribe en “reversa” , en lugar de DNARNA , transcribe RNADNA.

Material Necesario para el procedimiento

-Los 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato

-Los primers que son secuencias cortas,

de DNA entre seis y cuarenta

nucleótidos que permiten que la

polimerasa inicie la reacción. Deben

estar situados enfrentados y a no mucha

distancia.

-El medio adecuado con iones como MG

,MGCL2 y K o *(Mn2+), el Mn es poco

usado porque incrementan la tasa de

error durante la síntesis de

DNAPolimerasa por ser cofactor

mutageno.

-El buffer que mantiene el pH adecuado

-ADN polimerasa termoestables

-ADN molde

-Termociclador con capacidad para

detectar y medir la fluorescencia.

-Sondas con marcadores de fluorescencia o

flourocromos

A partir de esto podemos saber la diferencia

entre el PCR normal y el PCR de tiempo

real , en donde en el PCR de tiempo real

nos permite hacer la cuantificación de los

nucleótidos en el momento de el

procedimiento.

¿Cómo se identifican ?

Se emplean diferentes tipos de marcadores : los

agentes intercalantes y las sondas de hibridación.

Empleando un agente intercalante de unión

inespecífica a la doble hebra de ADN,

generalmente SYBR Green, podemos

identificar fragmentos amplificados de DNA

concretos a partir de la temperatura de fusión .

La principal limitación de estos marcadores es

que al unirse al total de ácidos nucleídos en la

reacción de la PCR, emiten una señal

luminosa tanto para productos específicos

como para aquellos que no lo son. Por eso se

analiza la curva de fusión, porque aquí se

puede cuantificar de manera especifica la

Y empleando sondas con fluorescencia para

detectar específicamente una secuencia se

utilizan sondas de DNA polimerazas etiquetadas

con fluoróforos.

La intensidad de la señal se relaciona con la cantidad de producto de PCR de dos formas: a) una disminución del amortiguamiento de la fluorescencia dependiente de producto, en la que el fluoróforo (la molécula delatora) y el amortiguador (quencher) se separan al unirse la sonda al DNA que se va a replicar b) un incremento de la transferencia de energía resonante fluorescente (FRET) del donador al fluoróforo aceptor al quedar cercanos cuando se une la sonda a la diana.

Proceso de PCR

El procedimiento es dentro del termociclador ,

por ciclos en los cuales en cada uno se varia la

temperatura de acuerdo al lo que se quiere

realiza.

Fase de desnaturalización (95°C): la cadena en

estructura doble es

desnaturalizada

Fase de Alineamiento (50-60°C): A

cadacadena simple de ADN se le une un

primer y un marcador fluorescente.

Fase de Elongación (70°C): La DNA

polimerasase une al fragmento de ADN

comienzala replicación del fragmento deseado.

En la PCR en TR el marcador fluorescentese

activa con la unión de la polimerasa

(RT-PCR, del inglés reverse transcriptase PCR), en la cual

existe un paso de retrotranscripción de ARN a ADN pero

que no necesariamente cuantifica el producto a tiempo

real.

Para ello emplea, del mismo modo que la PCR convencional, un molde de ADN, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, y una ADN polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo que, en un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada, permita medir la tasa de generación de uno o más productos específicos.1 Dicha medición, se realiza luego de cada ciclo de amplificación y es por esto que también se le denomina PCR en tiempo real. En muchos casos el molde que se emplea para la PCR cuantitativa no es desde el principio ADN, sino que puede ser ADN complementario (ADNc), de hebra simple, obtenido por retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN); en este caso, la técnica es una RT-PCR cuantitativa, RT-PCR en tiempo real o RT-Q-PCR. Debe evitarse la confusión con la técnica denominada «PCR tras transcripción inversa»

La cuantificación puede realizarse en términos absolutos o relativos. En el primer caso, la estrategia es relacionar la señal de amplificación obtenida con el contenido en ADN empleando una curva de calibrado; para este enfoque es vital que la PCR de la muestra y de los elementos de la recta de calibrado posean una misma eficiencia de amplificación. En el segundo caso, se expresa el cambio en los niveles de expresión de ARN mensajero (ARNm) interpretado como ADN complementario (ADNc, generado por retrotranscripción del ARNm); esta cuantificación relativa es más fácil de realizar, puesto que no requiere curva de calibrado, y se sustenta en la comparación entre el nivel de expresión del gen a estudiar versus un gen control (también llamado de referencia, interno o normalizador o, en inglés, housekeeping gene. Por tanto, en la cuantificación relativa es irrelevante en qué unidades se expresa la cuantificación, y sus resultados son comparables entre múltiples experimentos de RT-Q-PCR. De hecho, el propósito de emplear uno o más genes de normalización es corregir la variación no específica, como las diferencias en la cantidad y calidad del ARN empleado, que pueden afectar a las eficiencias de retrotranscripción y de PCR. No obstante, el aspecto crucial es que la estabilidad del gen de referencia sea una realidad

La selección de los genes internos se ha realizado clásicamente en Biología Molecular analizando la estabilidad de la expresión en estudios cualitativos o de baja sensibilidad, como el examen visual de geles de ARN, densitometría de Northern blots o PCR semicuantitativa (PCR mimic). En plena era de la genómica, es posible realizar una aproximación a gran escala empleando los chips de ADN para muchos organismos.11 No obstante, se ha descrito que la mayoría de los genes empleados como normalizadores en la cuantificación de la expresión de ARN mensajero varían según las condiciones experimentales.12 13 14 Por ello, es preciso realizar un estudio metodológico previo a emplear a fin de seleccionar, con ayuda de herramientas estadísticas, los más aprodiados

Se han desarrollado varios algoritmos estadísticos

que detectan qué gen o genes son los más

apropiados para la normalización de un conjunto de

tejidos bajo unas condiciones dadas: algunos, como

geNORM o BestKeeper, realizan, sobre una matriz

de expresión de genes de referencia para diversos

tejidos, comparaciones por pares y medias

geométricas

Aplicaciones Medicas

Las aplicaciones medicas consisten

básicamente en la detección de agentes

infeccioso que causan signos y síntomas

confusos pero graves , un ejemplo muy común

de la utilización de este método para el

diagnostico de Hepatits B , como ya

mencionamos esta técnica nos permite tener

un muy alto grado de confiabilidad y rapidez

por lo tanto es muy útil para casos que

requieran de un diagnostico rápido.