Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)UAI-Estructura y Dinmica Celular2008

Dr. Juan Jos Valdez Alarcn

Reaccin en cadena de la ADN polimerasa (PCR)

Amplificacin exponencial en la PCRSi en cada ciclo la cantidad de ADN se duplica, entonces la multiplicacin de la molcula molde se puede calcular como 2n

Entonces en 30 ciclos y suponiendo 100% de eficiencia de la reaccin: 230 = 1.07 X 109

Requerimientos para la PCRcido nuclico molde (ADN o ARN; total, nuclear, de plstido)Un par de oligonucletidos complementarios a una secuencia blancoADN polimerasa termoestable, dNTPsTermociclador

INGENIO !!!

Componentes de la reaccinAmortiguador (Tris-HCl 10 mM pH 8.0)KCl 10-50 mMMgCl2 1-4 mMdNTPs 200-500 MADN molde 0.1-100 ngOligonucletidos 100-500 nMADN polimerasa (Taq) 2.5 unidadesAditivos

Condiciones en el termociclador2-5 minutos, 95C; desnaturalizacin inicial

45 segundos, 95C; desnaturalizacin45 segundos, 60C; alineamiento1 minuto, 72C; extensin

7 minutos a 72C; extensin final

Marcadores molecularesMetodologas basadas en la PCR

Metodologas basadas en la PCRRAPD aislados Staphylococcus spp.

Metodologas basadas en la PCROligos especficos Staphylococcus spp.

Cuando no se conoce la secuencia blancoSe conocen protenas o secuencias de cidos nuclicos homlogosDiseo de oligonucletidosATG-GCT-GGT-AAT-GAA-TGG-ATT-AAT-GGT-TAT GCC GGC AAC GAG ATC AAC GGC GCA GGA ATA GGA GCG GGG GGG M A G N E W I N G YATG-GCI-GGI-AAY-GAR-TGG-ATH- AAY- GGI-TATI=inosina Y=pirimidina R=purina K=keto M=methylW=weak S=strong B=no A D=no C H=no G V=no T

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