Patología molecular del Virus del papiloma humano · La detección del ADN-VPH puede utilizarse...
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Patología molecular y el Patología molecular y el Virus del papiloma humanoVirus del papiloma humano
Servicio de Anatomía PatológicaServicio de Anatomía PatológicaHospital General Universitario de Hospital General Universitario de Ciudad RealCiudad Real
El virus del El virus del papiloma papiloma humanohumano
Ciclo de vida del VPHCiclo de vida del VPH
Infección de células basales Infección de células basales Síntesis Pr. Síntesis Pr. precoces (E) no estructurales precoces (E) no estructurales Replicación Replicación episomal del ADN episomal del ADN (Hib. In situ)(Hib. In situ)
Infección latente Infección latente Coilocito Coilocito Integración Integración (Hib. In situ)(Hib. In situ) + +
Oncogenes + Genes supresores Oncogenes + Genes supresores Carcinoma infiltranteCarcinoma infiltrante
Coilocito Coilocito Síntesis productiva ADN Síntesis productiva ADN Síntesis Pr. tardías (L) cápside Síntesis Pr. tardías (L) cápside (IHQ)(IHQ) Partículas virales Partículas virales (M.E.)(M.E.) Transmisión…. Transmisión….
Hematoxilina-Eosina. Hematoxilina-Eosina. DisplasiaDisplasia
Hematoxilina-Eosina. Hematoxilina-Eosina. Carcinoma epidermoideCarcinoma epidermoide
High grade lesions. Pap High grade lesions. Pap smearsmear
p16
FASES DE LA TÉCNICA FASES DE LA TÉCNICA MOLECULAR VPHMOLECULAR VPH Extracción del ADNExtracción del ADN Amplificación del ADN (PCR)Amplificación del ADN (PCR) Detección del virus VPHDetección del virus VPH En los casos positivos: Tipificación del En los casos positivos: Tipificación del
VPHVPH
Toma cervico-vaginal para Toma cervico-vaginal para estudio ADNestudio ADN Abstinencia sexual de 72 horasAbstinencia sexual de 72 horas No exámenes digitales, colposcopia, lavados, No exámenes digitales, colposcopia, lavados,
medicación local ni estudios transvaginales previos.medicación local ni estudios transvaginales previos. Se aconseja realizarla 6 días anteriores y/o Se aconseja realizarla 6 días anteriores y/o
posteriores a la menstruación.posteriores a la menstruación. Si se han efectuado tomas de biopsia y/o terapias Si se han efectuado tomas de biopsia y/o terapias
locales, esperar 30 días.locales, esperar 30 días. Tras tratamientos (crioterapia, Leep, conización a Tras tratamientos (crioterapia, Leep, conización a
bisturí) se recomienda esperar 60 días.bisturí) se recomienda esperar 60 días.
1. Extracción de ADN
Citología líquidaCitología líquida
Cytyc PreservCytCytyc PreservCytDigene Cervical Sampler Digene Cervical Sampler
RECEPCIÓN DE RECEPCIÓN DE MUESTRASMUESTRAS Torundas de Torundas de
alginato o algodón alginato o algodón o envases de o envases de citología líquidacitología líquida
Congelador para:Congelador para:– Almacenar muestras Almacenar muestras
hasta su hasta su procesamientoprocesamiento
ExtracciónExtracción
Extracción de ADN (I)Extracción de ADN (I) Digestión proteinasa K: Calor (termoblock): 56º Digestión proteinasa K: Calor (termoblock): 56º
Torundas: 15 minutos; Biopsias: NocheTorundas: 15 minutos; Biopsias: Noche Centrífuga en algunos pasosCentrífuga en algunos pasos
Extracción ADN (y II)Extracción ADN (y II) Biorrobot QIAGEN EZ1 Biorrobot QIAGEN EZ1
(1/2 hora)(1/2 hora)
2. Amplificación del 2. Amplificación del ADN ADN PCRPCR
Reacción en Cadena de la Reacción en Cadena de la Polimerasa: amplificar ADNPolimerasa: amplificar ADN
Amplificación del ADNAmplificación del ADN Termociclador: 45 ciclos de 94º, 55º y 72º Termociclador: 45 ciclos de 94º, 55º y 72º
(6 horas)(6 horas)
PCRPCR
PCR PCR
Ciclos deCiclos dePCRPCR
Desnaturalización
94º C
Hibridación55º C
Síntesis74º C
Desnaturalización94º C
Hibridación55º C
Síntesis74º C
3. Detección y tipificación del Detección y tipificación del virus de papiloma humano virus de papiloma humano
3.a. Lectura3.a. Lectura(Lo que antes (Lo que antes
hacíamos)hacíamos)
Antes: Electroforesis en gel de Antes: Electroforesis en gel de agarosa teñido con bromuro agarosa teñido con bromuro de etidio de etidio (calidad y (calidad y cantidad de cantidad de ADN)ADN)
Amplificación de HPV tipo 16. Amplicones de 217 bp en líneas 3, 4, 8 y 9. La línea 1 es un control negativo (ADN de placenta). La línea 2 es un control positivo.
KitsKits
Detección del VPH: Antes Detección del VPH: Antes usábamos gelesusábamos geles
Realizar Realizar gel de agarosagel de agarosa (1 (1 hora)hora)
Bromuro de etidio como Bromuro de etidio como marcador fluroescentemarcador fluroescente
Microondas, Cubeta de Microondas, Cubeta de electroforesiselectroforesis
Añadir solución de carga Añadir solución de carga y y conectarconectar corriente e. (2 corriente e. (2 horas)horas)
Detección de VPH: Detección de VPH: InterpretaciónInterpretación
Identificación del VPH: Identificación del VPH: TipadoTipado
Tipado del VPHTipado del VPH
Identificación del VPH: Identificación del VPH: TipadoTipado
DesnaturalizarDesnaturalizar HibridarHibridar CapturarCapturar DetectarDetectar LeerLeer
Otra técnica diferente: La Otra técnica diferente: La captura de híbridoscaptura de híbridos
3.b. Lo que ahora hacemos: 3.b. Lo que ahora hacemos: Automatización mediante Automatización mediante arrays de baja densidadarrays de baja densidad Clinical Arrays® (Genómica S.A.U.): Clinical Arrays® (Genómica S.A.U.): 120 pocillos con secuencias de ADN específicas120 pocillos con secuencias de ADN específicas
Lectura automatizadaLectura automatizada
Caso negativoCaso negativo VPH 16 positivoVPH 16 positivo
Leyenda:• R, marcas de posición del Array de ADN CI, control interno para la reacción de PCR ADN, control de calidad de ADN de la muestra
70 71 72 73 81 82 83 84 85 611
R
51 53 54 56 58 59 61 62 66 68
52 18 26 31 33 35 39 40 42 43 44 45
81 82 83 84 611
89 CI DNA 6 11 16
54 56 58 59 61 62 66 68 70 71 72 73
31 33 35 39 40 42 43 44 45 51 52 53
82 83 84 85 89 CI DNA 6 11 16 18 26
56 58 59 61 62 66 68 70 71 72 73 81
CI 39 40 42 611
44 45 51 52 53 54 35
R DNA 6 11 16 18 26 31 33 R
CLART HPV-2 (array strips)
Lectura automatizadaLectura automatizada
VPH 16VPH 16
Importancia de la determinación del VPH
Ejemplos de aplicación de Ejemplos de aplicación de PCRPCR
HPV L1 Virus-Like Particle HPV L1 Virus-Like Particle (VLP) Vaccine Synthesis(VLP) Vaccine Synthesis
L1 L1 gene gene
on on HPV HPV DNADNA
L1 gene L1 gene inserted into inserted into
genome of genome of yeast or BCVyeast or BCV
Yeast/BCV Yeast/BCV DNADNA
mRNmRNAAtRNAtRNA
rRNrRNAA
TranscriptioTranscriptionn
TranslatiTranslationon
Capsid Capsid proteinsproteins
Empty viral capsids
Elicits Elicits humoralhumoral
immune immune response response
in hostin host
VLP = Virus-like peptideYeast Cell (or Yeast Cell (or Baculovirus Expression System)
ConclusionesConclusiones
El potencial El potencial clínicoclínico de la detección del ADN-VPH de la detección del ADN-VPH en el presente contribuye: en el presente contribuye:
– Una mejor evaluación diagnóstica morfológica cito-Una mejor evaluación diagnóstica morfológica cito-colpo-histológica.colpo-histológica.
– Detección de tipos virales oncogénicos en pacientes con Detección de tipos virales oncogénicos en pacientes con citologías anormales y/o imágenes colposcópicas no citologías anormales y/o imágenes colposcópicas no concluyentes.concluyentes.
– Manejo y control posterapéutico de las lesiones Manejo y control posterapéutico de las lesiones intraepiteliales. intraepiteliales.
– Provee un método de control de calidad para los Provee un método de control de calidad para los exámenes cito-colpo-histológicos.exámenes cito-colpo-histológicos.
La detección del ADN-VPH puede utilizarse como La detección del ADN-VPH puede utilizarse como método de método de cribadocribado como complemento del como complemento del Papanicolaou.Papanicolaou.