Pasos de reproducción de los hongos entomopatogenos

Escuela Nacional de Agricultura “Roberto Quiñonez” Página 1

AGRADECIMIENTOS

Gracias a Dios sobre todo por haber permitido culminar con éxito esta capacitación que aumentó en gran medida mi conocimiento, y por supuesto la experiencia adquirida.

Agradecimiento a la institución de Procafe por brindarme la oportunidad de aprender este proceso tan valioso para el crecimiento personal y para el mejoramiento de la agricultura en el país.

Agradecimiento especial al Dr. Adán Hernández por todo el apoyo brindado en el proceso de aprendizaje del método de reproducción de hongos e2ntomopatógenos.

Especial agradecimiento a la Sr. Sonia Rojas y al Sr. Elías Rojas por tomarse el tiempo y la molestia de enseñarme paso a paso y con toda paciencia todo acerca de este importantísimo tema, y a Juancito, que con su sonrisa alegraba mas cada día que estuve en la Finca San Antonio.

Sobre todo quiero agradecer al que hizo posible todo esto, después de Dios, el Ing. Andrés García por tomarme en cuenta para llevar a cabo tan importante proyecto, por proporcionar sin esperar nada a cambio los medios necesarios para que asistiera cada día a aprender y a aumentar mi conocimiento en la Finca San Antonio.


INDICE

INTRODUCCIÓN……………………………………………………………..………………4

1. AISLAMIENTO ………………………………………………………………………………..5

a. Preparación de medio de cultivo………………………………………………………5

b. Recolección de insectos o reactivación de patogenicidad……………………....6

c. Aislamiento de cepa……………………………………….…………………………….7

2. MULTIPLICACIÓN …………………………………………...............................................8

a. Repique……………………………….…………………………………………….……8

b. Preparación de medio liquido para la inoculación de bolsas con arroz…......9

c. Inoculación de bolsas.........................................................................................10

3. PRODUCCIÓN .............................................................................................................10

a. Proceso de secado, empacado y almacenado…………………………..………10


INTRODUCCION

La reproducción de hongos entomopatógenos en laboratorio se da con la

necesidad de encontrar medios alternativos para el combate de plagas

denominándose estos, medios biológicos de control de plagas. En el presente

trabajo se explica el proceso de reproducción de hongos

e4entomopatógenos en general, pero sin perder de vista el objetivo principal

que es la reproducción de Beauveria brongniartii para el combate del picudo

del plátano en la Escuela Nacional de Agricultura.

Esta iniciativa nace de la idea de fomentar una agricultura independiente y

natural u orgánica en la ENA, lo cual en coordinación con la institución de

Procafe surge el desarrollo de una capacitación para documentar y

proporcionar un guía que sirva para la enseñanza de los estudiantes, ya que

es necesario fomentar otras técnicas y alternativas de producción agrícola

con enfoque en la sostenibilidad y la salud; y dejar a un lado la tonta escuela

del padre de la revolución verde el Dr. Norman Borlaug.


1. AISLAMIENTO

El aislamiento es el proceso mediante el cual a partir, de un insecto infestado con el hongo, generando las condiciones adecuadas, se induce al crecimiento del mismo, para obtener un inoculo apto para la reproducción. Esta etapa del proceso consta de tres partes importantes que son la elaboración de medios de cultivo, la reactivación de patogenicidad y el aislamiento de sepas.

a. Elaboración de medio de cultivo P.D.A.

Esta fase del proceso se lleva a cabo con el fin de generar las condiciones ideales para la reproducción del hongo en cuanto a sostén y nutrición, para lo que se utilizan los siguientes materiales y utensilios:

40 gr de P.D.A. 1 litro de agua destilada matraces erlenmeyer Y una bascula para gramos Un agitador magnético Cajas petri Autoclave Algodón Plástico termoaislante Papel aluminio Cámara de refrigeración Cámara de flujo laminar

Procedimiento

Medir y pesar los ingredientes de la mezcla, cabe mencionar que esto puedo hacerse en menor cantidad teniendo en cuenta la proporcionalidad de los materiales mezclados y sabiendo que se usan 20 ml de la mezcla para una caja petri de 10 centímetros. Teniendo esto.

Tener a la mano todos los instrumentos a utilizar para no retrasar el proceso. Colocar el un matraz erlenmeyer el agua destilada y el P.D.A. Poner el matraz con la mezcla en el agitador magnético; agitar y calentar a 200°C hasta que

comience a hervir. Sacar el matraz con cuidado y taparlo con algodón, plástico termoaislante y cubrir el tapón

con papel aluminio.


Colocar las cajas petri y el matraz con la mezcla en el autoclave y esterilizar con 15 lbs. de presión a 120°C durante 15 minutos. (hacer ingresar la presión poco a poco para evitar que se destape el contenedor del líquido, sacar la presión de la misma manera).

Retirar los utensilios esterilizados del autoclave y dejar que se enfríen durante media hora. En la cámara de flujo laminar, encender dos mecheros bunsen en dirección de donde se está

realizando la preparación del medio de cultivo. Se destapa el matraz y se le agregan 3 gotas de acido láctico a la mezcla para acidificar el

medio y evitar la proliferación de bacterias. Llenar las cajas petri esterilizadas hasta la tercera parte con la mezcla, teniendo el cuidado

de no abrirlas demasiado para que no se contaminen, se pone a todo el contorno de la caja petri plástico termoaislante para sellarlas.

Guardarlas en cuarto frio a 10°C hasta utilizarlas.

b. Reactivación de patogenicidad

La reactivación de patogenicidad es la infestación manual o artificial del insecto con el hongo entomopatogeno para poder aislar la cepa, esto se hace cuando en el campo no se encuentran insectos infectados para el aislamiento; en este proceso simple pero importante se utiliza lo siguiente:

Insectos vivos Tubos de ensayo Beakers de 500 ml y de 200 ml Papel filtro Agua destilada Caja petri con repique del hongo

o arroz inoculado con hongo Plástico termoaislante Jeringa Pinzas o pincel Colador fino Hazas

Procedimiento Cortar ruedas de papel filtro del tamaño del interior de los tubos de ensayo, esto se hace

tomando en tubo de ensayo y marcando el contorno de este en el papel filtro, luego introducir una de estas ruedas en cada tubo de ensayo.

Poner agua destilada en los beakers, 200 ml en el de 500 ml y 100 ml en el de 200 ml. Tomar la caja petri con el repique del hongo y con una haza soltarlo todo y colocarlo en los

100 ml de agua destilada, o tomar el arroz inoculado con hongo y ponerlo en una malla fina y sumergirlo en el agua destilada para separar las esporas del hongo del arroz.


Hacer pasar los insectos por los 200 ml de agua destilada para limpiarlos por un minuto, moverlos con las pinzas o con el pincel para que se mojen completamente y colarlos.

Hacerlos pasar los insectos por la solución de agua destilada y hongo por un minuto, moverlos al igual que el paso anterior.

Tomar con el pincel o con las pinzas los insectos que aun estén vivos debido a que algunos mueren en el proceso, colocar uno en cada tubo de ensayo y para asegurarse de que vaya infectado con el hongo se hacen pasar por el hongo que ha quedado en el colador, esto antes de colocar el insecto dentro del tubo de ensayo.

Se sella en tuvo con plástico termoaislante. Con una jeringa se le agregan dos gotas de agua destilada a cada insecto ya en los tubos de

ensayo, esto debe hacerse todos los días durante 15 días o hasta que el hongo emerja del insecto.

Llevarla la gradilla con los tubos de ensayo al cuarto de crecimiento durante 15 días aproximadamente.

c. Aislamiento de cepas

El aislamiento de cepas, se hace a partir de una fracción del hongo propiamente o como es más común de un insecto parasitado con el hongo, esto con el objetivo de obtener un inoculo adecuado para reproducirlo a mayor escala en una base de arroz, en este proceso se utilizan los siguientes materiales y utensilios:

Alcohol 90° Agua destilada y esterilizada Cajas petri con medio de P.D.A. Cámara de flujo laminar Hazas Mecheros Plástico termoaislante Insectos infectados con el hongo Un cronometro

Procedimiento

Colocar todos los insectos en una caja petri y llevarlos a la cámara de flujo laminar. En la cámara de flujo laminar, encender dos mecheros en dirección de donde vamos a

trabajar y colocar también tres tapaderas de caja petri, una con agua destilada y esterilizada, una con alcohol, otra con agua destilada y esterilizada, y un trozo de papel toalla para secar los insectos; debe ser precisamente en este orden.

Pasar los insectos, uno por uno, en el agua destilada-esterilizada durante un minuto exacto, mover con las hazas para que se moje completamente; luego por el alcohol medio minuto exactamente, mover con las hazas para mojarlo bien; después por la otra agua destilada-esterilizada un minuto exactamente, mover con las hazas para mojarlo


bien y por ultimo poner un minuto en el papel toalla para secarlo y moverlo para que se seque completamente.

Cuando falten 15 segundos para que se termine el minuto de secado, quitarle el plástico a la caja petri y flamearla.

Tomar el insecto con las pinzas cuidando de no aplastarlo y colocarlo en el centro de la caja petri.

Cerrarla, flamearla y sellarla con plástico termoaislante. Llevar los aislamientos al cuarto de crecimiento.

2. MULTIPLICACIÓN

La multiplicación es el proceso de reproducción de hongos entomopatogenos de forma masiva como producción comercial. Esta parte del proceso de producción lleva consigo tres etapas que son: el repique, la preparación de medio líquido de papa para la inoculación de las bolsas con arroz y la inoculación de las bolsas.

a. Repique

El repique no es más que tomar una parte del hongo obtenido en una caja petri a través de un aislamiento y colocarlo en una nueva caja petri con medio de cultivo para que este se reproduzca y crezca para poder tener un inoculo puro del hongo entomopatogeno, para este proceso se necesita:

Cámara de flujo laminar Caja petri con el hongo (aislamiento) Cajas petri o tubos de ensayo con medio de cultivo Hazas Mecheros Plástico termoaislante Algodón

Procedimiento

En la cámara de flujo laminar, encender los mecheros en dirección de donde se va a trabajar.

Abrir la caja petri del aislamiento y flamearla. Con las hazas raspar el hongo sin tomar medio de cultivo, tomar aproximadamente un

gramo de este y colocarlo en una caja petri o tubo de ensayo que solo contenga en medio de cultivo, procurando que la porción de hongo quede en el centro del utensilio.

Flamear la caja petri y sellarla con plástico termoaislante. En caso de que sea tubo de ensayo de colocarse el tapón de algodón y poner alrededor de este, no sobre este, plástico termoaislante.


b. Preparación de medio liquido para inoculación de bolsas con arroz

La preparación de este medio de cultivo líquido es parte importante del proceso de multiplicación del hongo entomopatogeno, se hace con el fin de obtener una inoculación uniforme de las bolsas que contienen el arroz que posteriormente se va a comercializar. En este proceso se utiliza lo siguiente:

Una papa pequeña 5 gr de azúcar Cocina o estufa Agua destilada Autoclave Erlenmeyer Caja petri con repique del hongo Agitador magnético Hazas Colador Olla Cámara de flujo laminar Acido láctico

Preparación

Lavar y picar la papa en cuadros pequeños. Cocer la papa en la estufa, en una olla pequeña con agua destilada suficiente para cubrir la

papa. Cuando estén blandita se debe colar, luego triturar la papa hasta hacer un puré fino, y

luego colar el puré utilizando la misma agua en la que se cocieron las papas, esto hasta mezclar el puré con el agua, agregar la azúcar y hacer llegar la mezcla a 250 ml con agua destilada si es que falta.

Colocar la mescla en un erlenmeyer, ponerle tapón de algodón, plástico termoaislante y papel aluminio y llevar al autoclave por 15 minutos a 120°C y 15 lbs. de presión.

Dejar que enfrié totalmente. En la cámara de flujo laminar agregarle una gota de acido láctico. Colocar la mezcla en el

agitador magnético a 200 RPM siempre en la cámara de flujo laminar y con el haza separar un cuarto del hongo de la caja petri y agregarlo a la mezcla.

Llevar la preparación al cuarto de crecimiento y colocarlo en el agitador magnético durante dos días. Esto es muy importante, la mezcla debe pasar dos días en constante agitación en el cuarto de crecimiento.

Después de los dos días mirar por el microscopio una muestra de la mezcla y observar si esta tiene esporas de hongo o solo micelio, si no muestra esporas no sirve para la


inoculación igual si se ven otro tipo de esporas o de micelio que no son las del hongo en reproducción esta mezcla no sirve y se debe votar.

c. Inoculación de bolsas

La inoculación de las bolsas es el proceso final de la multiplicación, es en este paso que se prepara el arroz que posteriormente se va a comercializar, para esto se utiliza lo siguiente:

Arroz blanco no precocido Bolsas de polipropileno Medio liquido de papa para la inoculación Engrapadora Autoclave Dispensador Agua destilada y esterilizada

Preparación

Llenar las bolsas de polipropileno con 300 gr de arroz. Agregar 90 ml de agua a las bolsas y moverlo hasta mezclar bien el agua con el arroz. Hacer tres dobleces en la parte superior de la bolsa y poner dos grapas una en el centro y

la otra en un extremo, el otro extremo debe quedar libre para inocular posteriormente. Llevar las bolsas al autoclave durante 15 minutos a 120°C con 15 lbs. de presión. Sacar las bolsas del autoclave y dejarlas enfriar totalmente. Colocar la mezcla liquida de papa para inoculación en el dispensador En la cámara de flujo laminar, con el dispensador colocar 20 ml de la mezcla en cada bolsa

y sellar el extremo que estaba abierto con una grapa. Mover el arroz para mezclarlo uniformemente con el inoculo. Llevar al cuarto de crecimiento y dejar reposar las bolsas durante 10 días sin moverlas. El

arroz dentro de las bolsas debe de quedar extendido y no compactado.

3. PRODUCCIÓN

La producción es el proceso final de la producción de hongos entomopatogenos en la que se cosecha el hongo, se seca y se empaca. a. Proceso de secado, empacado y almacenado

En este proceso se prepara el arroz para su comercialización y para esto se utiliza lo siguiente: Zarandas Recipiente para embolsar Bascula de gramos Bolsas de empaque termoaislante

Procedimiento


Sacar las bolsas con arroz del cuarto de crecimiento después de los 10 días, solo si en estas el hongo se ha reproducido totalmente es decir el arroz debe estar cubierto de hongo.

Sacar el arroz de las bolsas y colocarlo en las zarandas en un cuarto de secado con aireación natural o aire acondicionado.

Dejar el arroz secando durante 10 días Sacarlo de la zaranda y con el recipiente tomar un poco, colocarlo en la báscula y medir

1000 gr de arroz o una libra o la cantidad que se quiera colocar en cada bolsa. Empacarlo, sellarlo ya sea con una selladora al vacio, o con tres dobleces en la parte

superior y tres grapas. Llevar las bolsas empacadas al cuarto de almacenamiento y guardarlo ahí hasta su

comercialización o utilización.


ANEXOS


Pasos de reproducción de los hongos entomopatogenos

Documents

Transcript of Pasos de reproducción de los hongos entomopatogenos