Universidad Central de VenezuelaFacultad de CienciasEscuela de BiologaLaboratorio Avanzado de Biologa Celular

Papel de la orina de roedores (Mus musculus) como componente epidemiolgico en la transmisin de T. cruzi.

Tutor: Autor: Lcdo. Arturo Muoz Caldern Ricardo Romero Seccin de Inmunologa C.I. 20.090.640Instituto de Medicina Tropical Dr. Flix PifanoUniversidad Central de Venezuela

Caracas, julio de 2015Introduccin

La Tripanosomiasis Americana es una infeccin parasitaria causada por Trypanosoma cruzi, un protozoario que infecta mamferos silvestres y domsticos transmitida por vectores reduvdeos, denominados coloquialmente chipos o pitos en Venezuela, cuya transmisin natural hasta ahora se ha restringido al continente americano (Noya y col, 2010). Este parsito se caracteriza por la presencia de un solo flagelo y una sola mitocondria; su genoma se encuentra ordenado en una compleja y compacta regin (dentro de la propia mitocondria, y cerca de la base del flagelo), denominada kinetoplasto. El reservorio natural del parsito lo constituyen los armadillos, marsupiales, murcilagos y primates silvestres, adems de ciertos animales domsticos como perros, gatos e incluso ratas y cobayos. La importancia de esta enfermedad radica en su elevada prevalencia, su baja tasa de curacin, las grandes prdidas econmicas por incapacidad laboral, y la muerte repentina de personas aparentemente sanas. Adems, la OMS la contempla dentro de la lista de las principales "enfermedades desatendidas" (WHO. 2010). Esta parasitosis se desarrolla en tres fases definidas: la aguda, que se presenta con fiebre, dolores de cabeza, agrandamiento de ganglios, hgado y bazo; la indeterminada, fase asintomtica, de duracin variable sin parasitemia detectable; y la crnica, en la que se presentan alteraciones del sistema nervioso de diversos rganos, particularmente el corazn y vsceras donde se originan los denominados megasndromes (Diaz-Limay y col, 2004). Para explicar el complejo ciclo de vida de este parsito empezaremos en el momento en que ocurre la contaminacin del hospedador vertebrado. Esto se lleva a cabo cuando un triatomino infectado defeca sobre la piel del vertebrado luego de alimentarse de su sangre. En la heces del insecto se haya la forma infectante del parsito, el tripamastigote metacclico. Este se caracteriza por una gran movilidad que le permite entrar al organismo por escoriaciones, lesiones en la piel o por las mucosas y llegar al torrente sanguneo. Una vez all pueden invadir a la mayora de las clulas del hospedador donde se trasforman a la forma amastigote (forma replicativa dentro del hospedero vertebrado); presenta forma redondeada, y con un flagelo externo muy corto o inexistente. El amastigote se convierte en tripomastigote sangucola, los cuales por procesos mecanicos son capaces de romper las clulas que los contienen y liberarse al medio externo donde los tripomastigote son capaces de infectar otras clulas, repitindose el ciclo de multiplicacin. Durante la fase sangucola puede ser ingerido por el vector. Una vez dentro del vector, estas formas se transforman en epimastigotes, forma mvil y replicativa a nivel de intestino medio.Otras formas alternativas de transmisin al ser humano son las siguientes: Por transfusin: Producida por la presencia de tripomastigotes sangucolas en el producto a transfundir, sangre o sus derivados, proveniente de donantes con infecciones ignoradas o sin adecuado diagnstico en bancos de sangre. Por trasplante: Formas amastigotes tisulares de T. cruzi contenidos en rganos trasplantados a un receptor, quien adems recibe inmunosupresin para evitar el rechazo del rgano. Transplacentaria: La infeccin al recin nacido puede suceder por el paso de formas tripomastigotes, desde la madre con infeccin aguda o crnica. Accidental: Ocurre por el contacto de la piel herida o de mucosas con material contaminado (sangre de enfermos, animales contaminados o sus secreciones como sangre). Va oral: Ocurre por la ingestin de bebidas o alimentos contaminados con heces o con todo el triatomino infectado o eventualmente por las secreciones nebulizadas de las glndulas odorparas perianales de marsupiales (Didelphis spp.) en los cuales se ha descrito la presencia de tripomastigotes metaclclicos (Noya y col, 2010).Entre los reservorios vertebrados de esta enfermedad, Didelphys marsupialis (conocido en Venezuela como Rabipelado) es de suma importancia epidemiolgica, por su amplia distribucin geogrfica en el neotrpico, por su elevada frecuencia de infeccin natural con T. cruzi, y por la comunicacin que establece entre los focos domsticos y selvticos de la enfermedad. ste es un animal frecuente en el peridomicilio y que incluso penetra en las viviendas (Pifano, 1986), actuando tanto como reservorio o como transmisor directo de la enfermedad.Est bien descrito en la literatura la presencia de tripomastigotes metaciclcos en las glndulas perianales de los rabipelados (Urdaneta-Morales, 1996; Deane y col, 1984), incluso se sabe que dada la cercana anatmica de esta glndula con los rganos urogenitales pueden encontrase tripomastigotes metaciclcos en la orina (Urdaneta-Morales, 1996). Sin embargo, los estudios enfocados en determinar la presencia de tripomastigotes en la orine de roedores son ms bien escasos. Algo curioso, dado la importancia epidemiolgica de las ratas en la infeccin en ambientes urbanos, debido a su alta prevalencia de T.curzi, entre 30% y 57 %, (en el gnero Rattus) y alta parasitemia (Alarcn y col, 2006). Estos hechos motivaron la necesidad de realizar en presente estudio; que aunque no se trabaj directamente con ratas, sirve como un trabajo preliminar, que tiene como objetivo ms cercano, abrir el camino a prximas investigaciones en el tema.

Objetivo general:Determinar la existencia de Trypanosoma cruzi en la orine de ratones infectados experimentalmente. Objetivos especficos:Describir la curva de parasitemia de los ratones infectados experimentalmente con T.cruzi. Evaluar la presencia de Trypanosoma cruzi mediante inmunoensayos enzimticos, pruebas de biologa molecular y cultivos in vitro a partir de muestras de sangre.Determinar la existencia de Trypanosoma cruzi en la orine de los ratones a travs del conteo directo de parsitos, anlisis por biologa molecular y cultivos in vitro.

Marco terico

Mtodo de BrenerEs un mtodo basado en la tcnica de Pizzi para contar tripanosomas. El mtodo de Brener, consiste en tomar 5 centmetros cbicos de sangre de la cola del ratn y colocarlos entre un portaobjetos y un cubreobjetos de 22x22 mm, tratando de formar una sola capa de clulas sanguneas. Se estima previamente el nmero de campos del cubre objeto ajustando el microscopio a 45x en el objetivo y 10x en el ocular. Por ltimo el nmero de tripanosomas en 5 L de sangre se estima contando los parsitos presentes en 100 campos y luego multiplicando el nmero de tripanosomas por un factor que depende de las caractersticas del microscopio (Brener, 1962). Se fundamente en la capacidad de inferir la concentracin de parsitos a partir de una muestra pequea usando como estimador un valor ajustado a las caractersticas del microscopio empleado. Ese valor de ajuste se halla de la siguiente manera: Se determina el radio del campo visual. Hallamos el rea del campo visual a partir del radio. Hallamos el rea del cubreobjetos. Hallamos el rea total contada, que no es ms que el rea del campo visual por el nmero de campos contados (100 campos). Se divide el rea del cubreobjetos entre el rea total contada. El resultado del paso previo se divide al volumen de sangre aadido en el portaobjetos (5 cc).Cultivo de parsitos en medio bifsico Un medio de cultivo es un sustrato o una solucin de nutrientes que permite el desarrollo de parsitos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en las que los parsitos van a crecer y multiplicarse. Los medios bifsicos conteniendo una fase slida de medio agar-sangre y una fase lquida constituidapor medio LIT con suero fetal bovino. Este tipo de ensayo tiene la finalidad de demostrar la presencia de parsitos en la muestra a cultivar.

ELISAEl ELISA se basa en el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar la enzima producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro o un colormetro (Guzmn-Vzquez, 2004).En cuanto a los pasos generales de un ELISA primero se tapizada el antgeno o anticuerpo, luego se agrega la muestra problema con la mezcla de antgenos o anticuerpos, se une el antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o antgeno ya tapizado, lavado para eliminar el exceso no unido. Se aade el anticuerpo secundario marcado con la enzima, esto conlleva a la unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no adherida, se adiciona del substrato, para que ocurra la unin del substrato a la enzima, para luego obtener la coloracin (Voller y col, 1978).Las fases slidas ms usadas son las microplacas de 96pocillos (con un volumen de 350L). La mayora son de poliestireno, para aumentar su capacidad de adsorcin (en su superficie) de molculas, y con fondos de pocillo pticamente claros que permitan realizar las medidas de densidad ptica en instrumentos especficos, espectrofotmetros de lectura de placas que han recibido el nombre delectores ELISA. Estas son especialmente ventajosas para procesar un elevado nmero de muestras y una vez tapizadas, el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura.Los anticuerpos utilizados en el mtodo ELISA son de origen monoclonal o policlonal que se suministran como antisuero no fraccionado o fracciones de inmunoglobulina purificada, pueden ser solubles o estar inmviles en la microplaca, son empleados como conjugados no marcados o enzimticos y por ultimo reaccionan con determinante antignico especfico de un antgeno o de un anticuerpo ligando-especfico (anticuerpo primario) segn el protocolo de anlisis (Guzmn-Vzquez, 2004).Los antgenos se purifican o se producen con tecnologa recombinante, y al igual que los anticuerpos se utilizan como conjugados marcados o enzimticos y son inmviles o solubles, dependiendo del protocolo de anlisis. Como se puede deducir los conjugados enzimticos son antgenos o anticuerpos unidos en forma covalente a la enzima de eleccin. As pues, el reactivo que se forma de la unin covalente entre enzima y antgeno o anticuerpo es el conjugado (Guzmn-Vzquez, 2004).Las combinaciones de enzima y sustrato que se emplean incluyen: peroxidasa de rbano y su sustrato, perxido dehidrgeno que en presencia de cromgeno o-fenilendiamina produce un producto color amarillo-naranja medible; galactosidasa beta y su sustrato o-nitrofenil-beta-D-galactopiransido que se transforma en un producto nitrofenolado amarillento medible; o fosfatas alcalina y su sustrato p-nitrofenilfosfato que tambin se transforma en nitrofenolato. Se utiliza cido sulfrico o hidrxido de sodio para inhibir la actividad enzimtica y estabilizar el producto final de reaccin que tiene color (Guzmn-Vzquez, 2004).Existen diferentes tipos de pruebas ELISA, las cuales desarrollaremos a continuacin: ELISA directo: En este se fija el antgeno al soporte, se lava para eliminar los no fijados, luego se adicionan los anticuerpos marcados con la enzima para que reaccin con el antgeno y que solubilizado el complejo, se lava para eliminar anticuerpos que no reaccionaron y se agrega un sustrato especfico para la enzima, al final se observa la coloracin (Voller y col, 1978). Es necesario incluir controles negativos que sern muestras del mismo tipo que las analizadas, pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antgeno buscado).

ELISA indirecto: En este la diferencia viene dada a nivel que el elemento marcado por la enzima es un anti-anticuerpo (anticuerpo secundario) que va a reaccionar con el anticuerpo, que reaccion junto al antgeno previamente fijado (anticuerpo primario); finalmente se agrega un sustrato especfico para la enzima, se lava y se observa la coloracin (Voller y col, 1978). La deteccin tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificacin de seal debida a la unin de dos o ms anticuerpos secundarios por cada primario. La dilucin de la solucin que contiene el anticuerpo primario por ejemplo, suero sanguneo es un factor muy importante a tener en cuenta para evitar la aparicin de falsos negativos, ya que si la muestra est muy diluida, no saldr positiva si la titulacin de anticuerpos es muy baja.

ELISA sndwich: Se fija al soporte el anticuerpo especfico del antgeno en el suero problema, posteriormente se aade el suero problema y los antgenos de fijan a los anticuerpo, luego se lava para eliminar elementos no fijados, posteriormente se aaden anticuerpos conjugados con una enzima (de diferente eptopo a los previamente fijados) estos reaccionan con los antgenos de la muestra problema que se encuentran fijados a los otros anticuerpos, se lava la muestra y se aade un sustrato a la enzima marcadora y se observa el color visual o por colorimetra. En cuanto al ELISA sndwich triple la diferencia viene dada por que los segundos anticuerpos que se colocan no son marcados con la enzima, si no que luego se coloca anti-anticuerpos conjugados con la enzima que reaccionaran con los anticuerpo que se colocaron luego, posteriormente se lava y se coloca el sustrato especfico para la enzima (Voller y col, 1978).

PCRLa Reaccin en Cadena de la Polimerasa (por sus siglas en ingles PCR) es un ensayo enzimtico, que permite la amplificacin de fragmentos especficos de ADN. Kary Mullis, quien conceptualiz en ensayo de PCR la explic diciendo que te permite partir de un poco del ADN del que estas interesando y tener tanto como quieras (Mullis, 1990). Ya que slo pequeas cantidad de ADN son necesarias para generar suficiente copias para ser analizadas usando mtodos convencionales. La tcnica de PCR se basa en el mecanismo de la replicacin in vivo del ADN: el ADN bicatenario se desenrolla y pasa a ADN monocatenario, se duplica y se vuelve a enrollar. Esta tcnica consiste en ciclos repetitivos de: Desnaturalizacin del ADN por fusin a temperatura elevada, a fin de convertir el ADN bicatenario en ADN monocatenario; hibridacin de dos oligonucletidos, utilizados como cebadores, al ADN diana; extensin de la cadena de ADN por adicin de nucletidos a partir de los cebadores utilizando ADN polimerasa como catalizador, en presencia de iones Mg+2. (Soma y Querci, 2000).Tras cada ciclo, las hebras de ADN recin sintetizadas pueden servir de ADN molde para el ciclo siguiente. El producto principal de esta reaccin exponencial, es un segmento de ADN bicatenario cuyos extremos vienen definidos por los extremos 5 de los oligonucletidos cebadores y cuya longitud viene dada por la distancia entre los cebadores. Los productos de una primera ronda de amplificacin efectiva son molculas de ADN de diferentes tamaos, cuyas longitudes pueden superar la distancia entre los sitios de unin de los dos cebadores. En la segunda ronda, estas molculas generan hebras de ADN de longitud definida que se acumulan de forma exponencial en rondas posteriores de amplificacin y constituyen los productos dominantes de la reaccin (Soma y Querci, 2000).Para llevarla a cabo se necesitan los siguientes reactivos: Los cuatro dNTPs, en exceso, como sustrato para la sntesis de innumerables copias de DNA. Estos deben utilizarse a concentraciones equivalentes para minimizar los errores de incorporacin (Innis y col., 1988). Para ser reconocidos por la polimerasa, los dNTPs deben estar acompaados por iones divalentes (comnmente Mg+2), que permiten la formacin de un complejo soluble.

Dos oligonucletidos (tambin llamados cebadores, iniciadores, primers u oligos) de cadena sencilla. Sus secuencias han de ser complementarias, respectivamente, a los dos extremos 3 de la regin diana; uno a cada hebra. Por esta razn no se puede amplificar una regin de ADN si no se conoce la secuencia de sus extremos (Luke y Herrez, 2006). Se debe procurar que los cebadores no tengas tramos secuenciales con poli-bases ni motivos repetidos, ya que podran hibridarse de forma inadecuada con el ADN (Soma y Querci, 2000).

Una ADN polimerasa termoestable, es decir, enzimticamente activa a temperaturas relativamente altas. Esta caracterstica permite su actuacin en sucesivos ciclos sin inactivarse; adems, la replicacin a temperaturas elevadas impide la formacin de hbridos parcialmente desapareados y contribuye a la especificidad y rendimiento del proceso (Luke y Herrez, 2006). La primera ADN polimerasa termoestable utilizada fue la ADN polimerasa Taq, aislada de la bacteria Thermus aquaticus (Saiki y col, 1988). Aunque esta enzima es probablemente la ms utilizada a efectos de la PCR, en el comercio pueden encontrarse algunas otras ADN polimerasas. Con una frecuencia de errores inferior (Soma y Querci, 2000). Una solucintampnque mantiene elpHadecuado para el funcionamiento de laADN polimerasa. El tampn de reaccin ms comn utilizado con la ADN polimerasa contiene: Tris 10 mM, pH 8,3; KCl 50 mM.

Etapas del proceso

Cada ciclo de una PCR consta de 3 etapas: Desnaturalizacin: Calentamiento para la separacin de las dos hebras del AND, mediante una incubacin breve (30-120s) a una temperatura de entre 68 C y 97 C, que debe ser superior a la temperatura de fusin de la regin que se quiere amplificar. Llamamos temperatura de fusin a la temperatura en la cual la mitad del ADN bicatenario ha pasado a monocatenario. El proceso de desnaturalizacin depende del tipo de disolvente, de la concentracin salina y del pH utilizado; por ejemplo, la temperatura de fusin desciende al bajar la concentracin salina, al subir el pH y en presencia de disolventes orgnicos como el formaldehdo. El valor de la temperatura de fusin tambin se puede ver afectado por la concentracin de G/C y T/A. La temperatura de fusin de una estructura de ADN que contiene una elevada proporcin de G/C es ms alta que la de un ADN ms rico en T/A. (Carson y col, 2012).

Templado o hibridacin: Enfriamiento rpido por debajo de la temperatura de Melting, de forma que se permite la hibidacin de las hebras sencillas del ADN de inters con los oligos cebadores. Definimos la temperatura de Melting de un primer unido a su cido nucleico diana como la temperatura a la cual el 50% de los primers estn unidos y el 50% estn en solucin (McPherson y Moller, 2006).

Elongacin o replicacin: Es la etapa de amplificacin propiamente dicha (73-75 C, 1-9 min), en la que la DNA polimerasa termoestable elonga los cebadores, empleando como moldes ambas hebras originales. La replicacin transcurre en direccin 5->3 a partir del extremo 3-OH, hasta terminar la lectura del molde o hasta que se comience una nueva etapa de desnaturalizacin (Luke y Herrez, 2006). Comnmente se aaden a estas 3 faces del ciclo una etapa previa, a elevada temperatura que sirve para inactivar proteasas o activar determinadas Taqs (hotstars); una etapa de elongacin final, para asegurar que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado; y una etapa de conservacin que se lleva a cabo a 4-15C durante un tiempo indefinido para preservar la reaccin a corto plazo.

Electroforesis en geles de agarosaLa electroforesis en gel es una tcnica muy utilizada para separar molculas o fragmentos de molculas de cidos nucleicos. Los materiales ms comunes para separar molculas de cidos nucleicos son polmeros como la poliacrilamida o la agarosa (Pea y col, 2009). La agarosa es un polisacrido lineal (con un peso molecular medio de ~12 000 Da) formado por la repeticin de la unidad bsica, la agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6-anhidrogalactosa. Los geles de agarosa poseen grandes poros y se emplean fundamentalmente para separar las molculas grandes con un peso molecular de ms de 200 kDa (Soma y Querci, 200).Los geles de agarosa se obtienen por suspensin de agarosa seca en polvo en un tampn acuoso, tras lo cual se hace hervir la mezcla hasta que la agarosa se funde y se convierte en una solucin transparente. A continuacin, se vierte esta solucin en un molde para gel y se deja enfriar a temperatura ambiente hasta que se forma un gel rgido. Al endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya densidad viene determinada por su concentracin (Soma y Querci, 200).Estos geles se colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un tampn de pH alrededor de 8. Se dispone de varios tipos de tampones para la electroforesis de ADN nativo bicatenario. Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato (TBE) o trisfosfato (TPE) a una concentracin de aproximadamente 50 mM. De esta forma, las molculas de DNA o RNA sometidas a electroforesis se desplazarn al polo positivo ya que a pH superiores a 5 poseen carga negativa. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar molculas cargadas en funcin de su tamao y forma. As, molculas de DNA de diferente tamao, van a emigrar de forma distinta en un gel de electroforesis. La distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a ser inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Es importante la utilizacin de marcadores de tamao conocido porque nos permitirn calcular los pesos moleculares de las muestras de DNA problema (Pea y col, 2009). En el caso de los geles de agarosa, se le aade bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una lmpara de luz UV, y se vern las bandas correspondientes a las muestras de DNA aplicado y los marcadores de peso molecular (Pea y col, 2009).Las muestras de ADN que deben cargarse en el gel de agarosa se mezclan en primer lugar con un tampn de carga que por lo general contiene agua, sacarosa y un colorante (por ejemplo, cianol de xileno, azul de bromofenol, verde de bromocresol, etc.). El tampn de carga se emplea con tres fines: aumentar la densidad de las muestras para que las gotas de ADN caigan uniformemente en el pocillo; aadir color a la muestra, simplificando de este modo el proceso de carga; incorporar un colorante a la muestra que, en un campo elctrico, se desplace hacia el nodo a una velocidad previsible (Soma y Querci, 200).

Extraccin de ADN por solubilidades de fases inmiscibles Es el protocolo bsico para la extraccin de ADN y consiste en el tratamiento de la muestra con solventes orgnicos. Se fundamenta en las diferencias entre las propiedades fsico-qumicas del ADN y las del resto de los componentes de la clula (Luke y Herrez, 2006). Los cidos nucleicos son muy solubles en agua debido al fuerte carcter hidroflico de sus grupos fosfato. Dentro de una mezcla de solventes no miscibles, uno acuoso y otro orgnico no polar, los cidos nucleicos tendern a permanecer en la fase acuosa, en tanto que los lpidos y gran parte de las protenas desnaturalizadas se encontrarn en la fase orgnica. En la preparacin de cidos nucleicos, los solventes que se usan ms frecuentemente para la extraccin de protenas y lpidos son el fenol y el cloroformo (Zarate y col, 2009). Despus de que es eliminada la fase orgnica (que contiene lpidos y protenas) se procede a recuperar el DNA, para ello, se adiciona etanol al 100 % que permite que el ADN se pliegue sobre s mismo hacindolo insoluble. Un paso de centrifugacin permite que el ADN permanezca en el fondo del tubo mientras que el etanol es desechado. Los restos de etanol se eliminan con un lavado con etanol al 70 % y el remanente se elimina por evaporacin (Alejos y col, 2010).

Materiales y mtodos

Los ratones (Mus musculus) cepa IMT utilizados fueron suministrados por el bioterio del Instituto de Medicina Tropical (IMT-UCV). Se inocularon con 4000 trypomastigotes cada uno. La cepa de T. cruzi usada fue una extrada de un chipo llevado voluntariamente por un paciente al IMT procedente del estado Miranda. Se hizo seguimiento de la parasitemia de los ratones extrayendo sangre de la cola y contabilizando el nmero de parsitos por el mtodo de Brener (1962) diariamente a partir del sptimo da de haberse inoculado. As se pudo determinar el perodo prepatente, los niveles de parasitemia y la mortalidad. Fue sacrificado un ratn sin inocular y este lo usamos como control negativo. En lo concerniente al resto, un ratn fue procesado el da que se hallaron parsitos en sangre (final del periodo prepatente), y luego se proces uno cada 5 das (n=4).

Recoleccin de la orinaPara la recoleccin de la orina se diseo una trampa de orina, la cual consisti en un envase de plstico de 23 onzas con la base reemplazada por una rendija de metal ms una malla de plstico. La luz de la malla no permita el paso de las heces pero s el de la orine del ratn, que era colocado dentro del envase. La orine era recolectado por un segundo envase de 16 onzas puesto en la parte inferior del primero. Para aumentar el volumen de orine recolectado se inyect intraperitonealmente 5 veces la dosis recomendada de diurtico (Furosemida) para un ratn de 20 g, usando las proporciones para humano. Dosis humana: 1 mL (20 mg/mL) para 80 Kg. Luego se meda el volumen de orine obtenida. De esta se dedican 5L a la aplicacin del mtodo de Brener; 200 L se preservacin en un volumen igual buffer de preservacin Guanidina-EDTA 6M; 100 L a la extraccin inmediata del ADN; y el resto a cultivo en medio bifsico. La cantidad de orine dedicado al cultivo variaba dependiendo de la cantidad de orine extrado en cada ratn. Luego de la recoleccin se conceda al ratn un plazo de recuperacin de 24 horas. Terminado el plazo se proceda a la recoleccin de sangre.

Recoleccin de sangreLas muestras de sangre de los ratones se obtuvieron por pulsin cardaca con una aguja de insulina (8 mm) heparinizada procurando obtener la mayor cantidad de sangre.Luego se medi el volumen de sangre obtenida. Se dedicaban 5 L de sangre para el mtodo de Brener. Luego lo restante se centrifug durante 15 min a 1500 xg, se recolecto el suero obtenido y respecto al paquete globular 200 L preservaron en guanidia; 100 L se usaron para la extraccin directa e inmediata de ADN y el resto a cultivo. La cantidad de sangre dedicada al cultivo variaba dependiendo de la cantidad de sangre extrada en cada ratn.

Mtodo de BrenerSe colocaron 5 L de sangre u orine del animal entre un portaobjetos y un cubre objetos de 22 mm x 22 mm. Se visualiz mediante un microscopio marca Carl Zeiss 4857670 en donde se contaron 100 campos visuales. Luego para determinar la concentracin de parsitos se multiplic el nmero de parsitos observados en esos 100 campos por 8,134 (valor de ajusto de acuerdo con las caractersticas del microscopio).

Extraccin de ADNPara cada muestra se agreg en un eppendorf de 600 L, 100 L de Fenol-Cloroformo-Alcohol Isoamilico (24:23:1), 150 L de agua destilada y 100 L de muestra. Se centrifug por 3 min a 9000xg. Luego se colect la mayor cantidad de sobrenadante posible y se agreg a este el mismo volumen de cloroformo. Se centrifug esta mezcla por 3 min a 9000 xg. se colectaba la mayor cantidad de sobrenadante posible y se le aadi 300 L de Etanol al 100%, esto se centrifug a 9000 xg durante 15 min. Despus, se descart el lquido, y se resuspendi el precipitado en 500 L de Etanol al 70 % y se centrifug a 9000 xg durante 15 min. Por ltimo se descart el lqudo y se conservo el ADN obtenido a 4C.

Ensayos de PCREn este ensayo se usaron cebadores especficos al ADN de kinetoplasto de T.cruzi (ADNk), ellos son 121 (5-AAATAATGTACGGGGGAGATGCATGA-3) y 122 (5-GGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATA-3). A cada muestra se agregaron los siguientes componentes en concentraciones finales: 3 L de buffer Tris (1X); 3,6 L de MgCl (3 mM), 0,75 L de dNTPs (0,25 mM); 1,5 L de primer 121 (2,25 M); 1,5 L de primer 122 (2,25 M); 14,53 L de agua destilada; 0,12 L de taq Hotstar (6 unidades/mL) y 5 L de ADN de la muestra.El ciclo programado en el termociclador fue el siguiente: 95 C por 5 min; 94 C por 3 min; [97,5 C por 1 min; 64 C por 2 min] X 2; [94 C por 1 min; 62 C por 1 min] X 33; 72 C por 10 min. El resultado de la amplificacin se visualiz con la ayuda de un gel de agarosa al 1,2 % teido con bromuro de etidio. Prueba ELISA Se sensibilizaron las placas con antgeno total de T.cruzi, 1g de antgeno por pozo. Se incub la placa a 4 C durante toda la noche. Se lavaron las placas 3 veces con PBS-tween 20 (0,05%) en el lavador automtico. Se secaron las placas y se cubrieron con papel transparente. Luego se hizo una dilucin 1/50 de los sueros obtenidos en solucin PBS pH: 7,2, Tween-20 0,05% y leche descremada al 5%. Despus incubamos esas placas con 50 L de cada suero en su pozo correspondiente durante 30 min a 37 C. Se lav la placa. Luego se incub 50 L de conjugado anti-IgG de ratn unido a fosfatasa alcalina diluido 1/500 durante 30 min a 37 C. Terminado estos se lav bien la placa. Se agreg 50 L de para-nitro-fenil-fosfato 1 mg/mL en buffer DEA pH 9, 5, y se incub durante 15 min a oscuras en temperatura ambiente. Luego se detuvo la reaccin con 50 L NaOH 1 M. Por ltimo se ley la reaccin a 405 nm. Se consideraron positivas aquellas muestran cuya valor de DO fue mayor al punto de corte establecido a priori en la Seccion de Inmunologia IMT-UCV, que fue de 0,200.

Cultivo in vitroLas muestras fueron cultivadas en medio LIT constituido por extracto de hgado al 5 %; suero fetal bovino al 5 % PGAB (penicilina, glutamina y piruvato de sodio) al 1 %; Hemina y glucosa al 2 % y agua destilada. El medio slido Agar sangre, constituido por Bacto agar al 3 %; infusin cerebro-corazn al 3,7 %; sangre al 3 % y agua destilada.

Resultados

A travs del mtodo de Brener determinamos el perodo prepatente, el cual dur 18 das. Tambin se pudo determinar la parasitemia de los das siguientes, tal como se ve en la figura 1. Ningn ratn muri como consecuencia de la enfermedad antes de completarse el estudio.

Figura 1-. Curva de parasitemia. Las muestras proceden de la sangre de ratn extrada del corazn. Cada punto corresponde a un ratn sacrificado el da sealado. A los 18 das concluy el perodo prepatente.

Se evaluaron los sueros obtenidos de los ratones, contra antgenos de T. cruzi y se us un conjugado anti-IgG de ratn. Tal como se espera dada la ontegenia de este tipo de anticuerpos, los valores positivos se obtuvieron varias semanas despus de la infeccin, para nuestro caso, los ratones positivos a la IgG anti-T. cruzi se obtuvieron a partir de la tercera semana post-inoculacion (Figura 2).

Figura 2. Resultados de la prueba ELISA. RC = Ratn control, sacrificado sin inocular T.cruzi; R1 = Ratn 1, sacrificado al final del perodo prepatente; R2 = Ratn 2, sacrificado 7 das despus; R3= Ratn 3, sacrificado 3 das despus de R2; R4 = sacrificado 7 das despus de R3. La lnea roja corresponde al punto de corte de la prueba, muestras con valores de D.O por encima de ella son tomado como positivos.

Para determinar la presencia de tripanosomas en la orina de estos roedores, se utilizaron las pruebas de Brener, PCR y el cultivos in vitro. Los resultados obtenidos mostraron que mediante la tcnica de Brener como por la tcnica de cultivos in vitro, no se observ presencia de formas tripomastigotes. Adicionalmente, es importante sealar que los cultivos in vitro de las muestras de orina fueron poco tiles, debido a que el 75% de las muestras presentaron contaminaron por hongos; el mismo hongo en todo los casos (Tabla 1 y Tabla 2). Este hecho pone en tela de juicio a nuestra trampa de orina. As que slo contbamos con la prueba de PCR para extraer algn tipo de informacin extra respecto a nuestro objetivo general. En la figura 3 vemos el resultado de la PCR.

Figura 3. Resultado de la PCR. Gel de agarosa al 1.2 %. En la parte superior est sealizado en contenido de cada bolsillo. CO corresponde la muestra de orine del ratn control; R1O muestra de orina ratn 1; R2O muestra de orina del ratn 1; R3O muestra de orina del ratn 3; R4O muestra de orina del ratn 4; CS muestra de sangre del ratn control; R1S muestra de sangre del ratn 1; R2S muestra de sangre del ratn 2; R3S muestra de sangre del ratn 3; R4S muestra de sangre del ratn 4. La diferencia entre las muestra con apostrofe y las sin apostrofe reside en que las muestra sin apostrofe fueron preservadas en guanidina y extradas el 1-6-2015. Las muestras con apostrofe fueron extradas el mismo da que se sacrific el animal. M corresponde al marcador de peso molecular (para visualizarlo mejor se incluy la figura 4). Las flechas indican la banda que corresponde al amplificado de 330pb. Es muy importante notar que R1O y R3O son positivas para la prueba.

Figura 4. Resultado de la PCR. Mismo que presentado en la figura 3, con la salvedad de que en esta figura es ms fcil visualizar el marcador de peso molecular.

Tabla 1.- Cultivos de muestras de orina.nombre del cultivoFecha de cultivoDas de cultivoEstado del cultivo

Ratn control25-05-201550contaminado con hongo

Ratn 108-06-201536negativo

Ratn 212-06-201532contaminado con hongo

Ratn 317-06-201528contaminado con hongo

Ratn 425-06-201519contaminado con hongo

Tabla 2.- Cultivos de muestras de sangre. Nombre del cultivoFecha de cultivoDas de cultivoEstado del cultivo

Ratn control26-05-201549negativo

Ratn 109-06-201535contaminado

Ratn 215-06-201529Seco

Ratn 318-06-201526Positivo

Ratn 424-06-201518Positivo

Conclusiones

Si se desea cultivar el orine de ratn es necesario utilizar un mtodo de recoleccin distinto al usado en este trabajo.

El ensayo ELISA es efectivo para determinar presencia de anticuerpos anti antgenos de T.cruzi; y esto es relacionable con la presencia del parsito.

Para cultivar parsitos es necesario trabajar con la mayor esterilidad posible para evitar la contaminacin de los cultivos.

El uso de furosamida (a tal 0,04 mg/mL) es til para la obtencin de orina de ratn, ya que se pudo obtener hasta 800 L de orina.

Aplicar el mtodo de Brener en orina es poco recomendable, dada la dificultad de enfocar la orina en el microscopio.

Es preferible extraer el ADN de las muestras en el momento de su recoleccin y guardar el ADN obtenido a 4C que preservarlas con guanidina.

Es recomendable usar un ttulo de parsitos mayor a 400 parsitos/mL para tener un perodo prepatente menor y probablemente una mayor parasitemia en sangre.

Bibliografa

Noya, A. Colmenares, C. Guevara, R. Daz-Bello, Z. Noya, O. (2010) La transmisin oral en la enfermedad de chagas. Revista de la Facultad de Medicina.33: 2http://www.who.int/whosis/whostat/2010/en/Daz-Limay, E. Escalante, H. Jara, C. (2004) Parasitemia levels and histopathological changes in Mus musculus BalB/C ingected with Trypanosoma cruzi obtained from Panstrongylus chinai of Chaman Valley La Libertad- Peru. Parasitol Latinoam. 59: 153 158Pifano, F. (1986). El potencial enzootico silvestre del complejoTrypanosoma cruzi-Didelphis marsupialis-Panstrongylus geniculatusy sus incursiones a la vivienda humana del valle de Caracas, Venezuela.Bol. Acad. Ciencias Fis. Mat. Nat.46:9-37.Urdaneta-Morales, S. Nironi, I. (1996) Trypanosoma cruzi in the anal glands of urban opossums. I- isolation and experimental infections. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 91:4Deane, M. Lenzi, H. Jansen, A. (1984) Trypanosoma cruzi: vertebrate and invertebrate cycles in the same mammal host, the opossum. Mem Inst Oswaldo Cruz. 79:513-515.Alarcn, M. Yarbuh, A. Moreno, E. Payares, G. Araujo, S. Colmenares, M. (2006) Presencia de Trypanosoma cruzi en tejidos de ratas Wistar infectadas experimentalmente y sus fetos. Boletn de malariologa y salud ambiental. 44:2Mullis, KB. (1990) The unusual origin of the polymerase chain reaction.Sci Am262:5661, 6465.http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n6.pdfLuque, J. Herrez, A. (2006) Biologa molecular e ingeniera gentica. Editorial Harcourt. Madrid, Espaa. Saiki, R. Gelfand, D, Stoffel, S. Scharf, Higuchi, R. Horn, G. Mullis, K. Erlich, H. (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239: 487-491.

McPherson, M. Moller, S. (2006) PCR. Editorial Taylor & Francis Group. Segunda edicin, Nueva York, EEUU.

Pea, C. Diapena, J. Martinez, E. Brcena, J. Garca, C.(2006) Electroforesis de cidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y caracterizacin electrofortica de DNA plasmdico. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales.http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n5.pdfhttp://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/extraccion.pdfVolles, A. Bartlett, A. Bidwall, E. (1978) Enzyme immunoassays with special reference to ELISA techniques. Journal of Clinical Pathology 31: 507-520Zrate, P. Jimnez, S. Badillo, J. Orijel, C. Oliver, M. (2009) Manual de laboratorio de biotecnologa molecular. Mxico DF. Brener, Z. (1962) Therapeutic activity and crterion of cure on mice experimentally infected with Trypanosoma cruzi. Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo 4: 389-396.Borges, M. Curi, P. Kloetzel, J. (1992) Modulation of parasitemia an antibody response to Trypanosome cruzi cyclophosphamide in Calomys callosus (rodentia, cricetidae). Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. 34: 1-8Garibyan, L.Avashia, N. (2013) Polymerase Chain Reaction. Journal of Investigative Dermatology133. Carson, S. Miller, H. Witherow, S. (2012) Molecular biology techinques: a classroom laboratory manual. Editorial ELSEVIER. Canad.Aez, N. Crisante, G. Rojas, A. Dvila, D. (2013) Brote de enfermedad de Chagas agudo de posible transmisin oral en Mrida, Venezuela. Boletn de malariologa y salud ambiental. 62:1-11