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PROCEDIMIENTO TÉCNICO PARA DETECCIÓN ANTICUERPO IgM DE

DENGUE METODO ELISA CAPTURA

CÓDIGO: P-SA-60 FECHA DE EMISIÓN: 16/10/2015

VERSIÓN: 01

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PROCEDIMIENTO TÉCNICO PARA DETECCIÓN ANTICUERPO IgM DE DENGUE METODO ELISA CAPTURA

ELABORÓ REVISÓ APROBÓ

REFERENTE DE LABORATORIO REPRESENTANTE DE CALIDAD

DIRECTOR (S) TECNICO (S)

SECRETARIO DE SALUD

REPRESENTANTE DE LA DIRECCIÓN




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1. OBJETIVO Describir la metodología para la detección de Anticuerpos IgM humanos contra el virus del DENGUE, en suero. 2. ALCANCE Este procedimiento se realiza a sueros de pacientes procedentes de los Laboratorios Públicos y privados de los diferentes Municipios del Meta, como apoyo a la Vigilancia Epidemiológica. Además se reciben muestras de instituciones públicas y privadas que realizan el diagnostico de Dengue con el fin de realizar el control de calidad. 3. DEFINICIONES Elisa: Es un ensayo inmuno enzimático para la detección cuantitativa de anticuerpos humanos, a través de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida, produciendo una reacción cuyo producto se evidencia a través de una reacción de color medida espectrofotométricamente. Elisa Dengue IgM CAPTURE: Es un ensayo inmuno enzimático en su variante de captura para la detección cuantitativa de anticuerpos IgM humanos contra el virus del Dengue en suero. Anticuerpo: Sustancia de naturaleza glucoproteica denominada inmunoglobulina (Ig) que es producida como respuesta del sistema inmunitario ante la presencia de una sustancia extraña llamada antígeno. Cada anticuerpo se fabrica expresamente para un determinado antígeno con tal grado de especificidad que antígeno y anticuerpo suelen designarse con el nombre del antígeno y el prefijo anti-. Inmunoglobulina M (IgM) Es uno de los cinco Isotipos de inmunoglobulinas Se denomina también macro globulina debido a su tamaño: es la inmunoglobulina más grande 950.000 Daltons presenta la capacidad, a través de su región Fc, de




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interaccionar con otras cuatro moléculas de IgM, formando un complejo de alto peso molecular de cinco moléculas de IgM. La capacidad de la IgM para formar estos complejos le da gran facilidad para unir el complemento es la que le da el poder de opsonizar determinados antigenos, provocando la lisis de bacterias, virus y otros agentes patógenos. Es el primer tipo de inmunoglobulina sintetizada en respuesta a una Infección

4. RESPONSABILIDAD Este procedimiento debe ser realizado por un Profesional de Laboratorio (Bacteriólogo) previamente entrenado, sin hacer ningún cambio que no esté debidamente documentado y autorizado

5. GENERALIDADES El virus del dengue, es un flavovirus, que habita en amplias zonas tropicales y subtropicales. Se trasmite por los mosquitos, principalmente Aedes aegypti y Aedes albopictus. La infección por el virus del dengue provoca un espectro de manifestaciones clínicas que varía desde una enfermedad subclínica hasta una forma hemorrágica mortal. El dengue clásico, o fiebre quebrantahuesos, se caracteriza por el inicio súbito de fiebre, cefalea intensa, mialgia, artralgia y exantema. Es frecuente una evolución febril difásica, al igual que el insomnio y la anorexia, con pérdida del gusto o un sabor amargo. La fiebre hemorrágica del dengue y el síndrome de shock del dengue son complicaciones graves que se asocian con la infección por un segundo serotipo. La detección de anticuerpos IgG por ELISA es un procedimiento valioso, especialmente para la identificación de sobre infecciones que presentan más complicaciones. Los anticuerpos IgM séricos pueden detectar en los pacientes infectados por el dengue entre los 3-5 días posteriores al comienzo de la fiebre y en generalmente persisten durante 30-90 días, aunque podría haber niveles detectables a los 8 meses de la infección. 6. DESARROLLO

6.1. Fundamento




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Cuando están presentes, los anticuerpos en suero de la clase IgG se unen a los anticuerpos anti-IgM humanos ligados a la superficie de poliestireno de las tiras de prueba de los micropocillos. Se diluye un grupo concentrado de antígenos 1 a 4 del dengue en el volumen de trabajo adecuado con diluyente para antígeno. Los antígenos se producen usando un sistema de expresión en células de insecto y se inmunopurifican mediante un anticuerpo monoclonal específico. Se agrega un volumen igual de anticuerpo monoclonal (MAb) conjugado con HPR al antígeno diluído, lo que permite la formación de complejos antígeno-MAb. La placa de la prueba se lava para retirar el suero residual y se agregan complejos de antígeno-MAb a la placa. Después del período de incubación, los micropocillos se lavan y se agrega un sistema de sustrato incoloro de tetrametilbencidina y peróxido de hidrógeno (Cromógeno de TMB). La enzima hidroliza el sustrato y el cromógeno se vuelve de color azul. Después de detener la reacción de ácido, la TMB se vuelve de color amarillo. Los cambios de color indican la presencia de anticuerpos IgM contra el dengue en la muestra de la prueba

6.2. Materiales

6.2.1. Equipos • Termohigrometro • Multitimer o cronometro • Incubadora (Rango: 37ºC +/- 1 ºC) • Lavador de ELISA. • Lector de ELISA. • Mezclador VORTEX • Pipeta (1000 ul) • Pipeta (10 ul) • Pipeta (100 ul) • Pipeta Multicanal (100ul) • Nevera muestras con Termómetro • Nevera de reactivos con Termómetro

6.2.2. Reactivos • Kit de Reactivos DENGUE CAPTURE ELISA IgM casa comercial PANBIO • Agua desionizada




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6.2.3. Otros • Balón o matraz • Probeta • Recipiente plástico con hipoclorito 0,5% para descartar material

contaminado. • Toallas de papel. • Puntas desechables amarillas y azules para las pipetas automáticas. • Tubos de vidrio de 13mm X 100 mm • Frasco de vidrio tapa rosca • Gradillas (Icopor). • Guantes. • Marcador de tinta indeleble. • Cinta de enmascarar. • Bases para dispensar reactivos • Papel kraft

6.3. Procedimiento

Esta prueba solo pude realizarse con suero. No se ha establecido el uso de sangre completa, plasma u otras matrices de Muestras. No deben utilizarse sueros ictéricos o lipemicos o sueros que presenten hemolisis o crecimiento bacteriano, tampoco deben ser inactivados con calor

• Antes de empezar con el proceso, verificar la disponibilidad de reactivos

y atemperarlos por 30 minutos aproximadamente a fin que estén completamente homogéneos y a temperatura ambiente (Entre 20 y 25° C) a excepción del antígeno (Mantenerse de 2ºC a 8ºC antes de preparar la dilución).

6.3.1. Preparación de soluciones

6.3.1.1. Solución de lavado (20x).




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60 ml de solución salina tamponada con fosfato (pH 7,2 – 7,6) concentrada 20x con Tween 20 y conservante (Porclin TM al 0,1%). En una probeta se diluye teniendo en cuenta: Una (1) parte del tampón de lavado concentrado con 19 partes de agua destilada. Se prepara la cantidad de acuerdo a la necesidad:

Buffer ml Agua ml Volumen final ml 10 190 200

12,5 237,5 250 15 285 300

17,5 332,5 350 20 380 400

22,5 427,5 450 25 475 500

6.3.1.2. Dilución de la muestra, calibradores y controles.

Calibrador y Controles: Tomar 1000 µl del diluyente “Diluyente para muestra” y 10 µl del control (Positivo o negativo) y/o calibrador (Según corresponda), el calibrador se realiza por triplicado. Muestras: Utilizando Tubos de ensayo Tomar 1000 µl del diluyente “Diluyente para muestra” y 10 µl de suero. Mezclar suavemente con el vortex todos los tubos

Controles y/o curvas de calibración

Un control positivo Un control negativo Calibrador por triplicado




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Los valores aceptables se encuentran en la hoja de especificaciones que se incluye en cada estuche. El análisis no es válido y se debe repetir si las lecturas de absorbancia de los controles o calibradores no cumplen

6.3.1.3. Solución para antígeno: Determinar el número de pocillos necesarios para el ensayo.

• Dilución del Ag con el diluyente: Comprobar que el antígeno concentrado que no se ha utilizado se mantenga entre 2ºC y 8ºC. Diluir en un recipiente de vidrio con tapa el antígeno a 1/250 con el diluyente del antígeno, (Mínimo 10 µl del antígeno en 2,5 ml del diluyente del antígeno). Esta cantidad es suficiente para preparar con un máximo de cinco tiras (40 pocillos). Para cada tira de pocillo se requiere un volumen de 0,5 ml del antígeno diluido. Una vez que se añade el antígeno al diluyente del antígeno, la solución adquiere un color azul pálido. Dilución 1/250

Antígeno ul Diluyente del Antígeno ml Tira 10 2,5 1 10 2,5 2 10 2,5 3 10 2,5 4 10 2,5 5 12 3,0 6 14 3,5 7 16 4,0 8 18 4,5 9 20 5,0 10 22 5,5 11 24 6,0 12

• Preparación de la dilución del Ag con el trazador (MAb)




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Extraer el volumen requerido del antígeno diluido y mezclar con el mismo volumen del Trazador (MAb) en un vial limpio de vidrio o plástico. Mezclar suavemente la solución de antígeno y Trazador (MAb) y dejar reposar a temperatura ambiente (20ºC-25ºC) hasta que se necesite. Desechar el antígeno diluido que no se haya utilizado. NOTA: Antes de que transcurran 10 minutos desde la mezcla del Trazador del Mab y el antígeno diluido pipetee la muestra, controles y trazadores en los pocillos. (numeral 6.3.4.1 y 6.3.4.2)

6.3.2. Acondicionamiento y manejo de equipos El acondicionamiento y manejo de equipos se realiza según hoja de vida (F-SA-18) de los mismos.

6.3.3. Condiciones ambientales El análisis se puede efectuar dentro de las siguientes condiciones ambientales:

Condición Ambiental Rango Temperatura Ambiente 20 y 25 °C

Las condiciones de temperatura del área son registradas en el F-SA-44 Control de temperatura y humedad relativa ambiental.

6.3.4. Descripción del Método

6.3.4.1. Preparación de la muestra.

Saque el número de micro-pocillos de la Bolsa de Aluminio, los micropocillos solo pueden sacarse de su bolsa cerrada hasta cuando alcancen una temperatura ambiente (Entre 20 y 25° C) e insértelos en el soporte para tiras, se necesitan cinco pocillos para Control Positivo, Control Negativo y el calibrador por Triplicado y el número de sueros a procesar. Asegúrese de que los micro-pocillos que no se utilicen se vuelvan a guardar en la bolsa sellada.




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Organizar los sueros de los pacientes en una gradilla de acuerdo a la hoja de trabajo microelisa (F-SA-99)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A N #

(Consecutivo)

B P #

(Consecutivo)

C C1 #

(Consecutivo)

D C2 #

(Consecutivo)

E C3

F CIP (Control Interno)

G CIN (Control Interno)

H # (Consecut

ivo Muestra)

6.3.4.2. Método

• Encender con anterioridad la incubadora, con el fin de que se estabilice en 37ºC +/- 1ºC (en caso de ser necesario).

• Agregar 100 µl de cada control (Positivo, negativo), tres calibradores previamente diluidos y las muestras diluidas en los respectivos pocillos de la microplaca de prueba. Antes que transcurran 10 minutos desde la mezcla del trazador (MAb) y el antígeno diluido,

• Incubar a 37ºC +/- 1ºC en cámara húmeda por una (1) hora. Tener en cuenta tapar la microplaca antes de introducirla a la incubadora.

• Preparar la solución de lavado con el tampón de lavado • Sacar la microplaca de la incubadora y lavar seis (6) veces con la

solución de lavado diluida de la siguiente manera: • Técnica Automatizada:

- Aspirar completamente los pocillos - Llenar los pocillos con 350 ul con la solución de lavado.




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- Al terminal los seis (6) lavados, invierta la placa y golpee firmemente sobre papel absorbente para garantizar que se elimina todo el tampón.

Nota: El lavado del equipo puede ser programado.

• Técnica Manual: - Deseche el contenido de la placa en un contenedor apropiado - Llene los pocillos con tampón de lavado utilizando una pipeta multicanal. Deseche el tampón de lavado de los pocillos inmediatamente. - Vuelva a llenar los pocillos con tampón de lavado y deséchelo rápidamente (repita esta actividad hasta completar seis (6) lavados). - Después del último lavado, elimine el contenido de los pocillos y golpee la placa sobre el papel absorbente para garantizar que se ha eliminado todo el tampón de lavado.

• Mezclar la solución MAb – Antígeno antes de su uso. • Añadir 100 µl de la dilución del antígeno - MAb a todos los pocillos

correspondientes de la placa. • Cubrir la placa e incubarla durante una hora a 37ºC +/- 1ºC. • Retirar la placa de la incubadora y lavarla seis (6) veces, secarla por

inversión golpeando sobre papel. • Añadir a cada uno de los pozos 100 µl de TMB cromógeno

Nota: El reactivo TMB no debe estar en contacto con superficies metálicas, para evitar su contaminación con iones metálicos, igualmente se debe evitar la exposición prolongada a la luz directa. En caso que el reactivo se muestre de color azul, este no afecta la actividad del sustrato ni a los resultados del ensayo.

• Incubar a temperatura ambiente (20ºC-25ºC) durante 10 minutos, cronometrando desde la primera adición, debe aparecer una coloración azul.

• Pipetear 100 µl de la solución de parada en todos los pocillos, en el mismo orden consecutivo.

• Mezclar bien, el color azul cambiará a amarillo




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• Antes de treinta (30) minutos, se debe leer la absorbancia de cada

pocillo a una longitud de onda de 450 nm, con un filtro de referencia de 600 nm a 650 nm

• Leer la absorbancia en el equipo lector de ELISA.

§ Cálculos y/o valores de referencia

o En la hoja de cálculo de Dengue (F-SA-100) Calcular la media de la absorbancia de los triplicados del calibrador y multiplicar por el factor de calibración (El factor de calibración es específico de cada lote y se encuentra detallado en la hoja de especificaciones que viene adjunto al kit), Este es el valor del punto de corte.

o Puede calcularse el valor del índice, dividiendo la absorbancia

de la muestra entre el punto de corte calculado en el paso anterior.

o Pueden calcularse unidades Panbio multiplicando el valor del

índice calculado por 10. Así: Valor de Índice = Absorbancia de la Muestra Valor del Punto de Corte Ejemplo:

Absorbancia de la Muestra A = 0,949 Absorbencia de la Muestra B = 0,070 Absorbancia Media del Calibrador = 0,802 Factor de Calibración = 0,62 Valor del Punto de Corte = 0,802 x 0,62 = 0,497 Muestra A (0,949/0,497) = 1,91 Valor del Índice.




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Muestra B (0,070/0,497) = 0,14 Valor del Índice. El factor de calibración viene en el inserto del lote que se está utilizando. Nota: Cuando el valor del índice de la muestra es menor al valor del punto corte, este se considera una muestra negativa; cuando el valor sea mayor al del punto de corte, esta muestra se considera como positiva.

Nota: Los valores y cálculos de los resultados son realizados en la hoja de cálculo de Dengue (F-SA-100).

Valores de referencia de una prueba con un valor de Punto de Corte = 1,0.

Entonces:

VALOR

DEL ÍNDICE

UNIDADES PANBIO RESULTADO

INTERPRETACIÒN

< 0,9 < 9 Negativo

Ausencia de Anticuerpos IgM

detectables.

0,9 – 1,1 9 – 11 Dudoso

Se debe repetir el análisis de las muestras dudosas. Si las muestras siguen dando un resultado dudoso al repetir el ensayo, es necesario volver a analizarlas utilizando un método alternativo o bien obtener otra muestra.

> 1,1 > 11 Positivo

Presencia de Anticuerpos IgM

detectables.




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6.3.5. Obtención resultados

Los datos (índice) obtenidos en la hoja de cálculo de Dengue (F-SA-100) se ingresan en el sistema integral de información de salud en el mismo orden

que se encuentran en la plantilla. Los resultados obtenidos del ensayo - hoja de cálculo de Dengue (F-SA-100) – la hoja de trabajo microelisa (F-SA-99) y el “Printer de Dengue”, se archivan en el área de inmunoensayo (carpeta “Printer Dengue”).

6.3.6. Aseguramiento de Calidad de los resultados

6.3.6.1. Control de Calidad Interno El kit cuenta con controles de calidad (control positivo y negativo) los cuales se pasan por corridas analíticas y son registrados en la Hoja de Cálculo de Dengue F-SA-100.

6.3.6.2. Control de Calidad Externo Se realiza prueba de Idoneidad de Virología con el INS (PIVI), el análisis de los resultados se registra en el F-SA-109 Análisis de resultados de control de calidad externo.

7. REGISTROS

Registro Responsable Como conservarlo

Donde conservarlo

Tiempo de conservación

Disposición final

F-SA-18 Hoja de vida de

Equipos

Director Técnico /Profesional de

Laboratorio

Medio físico y/o electrónico

Según Listado Maestro de

documentos F-MC-04, Según

F-MC-03 -Listado

maestro de registros y/o

tabla de retención

documental


documentos F-MC-04, Según F-MC-03 -Listado


tabla de retención

documental




tabla de retención

documental

F-SA-44 Control de temperatura y

humedad relativa ambiental.


Laboratorio




F-MC-03 -Listado

maestro de










VERSIÓN: 01


Registro Responsable Como

conservarlo Donde

conservarlo Tiempo de

conservación Disposición

final registros y/o

tabla de retención

documental

tabla de retención

documental

tabla de retención

documental

F-SA-99 Hoja de trabajo microelisa


Laboratorio




F-MC-03 -Listado


tabla de retención

documental




tabla de retención

documental




tabla de retención

documental

F-SA-100 Hoja de Cálculo Microelisa


Laboratorio




F-MC-03 -Listado


tabla de retención

documental




tabla de retención

documental




tabla de retención

documental

F-SA-109 Análisis de resultados de control de calidad

externo. Director Técnico /Profesional de

Laboratorio




F-MC-03 -Listado


tabla de retención

documental




tabla de retención

documental




tabla de retención

documental

8. ANEXOS Inserto Panbio Dengue IgM Capture ELISA (Referencia)

9. HISTORIAL

VERSIÓN

VIGENCIA IDENTIFICACIÓN DE LOS

CAMBIOS

1 16/10/2015 Versión inicial

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