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P-53

P-53

• Se descubre en 1979 oncogen (forma mutada e inactiva )• Gen supresor de tumores• Integridad genómica• Control en la progresión del ciclo celular• Sobrevida celular

P-53

• Presenta varias isoformas N-p53 carece dominio N terminal ( 40/47kDa)• Actua como inhibidor dominante negativo de la Full Lenght p53

IRES ( internal ribosomal entry sites )

• Iniciacion de la traduccion CAP independiente (1988 picornavirus)• Union directa de subunidad ribosomal 40s en un sitio interno sobre mRNA• Se define por su funcion• Tiene codon de iniciacion AUG• Utilizacion de factores de iniciacion (ITAF )

IRES ( internal ribosomal entry sites )

•Se reconoce a traves de ensayos utilizando construcciones bicistronicas•Dos genes reporteros bajo un mismo promotor ( luciferasas )•Entre ambos la zona de probable IRES•El primer reportero se va a traducir utilizando la estructura CAP,luego hay STOP•Si encuentro el producto del segundo mensajero es que esa secuencia es un IRES

• Los autores proponen que la traduccion en ambas isoformas se realiza a traves de dos IRES

• 5’ UTR para full-lenght• Protein coding region para N-p53 • Con distinta actividad en el ciclo

celular

Objetivo:

• Identificacion de las secuencias IRES• Ubicación en la secuencia completa

del gen P-53

• MFOLD algoritmo : estructuras secundarias

• 134 nt 5’ UTR

• 5’ 251 nt

• Metodo : Transcripcion In Vitro

• Plasmido monocistronico • GFP gen reportero ( downstream )• RNA polimerasa T7• Presencia / ausencia de analogo de

CAP

Metodo:

• Transfecciones utilizando construcciones monocistronica

• DNAs 5’251 y 134 nt P-53 RNAm de

sangre de individuos sanos• Clonado en el vector pCDNA 3 con GPF• HCV – IRES - GFP

• Al agregar analogo de CAP :

• No inhibe la traducccion del +39• Inhibe parcialmente la –1• Si inhibe a la GFP - CAP

• Con o sin analogo de CAP se observa traduccion

• Estos resultados indican que el p53+39 y –1 permiten el inicio de la traduccion CAP independiente ( dos sitios IRES )

resultado

Objetivo: comprobar que el inicio de la traducción de la proteína P53, se realiza mediante IRES, en el extremo 5’ UTR.

Material y métodos: se utilizo plasmidos bicistronicos, con 2 genes reporteros Rluc y Fluc, promotor y secuencia P53 +1, P53 +39.

2do plasmido denominado PrDEp53(+39) y PrDEp53(+1),Se agrego secuencia regulatoria del virus de la encéfalo miocarditis que inhibe la traducción por CAP y un controlinterno con PrDEF

2da Hipótesis: descartar que las secuencias 5’UTR P53, no seRealiza a través de la lectura ribosomal Cap dependiente.

Luego se descarto la traducción del 2do cistron, colocando el EMCV Rio arriba

La traducción de P53 (+39) y P53(+1) se realizo a partir del IRES en la posición 5’UTR.

resultado

3ra hipótesis: descartar que la traducción mediada por p53 (+39) es independiente de la mediada por p53 (+1).

Material y métodos: se utilizo plasmidos con construcciones Bicistrónicas, mutando a +1 ATG por AAG.Y un control WT p53 AAG

no se encontró cambios significativos de la actividadFluc, comparada con WT. Ambos genes se traducen de manera independiente

resultado

objetivo

• Descartar la posibilidad de que la actividad Fluc del ADN bicistrónico p53 (+39) sea debida a la presencia de sitios splice o promotores crípticos

Metodo• Tranfeccion: RNA celulas Hela transfectadas con plasmidos bicistronicos con ensayo con

luciferasa Infeccion con virus vaccinia ( con promotor T7)

en contrucciones eucarioticas sin promotor• Sincronizacion: Despues de 24 hs , nocodazole G2/ M o Timidina en fase S

Metodo

RT-PCR dos primers P1 3’ RLUC P2 3’ FLUC P3 5’ RLUC P4 5’ FLUC

Northern blot P-53 (+39 ) P-53 (-1 ) CVB3 IRES Control FLUC ARN

• Observaron presencia de ARN bicistrónico completo y no pequeños ARN

• Demostraron que los cistrones eran parte de una transcripción única

resultado

• Pero hay actividad Fluc posiblemente por pequeñas cantidades de transcriptos monocistrónicos generados por el segundo cistrón , no detectados por estos análisis de ARN

Metodo• Transfección de células Hela con plásmido

bicistrónico pBS-Rp53(+39) que carece de promotor eucariota pero tiene promotor T7

• Demuestra la ausencia de promotores crípticos en la secuencia 5’UTR p53 que lleve a la transcripción de ARN Fluc

• Infeccion con virus vaccinia ( T7 – ARN polimerasa )

• En presencia del virus vaccinia fue alta la actividad de Fluc y Rluc

• El control null negativo mostró actividad de Rluc pero es no activo sin este virus

• El cociente entre Fluc y Rluc del ARN bicistrónico capeado que contiene 5’UTR de p53 (+39) y (-1) se incrementa comparado con el control de ARN bicistrónico que carece de secuencias de p53

• El cociente entre Fluc y Rluc del ARN bicistrónico capeado que contiene 5’UTR de p53 (+39) y (-1) se incrementa comparado con el control de ARN bicistrónico que carece de secuencias de p53

• Se investigó la actividad de los IRES que median la traducción de ΔN-p53 y de p53 completa en las diferentes fases del ciclo celular.

• Para ello se trasfectaron células HeLa con plásmidos bicistrónicos pRp53(+39)F (regula ΔN-p53) o pRp53(-1)F (regula p53 completa)

• Las células fueron detenidas en la transición entre la fase G2 y M con Nocodazole.

REGULACIÓN DE IRES DE P53 DEPENDIENTE DE LA FASE DEL CICLO CELULAR

• Se liberó el bloqueo del ciclo celular

• Se evaluó la actividad de luciferasa en diferentes tiempos para cada uno de los vectores

• Se evaluó el ciclo celular en diferentes tiempos mediante citometría de flujo

RESULTADOS• La actividad de luciferasa de p53(+39)IRES (regula ΔN-p53) fue máxima a las 24 hs.

• Coincide con el mayor número de células en fase S (citometría de flujo-24 hs)

• Sugiere que la actividad de p53(+39)IRES es máxima durante la progresión a fase S

• El nivel de la proteina ΔN-p53 alcanza su punto máximo en fase S

RESULTADOS• La actividad de luciferasa de p53(-1)IRES

(regula p53 completa) fue máxima a las 0 hs y a las 42 hs

• Coincide con el mayor número de células en la transición entre G2 y M (citometría de flujo-0 hs y 42 hs)

• Sugiere que la actividad de p53(-1)IRES es máxima durante la transición entre G2 y M

• El experimento se repitió bloqueando el ciclo celular en G1 mediante tratamiento con doble timidina, con resultados semejantes

DiscusiónDiscusión

• La traducción mediada por IRES es La traducción mediada por IRES es un mecanismo alternativo de un mecanismo alternativo de iniciación de la traducción del mRNA iniciación de la traducción del mRNA celularcelular

• Constituye una forma de regulación Constituye una forma de regulación de la expresión génica bajo de la expresión génica bajo diferentes condiciones fisiológicasdiferentes condiciones fisiológicas

DiscusiónDiscusión

• El gen p53 juega un rol fundamental El gen p53 juega un rol fundamental en la progresión del ciclo celularen la progresión del ciclo celular

• Cumple funciones de checkpoint en Cumple funciones de checkpoint en G1/S y G2/MG1/S y G2/M

• La isoforma La isoforma N-p53 se encuentra N-p53 se encuentra altamente expresada en el comienzo altamente expresada en el comienzo de la Fase S de la Fase S

• Puede facilitar la transición G1-S por Puede facilitar la transición G1-S por inhibición de la actividad wild-type inhibición de la actividad wild-type p53p53

• Este trabajo demostró que el Este trabajo demostró que el incremento de la actividad del IRES incremento de la actividad del IRES en la transición G1-S resulta en altos en la transición G1-S resulta en altos niveles de niveles de N-p53 N-p53

• Esto provoca un efecto negativo sobre Esto provoca un efecto negativo sobre la actividad del gen completo de p53la actividad del gen completo de p53

• La isoforma La isoforma N-p53 es resistente a la N-p53 es resistente a la degradación mediada por Mdm-2degradación mediada por Mdm-2

DiscusiónDiscusión

• La traducción del gen completo p53 La traducción del gen completo p53 mediada por IRES, muestra una alta mediada por IRES, muestra una alta actividad en la transición G2-M actividad en la transición G2-M

• Este es un mecanismo alternativo de Este es un mecanismo alternativo de síntesis de proteínassíntesis de proteínas

• Sería responsable de síntesis de Sería responsable de síntesis de niveles basales de p53niveles basales de p53

DiscusiónDiscusión

• La traducción del gen completo p53 La traducción del gen completo p53 mediada por IRES es baja G2-M mediada por IRES es baja G2-M

• Pequeños aumentos en la síntesis del Pequeños aumentos en la síntesis del gen completo p53 serían degradados gen completo p53 serían degradados por Mdm-2por Mdm-2

• Este mecanismo permite la Este mecanismo permite la progresión a la siguiente fase del progresión a la siguiente fase del ciclo celularciclo celular

DiscusiónDiscusión

• Este trabajo propone la existencia de Este trabajo propone la existencia de dos IRES que mediarían en la dos IRES que mediarían en la traducción de dos isoformas diferentes traducción de dos isoformas diferentes de la misma p53de la misma p53

• Los autores no descartan la existencia Los autores no descartan la existencia de un solo IRES en p53 mRNAde un solo IRES en p53 mRNA

• La iniciación de la traducción podría La iniciación de la traducción podría darse a nivel de dos codones diferentesdarse a nivel de dos codones diferentes

DiscusiónDiscusión

• La interacción de diferentes ITAFs La interacción de diferentes ITAFs con IRES celulares, es un importante con IRES celulares, es un importante mecanismo de regulación de la mecanismo de regulación de la iniciación de la traduccióniniciación de la traducción

• Varias proteínas, incluída la misma Varias proteínas, incluída la misma p53 interactúan con el extremo p53 interactúan con el extremo 5’UTR de p53 mRNA5’UTR de p53 mRNA

DiscusiónDiscusión

• La interacción de p53 con 5’UTR La interacción de p53 con 5’UTR inhibe la traducción de p53 mRNAinhibe la traducción de p53 mRNA

• Es una función de control Es una función de control autoregulatorio negativoautoregulatorio negativo

DiscusiónDiscusión

DiscusiónDiscusión

• La producción de p53 mRNA es alta La producción de p53 mRNA es alta en G1-S, pero alcanza su pico en G1-S, pero alcanza su pico máximo en la mitad de Fase Smáximo en la mitad de Fase S

• Esto sugiere que la proporción Esto sugiere que la proporción relativa de p53 y relativa de p53 y N-p53 puede ser N-p53 puede ser decisiva en la regulación de la decisiva en la regulación de la traducción de p53traducción de p53

DiscusiónDiscusión

• Altos niveles de Altos niveles de N-p53 producidos N-p53 producidos en la transición G1-S por la actividad en la transición G1-S por la actividad de (+39) IRES, puede prevenir la de (+39) IRES, puede prevenir la unión de full-length p53 al extremo unión de full-length p53 al extremo 5’UTR 5’UTR

• De esta manera se permite la De esta manera se permite la producción de full-length p53 en producción de full-length p53 en medio de la Fase Smedio de la Fase S

DiscusiónDiscusión

• La síntesis de niveles suficientes de La síntesis de niveles suficientes de full-length p53 que interactúa con full-length p53 que interactúa con 5’UTR del mRNA:5’UTR del mRNA:

- Inhibe la traducción- Inhibe la traducción

- Genera un feedback negativo- Genera un feedback negativo

- Permite el ingreso a la fase - Permite el ingreso a la fase

G2/M del ciclo celularG2/M del ciclo celular

• Este modelo sugiere una intrincada Este modelo sugiere una intrincada regulación de la expresión del gen regulación de la expresión del gen p53 por interacciones de la proteína-p53 por interacciones de la proteína-RNARNA

• Esto sucede para permitir la Esto sucede para permitir la progresión normal del ciclo celular, progresión normal del ciclo celular, mediante controles checkpoints de mediante controles checkpoints de dicho ciclo ante un daño del DNAdicho ciclo ante un daño del DNA

DiscusiónDiscusión

• Recientemente, otras dos proteínas, Recientemente, otras dos proteínas, la proteína ribosomal L26a y la la proteína ribosomal L26a y la Nucleolina demostraron interactuar Nucleolina demostraron interactuar con p53 5’UTR, modulando así la con p53 5’UTR, modulando así la traduccióntraducción

• Ambas proteínas también Ambas proteínas también interactúan con IRESs viralesinteractúan con IRESs virales

DiscusiónDiscusión

ConclusionesConclusiones

• Estudios futuros sobre el rol de éstas Estudios futuros sobre el rol de éstas y de otras proteínas interactuantes y de otras proteínas interactuantes p53-IRES podrán proveer información p53-IRES podrán proveer información sobre la regulación de la expresión sobre la regulación de la expresión del gen p53 en condiciones del gen p53 en condiciones fisiológicas y de stressfisiológicas y de stress