mslihrosdeEditorialACRIBIA,S.A., sobreIJIOLOGAMOLECULAR yBIOTECNOL06A. (1\ 1,ulI", 1 ROlll 'C( IONALA1l10TECNOLOGi A IY 11tH)'" ) Il (NOI .o( iAHASICA () NrosDEIlJOLOGIAMOLECULAR \II1IhhkJ, NI JIm ilDL1 ASENZIMAS IJv para productos lcteos y el empleo de enzimas 1I1duslnaleshanmejorado la eficacia as como la automatizacin ycontrolde calidad de losmodernosprocesosde fabricacindepany defermentacinde laleche. Lafermentacindelamasadepanseaceleramedianteelempleodeuna mayor proporcindelevadurasatemperaturasmselevadas.Elusode amila-sas microbianas libera azcaresfermentablesa partir delos granos de almidn. 11'1 1 K() I)I I( '(ION proporcionando asl azcaresalaslevaduras para quefermenlcnliberandobur bujasdeCO, .loqueelevalamasay daalpansutexturacaractcrlsli ca.! as proteasasmicrobianas se U1ilizanfrecuentementeparabidrolizar parcialmenl e lasproteinasdel glutendeltrigo.facilitandoaslamanejabilidaddelamaso. incrementandoelvolumendelahogazaymejorandosuforma. Elempleodecultivosslarterenlaelaboracindelquesoesunodelos factoresquehancontribuidoaldesarrollodeunagranvariedadde quesos de alta calidad. La elaboracin delqueso yanosebasa enlamfeccinespollldnco delaleche,alperfeccionarseelprocesomedianteelempleodemicroorgonh mas cultivados y otros auxiliares tecnolgicos combinados conunmoderno L'(!lli podemanejodelaleche.Noobstante.puedenpresentarsegravesproble11la, deinfeccindelos cultivospor bacterifagos. quepuedenevitarse mediant e el empleo decultivosmixtos.rotacin delascepas (no asociadasconfu gas y eluso deinhibidores defagos.A partir delosprimeros aos de ladcadn de los ochenta sehan desarrollado con xito cepas insensibles a losbacterifago\. Desde lostiempos de Pasteur sehanproducido muchos avances enlaindllS triadelasbebidasalcohlicas.Lapasterizacinhapermitidoquelacervc/.o hayapasado deuna escala deproduccin local anacionale internacional.Las industrias cerveceras y de fabricacinde vinos y licores hanpasado rpidamen-tede ser unidades artesanales a grandes complejos cuyo objetivo es el manlener unproductodecaractersticasuniformesan cuandolasmateriasprimas.la plantaylaescaladeoperacinestncambiandocontinuamente.Paraconse-guirunproductoreproducible,elprocesodefermentacinsehanormalizado mediante elcontroldeparmetroslalescornolavelocidaddemoculacin.la viabilidad y condiciones de almacenamiento delaslevaduras.las concentracio-nesdeoxgenodisuelto.loscontenidosdenitrgenosolubley deazcaresfer-mentablesdelmosto y latemperaturadelproceso.Sehanllevado acabo inno-vacionescomoelusodeprocesos defermentacincontinuos.laobtencinde cervezaconconcentracionesdemostoelevadas.elempleo de cerealesnomal -teados y enzimas microbianos y la produccin de cervezasbajas encarbohidra-tos. obtenindose diversos niveles de xito. Thmbin sehan aplicado las tcnicas genticas convencionalespara mejorarlaspropiedades deseables de laslevadu-rasy eliminarsuscaracterlsticasindeseables. LEVADURASDEPANADERIAYPROTEINASDEORGANISMOS UNICELULARES EnelsigloXVII.lospanaderosobtenansuslevadurasdelasfbricasde cervezalocales.aunque,debidoasusaboramargoy alasactividadesdefer-mentacinvariables.estaslevadurasfueronsubstituyndose gradualmentepor lasprocedentesdelasindustrias de elaboracindebebidasalcohlicas.quea 1I1OTENOLOOIADELAFI;.RMI 'NTAUON ""\"loIoleronpor las depanadera. Lasprimeraslevadurasprensadas depa-1I1I,!rllaseobtuvieronaproximadamenteen1781utilizandounprocesodeno-IIlIlIilllu Id lolands , y posteriormente en1846mediante elprocesodenomina-d .. de "Viena.Ambos procesos obtenan unos rendimientos delevadura bajos, ddS % y 14"1,respectivamenle,referidoa lasmaterias primas,y aproximada-IIl elll c un30"1,de alcohol.Entre1879y1919se' consiguieron avancessubstan- enlasfermemaciones industrialesbiomasa delevaduraque ,(Innla produccin industrial de levaduras de panadera deformaindependien-lealadelasbebidasalcohlicas.En1879,Marquardtintrodujolaaireacin de lapasta decereales,loque aumentaba elrendimiento y disminua la produc-cin concomitante dealcoholal 20"lo.Las mejoras posteriorescomoelaporle gradual delazcar,primer ejemplo delosprocesos defermentaci n conretroa-limentacin, elevabanlaeficaciahasla situarla enunvalorprximo aldelm-ximotericoysinlaformacinconcomitantedealcohol. En Alemania,durante la Primera Guerra Mundial, las levaduras d'W'anade-ra,hechas crecer enmelazas,seproducancomosuplementoproteicopara el consumo humano, siendo ste elprimer proceso defermentacinmoderno des-linado alaproduccin deprotenas de organismos unicelulares.Posteriormen-le,tambin enAlemania, durante laSegunda Guerra Mundial, se empleCan-didaIItilis,culti vadaencaldosdedesechoprocedentesdelamanufacturade papely pulpa alsulfito y enderivados de azcares obtenidos por hidrlisisci-dadelamadera, comofuenteproteicaparaalimentacinhumanayanimal. E>leprocesoseha utilizadoenUSA,Suiza,Taiwany Rusia.A partirde1968 diversascompaasdeEuropa,USAyJapnhanconstruidoplantas destina-dasalaproduccindeprotenasdeorganismosunicelulares,algunasde ellas yacerradasporlos problemas deregulacino loselevados costosmientrasque otms continansusprogramas dedesarrollo.Por ejemplo,en1981,lel enIn-glaterra, aument la escala deproduccinusando la bacteria aerobia Merhylo-phi/liS methylotrophus hasta producir 3.000 lln/ mes de Pruteem>,un producto destinado a la alimentacin animal.Laprimera protena microbiana nueva pro-ducidaporfermentaciny aprobadapor elgobiernoinglspara consumohu-mano,laMicoprOlena,seproducea partirdelhongoFusariumgraminea-r/lmpor la compaaRankHovi s McDougall, enInglaterra. Sumorfologa fi -lamentosa confierealaMicoprotenaunatexturanaturalsimilaraladela carne,permitiendo que elproductosevenda aunprecio demercado remunera-doryquelogrelaaceptacinporpartedelosconsumidores. I N I ROI)UCCION7 PRODUCTOSOUIMICOSyADITIVOSALIMENTARIOS Acidosorgnicos La produccin comercialdeci do lcticopor fermentaci6.ILSOinici en1881 y anhoyel50"1,delcidolcticoutilizadoanivelindustrialseproducepor estemtodousandoLactobacil/lIsdelbrllckii. Elcidoci tricoJe_produjo delzumo y posteriormentefuesinteti zado a partir degliceroly otros compuestos Qumi-cos. En1923 se obtuvo citrato mediante fermentacinindustrial y diezpus,la produccinlas10.000 Tm, delas cuales ms del80"1,seobtenan porfermentacin.Actualmente seestima queelmercado anualesdemsde350.000Tm,producidasexclusivamenteporfermentacin. Inicialmente, se emplearon mtodos de cultivo ensuperficie con Aspergil/us ni-ger como organismoproductor.DespusdelaSegundaGuerra Mundial sein-trodujo unproceso queutili zaba A. niger sumergido y hacia1977 se comerciali-zotroprocesosumergidoqueempleabaCandida,mseficaz. Otroscidosorgnicsmanufactl!radosdeformaeconmicamenterenta-bleporfermentacinsonelcidoglucnicoyelitacnico.Elcidoactico para usoalimentariovinagre)se obtiene exclusivamente por oxidacill deleta-nolmediante Acetobacler aceli,entantoqueel cidoacticoindustrial sema-nufacturanicamenteQQrmtodosqumicos.--A lcoholes ycetonas DurantelaPrimeraGuerraMundialelsuministrodeaceilesvegetalesim-portadosutili zadosparalaproduccin deglicerolsecerrparaAlemania, que rpidamentediseunprocesodefermentacinparaproducirglicerol,usado enlafabricacin de explosivos,basado eneldescubrimiento de Neuberg de que estecompuestoeraproducidoporlaslevadurasaexpensasdeletanol,enpre-sencia debisulfito sdico. Durantelaguerralos inglesessatisfacieronsusnece-sidadesdeacetonaporeldesarrollodeunprocesodefermentacinacetona-butanol anaerobio conClostridillmacetoblltylicll/11,siendo elprimer proceso defermentacin a gran escala que necesitaba mlodos decultivo puro para pre-venir lacontaminacin.Despus de laPrimera Guerra Mundial la demanda de acetona disminuy I--e n-butanol aument, por lo que este produto con-tinuproducindoseporfermentacinhastalosaoscincuenta_enIQLqueel preciode losderi vados delpetrleocaypordebajodelpreciodelalmidny delossubstratosa base de azcar.La fermentacinacetona-butanol oper co-mercialmentehasta hacemuy pocoliempo,enuna planta dela NatonalChe-micalProducts, de Sudfrica, debido alaescasezdepetrleo originado por los embargosinternacionales. KUIOTECNOLOGIADELAfERMENTACION Halcoholindustrialproducidoquimicamentefueutilizadoextensamente l' rtUSAnpartirdelao1800.Laindustriadelafermentacinalcohlicase I"ideluna vezrevocada la prohibiciQn,yen1941acaparaba el77"lodel merca-111> delalcoholindustrial.Durantelosaoscincuentaysesenta,eletilenoera hllluln,porloque se disearon procesos dehidratacin eficacespara su conver-,i,l" enetanol que hicieron que laproduccin de etanol sinttico fuera ms com-I>clllivneconmicamentequelosmtodosdefermentacin.En1973lacrisis petrleo,conelconsiguiente incrementodelosprecioshizoqueelmundo cnl erose interesase por combustiblesrenovablesalternativos. Por ejemplo, Bra-.il se embarcenunprogramanacionalsobre elalcoholqueapuntabahacia el desarrollodela capacidaddefermentacinqueprodujese en1987tresbilla nes de galones de etanol anuales a partir de caa de azcar.Elgobierno federal deUSA alent eldesarrollo de la produccin de alcohol a partir delafermenta-cin delmaz mediante el Gasohol Program, reduciendo losimpuestosdelga-sohol (gasolina conun10"lode alcohol), por lo que seestablecieron unnme-ro considerable de plantas de fermentacinde pequel\a y gran escala que produ-canalcoholmedianteprocesosdefermentacincontinuosydiscontinuos;el objetivode esteprogramaeraconseguirunvolumendeproduccinanualde 1,8 billones de galonesa mitades delos ochenta. Tambin seobtiene etanol por lafermentacindelsuerode leche conK/uyveromyces fragi/is,aunqueelvolu-mendeproduccinobtenido por esteprocedimientoesminsculocomparado con el producido por S.cerevisiae a partir demalz o caa de azcar.Lafermen-tacindellactosuero(quesolotieneaproximadamenteun5 "lodelactosaen peso/volumen)debellevarseacabo enlugaresprximos alasfbricasdeque sos,puestoquesinoloscostosdetransporteseranprohibitivos. Actualmente solounpequel\o nmerodeproductos qumicosdegranvolu-mendeconsumo se obtienen por fermentacin,ya que prcticamente todos ellos manufacturanapartirdelpetrleoy del gasnatural.Lasfluctuacionesdel costo y elincierto suministro depetrleo,as como lainquietudfrente alagota-mientodefinitivodelasfuentesnorenovableshanintensificadoelintersdel empleo de recursos no petrolferos para laproduccin deenerga y de compues tosqulmicos. Aminocidos Durante losltimostreintaaos,la.m-oduccindeaminocidosmediante procesosde fermentacinaerobiaha experimentadounarpidaEl glutamato monosilicoy la lisina sonlosque seproducen encantidadesmayo-res,con niveles de produccin mundial anuales de 370.000 Tmy 40.000 Tm,res-pectivamente.Losprocesos deJermentacin deun.elegnte tra-bajo deinvestigacin acercade los mecanismos bioqumicos que regulan labio-I Nl RODUCCI ON s ntesisde aminocidQsporlosmicroorganismos, consiguiendo lasuperproduc cindeaminocidosmedianteunacombinacinde mutacionesy delconl rol delosprocesosdefermentacin.Lastcnicasempleadasintentanestimulara las clulas para que ingiera nuevosmateriales, previniendo o impidiendo lasreac-cioneslaterales, as como induciry activar alos enzimasbiosintticos y reducir o inhibirlaactividad enzimtica que podra degradar elproducto, y finalmelllc facilitarlaexcrecin delaminocido.Las investigaciones clsicas utilizadaspor eldesarrollo delafermentacin del cido glutmico han dado un Impetusigni-ficativoa los procesos defermentacinpara la produccin deotros metabolitos primarios,deformaqueactualmentelamayoradelosaminocidos seprodu cencomercialmente mediante estos procesos.Se han aplicado tcnicas similares a la produccin de mono fosfatosdeinosina y guanosina, potenciado resdelsabor. Biopolmeros Enlosltimos alias sehandiseadoungran nmero defermentacionesjn-dustriales destinadas alaproduccin de bioolmeros mibjanos.La mayora delospolimeros sonsintticosy portanto sonsensiblesa las fluctuacionesdel preciodelpetrleo,deformaquelosbiopolmerospuedenserespecialmente importantescuandoseeleveelpreciodel crudo. msimportanteenfuncindelvolumendesuproduccin esla- mxanano,titizada como geli ficanteo estabilizan!e desuspensiones, producidapor ermentacinaero laeaactenaantomonas campes/risoExistenotrasgomasmicrobianasdeinterscomercialqueseobtienen-aparti r deAze/obac/er vine/andii (alginato), Aureobasidium pul/u/ans (pululano), Se/e-rotinum(esclerogl ucano)y Pseudomonas e/odea(gelano).Loselevadospesos molecularesy viscosidadesdelospolisacridos extracelularesplanteanproble-masenlosprocesosdemezcladoy transferencia de masa y calor existentesen unfermentador,porloquedebensertenidosencuentaalahora dedisel\ar unaparatoptimoparaestosprocesos. Unpolmeromuyprometedorqueestsiendo desarrollado actualmente es eI-polihidroxibutirato,poliester termoplstico que sepuede acumular intracelu-larmente enalgunos tipos de A/caligenes entrophus hasta unniveldel70"loen pesodebiomasa.Esteproductopodrapermitir el empleo deplsticosbiode-gradablesenlugardelosplsticosobtenidosapartirdelpetrleo,no biodegradables. Vitaminas Enlaactualidad la mayorla de lasvitaminasseproducenpormtodosqul-micos. Aunque sehan descritomtodos de fermentacinara unmnnmero de vitaminas del grupo B, comQ.l.a tiamina> biotinaflico,cidoan.lo1C, 1011IOTECNOLOOIADELAFERMI'N IAlION II ko,piri doxamina,vitamina8 12y ribonavina.nicamentelasdosltimasse mediante mtodosbiolgicos.Lasntesisqulmi cadelavitaminaB'2 C\complicadaporlo que slo seobtiene comercialmenteme-d,lIIl e fer mentacin industrial conPseudomonas.Enlaproduccin deribofla-\ li lalo,procesosdefermentacincompiteneficazmenteconlosmtodosde "(lIl csisodesemi sntesisqumica,deformaquelatercerapartedelvolumen li tproducci n de esta vitamina se oblieneporfermentacin.En1935, se utiliz 1" ImCf' dmenle Eremolhecium ashbyii para obtener lavitamina, consiguindose UII OSrendimientos que fueronincrementndose gradualmente hasta alcanzar los 5,3g/ I,aunque debidoa lainestabilidad de la cepa, posteriormente seprefirie-ron olras especies, como Ascomyceles y Ashbya gossypii.Unapatente reciente (1984)describeunaceparecombinantedeBacill"ssub/ilis capazdeproducir 4,5 g deribonavina en24h defermentacin,perodo muyin feriaralnecesario conlosAscomyce/es,queseaproximaalos5 das. Insec/icidasmicrobianos Losinsecticidasqumicos,empleadoscongranxitoenagriculturaypara favorecerlasaludpblica,han sidoampliamenteutilizadosestesiglo.Sinem-bargo, lascrlicasacercadequepuedenmatarorganismos distintosalblanco O de que los organismos blanco pueden volverseresistentes aellos han conduci-doaldesarrolloy comercializacindeinsecticidasmicrobianos,deformaque lainvestigacinescontinuaenestecampo.Laproduccinde Bacillus/hurin-giensis superaconmucho la decualquier otroinsecticidamicrobianoproduci-docomercialmente.Lascondicionesdefermentacinsediseandetalmodo que sealcance unrendimientoy una bioactividaddelaendotoxina,producida deformaconcomitanteconlaesporulacin,mximos.Lasdistintascepasde 8.fhuringiensisy de otrosorganismos capacesdesintetizar insecticidasbacte-rianosyfngicosmanifiestantoxicidadesdiversas.Losgenesdelatoxinade BacillusfJllIringiensis han sido clonados enEscherichia coli y Bacillus sublilis, mejorandopotencialmentelasvelocidadesdeproduccin y alterando suespec-trodeeficacia. Giberelinas Las giberelinas, diterpenoides que tienencuatro anillos de carbono, seapli-can para laaceleracin de lagerminacin dela cebada enla produccin demal-ta.Laprimera giberelina fuedescubierta en1938y enlaactualidad se conocen ,esentacompuestosdistintos.Elcidogiberlicoseprodujoinicialmenteme-diantecultivoensuperficieenunafermentacinprolongada,consiguindose rendimientos de 40-60 mg/ I de producto.Hoyendalasfermentaciones comer-ciales por cultivos sumergidosproducen rendimientos significativamente mayores. I NI KOtl lJ('C' ION11ENZIMASMICROBIANOS Laexplotacincomercial de enzimasmicrobianos ai sladosfue iniciadapor JokichiTakamine,unjaponsqueemigraUSA,yqueen1894patentun mtodoparalapreparacindeenzimasdiastsicosapartirdemohos,comer-cializadosconelnombredeTakadiastasa.Estemtodo,queimplicaelcreci-miento de los mohos enla superficie deunsubstrato slido, como trigo o salva-do,erareflejoindudablemente delosprocesos similaresdepreparacin deali mentos orientales fermentados.Eldesarrollodefermentaciones de enzimasin dustrialesbacterianosfueiniciadoporBoidinyEffront,enFrancia y Alema nia,respectivamente,quienesen1917patentaron elempleodeBadllus subfili, y Eacillus mesenlericus para obtener amilasasy diastasas tambin mediantetc nicas decultivo ensuperficie. Losmtodosdecultivo ensuperficiepara lapro-duccindeenzimasfngicosseutilizaronenUSAhacialosanoscincuentay anhoycontinanemplendose,especialmente enJapn.Lasfermentaciones fngicassumergidas seem plearon enUSAy Europa para la produccin de en-zimas basndose enlaexperienciaconseguida con lasfermentacionessumergi-dasenel desarroUo delproceso de produccinde Penicillium,enlosNorthern RegionalResearchLaboratories(NRRL)deUSA. La introduccin de enzimas microbianos industriales enelmercadoestable-cielfundamentodelatecnologaparalaaplicacindeenzimas,particular-menteenreasdelprocesadodealimentoscomolaproduccindecervezay zumos defrutasylamanufactura dehidrolizados de almidn.Enlosaos se-senta elmercado delosenzimasindustriales seexpandi dramticamente alin-cluirse proteasas alcalinas enlosdetergentesenpolvo. Laproduccin y empleo de glucosa isomerasa microbiana para laman ufactura de jarabes demazricos enfructosarepresentunhitomuyimportanteenesta dcada,producindose ungran impacto en elmercado deedulcorantes calricos,dominadohasta en-tonces por lasacarosa. EnUSA,laindustria destinada a la elaboracin debebi-das era elusuarioindustrial ms importante de azcar, perohacia1984 lasprin-cipalescompaasdefabricacindebebidasnoalcohlicashabanllevadoa cabo la substitucin total de la sacarosa por los jarabes demaz ricos enfructo-saoOtrodesarrollotcnicosignificativo delosaossetenta consisti enlaco-mercializacindea-amilasaestableatemperaturaselevadasobtenidaapartir deBacilluslicheniformis.La capacidaddeeste enzimaparalicuarelalmidn atemperaturasdehasta110oCnoslohahechomseficazelproceso dehi-drlisis delalmidn sinoque tambinha impulsado el aislamiento omodifica-cindeotrosenzimasconestabilidadelevada. 12BIOTENOLOGIADE LAFERMI!NTACION 1-IOQUerOSDEUSOMEDICO IIIflh6ficos Durante cincuenta anos,siguiendo la sugerencia dePasteur de quelosefec-to, antagonistas de unos microorganismos frente a otrospodan tener potencia-lesefectosteraputicos, seprobaron como medicina sinxito diversasprepara-cionesmicrobianas. Finalmente, enelano1928, Alexander Flemingobserv que elPrmicillium nOfacum, contaminante de los cultivos deStaphyfococcus aureus, mataba lasbacterias, demostrando que elingrediente activo, denominado peni-cilina,podainhibirotrasmuchasbacterias.Unavezaisladalapenicilinaen una formaactiva estable porFlorey y Chain en1940,sedemostr sudestacada actividad antibacteriana y se desarroll enUSA unproceso de fermentacin co-mercialconelapoyodelNRRL (NorthernRegionalResearchLaboratories)y lacolaboracindevariascompaasfarmacuticasamericanas. Eldesarrolloconxitodelaobtencinporfermentacindelapenicilina marceliniciodelaindustria delosantibiticos.Muypronto seaislaronmu-chos nuevosantibiticos, como la estreplomicina, a partir deespecies de Sfrep-fomycesy sedescubrieronlas cefalosporinas,producidasporCephafosporium acremonium.Laspenicilinas,cefalosporinasy estreptomicinasfueronlospri-merosantibiticosmsimportantesdescubiertos,aunquedesdelosanoscua-rentahastanuestrosdlasseaislananualmentecientos denuevosantibiticos. Eldesarrollo del procesodefermentacinde lapenicilina tam binha dado lugar aavances generalesclavesenlafermentacinindustrial, marcando el co-mienzodelosprocesoseficacesdefermentacinfngicasumergida.Laedad deoro de lagenticamicrobianaclsica,queimplicabatcnicasdemutacin y seleccin,iniciada aproximadamente enelao1940,hapermitidoincremen-tar,porejemplo,losrendimientosde penicilina desdeunospocosmgpor litro hasla20gi ldecultivo.Tambinseiniciaronestudiossobrelanaturalezadel complejo proceso metablico implicado en la produccin demetabolitos secun-darios,molculas pequeas, como losantibiticos,queno lienenunpapelob-vioenelcrecimientoymantenimientodelaclula. Inicialmente seobtuvieron penicilinasmodificadas (semisintticas), conac-tividado sensibilidad frente alainactivacin por cidos o enzimas alterada por transformacin qumica de la penicilina natural;postedormente, algunas de las etapasdesemisintesisfueronllevadasacaboporconversionesbiolgicas. TransformacionesdeeSferoides Elempleo de microorganismos para llevar a cabo transformaciones enzim-licasaltamenteselectivasy especificas deproductosfarmacuticosrepresent unavance deci sivoeneldesarrollo demedicamentos conhormonasesteroides. INI HOllUlION Enlos aoscuarentaseestableciquelacortisona,esteroidesecrcladopo,lu glndula adrenal, aliviaba eldolor delospacientes conartritisreumatoicle. pt'" loque sedi seunprocedimientodesntesisqumicaquerequera37etapa; para laproduccin decortisona, a un costo de200$ elgramo.En1952,los cien-tficosdeUpohnCompanydescubrieronunacepadeRhizopusarrhizusq\lc hidroxilaba la progesterona,produciendoll-a-hidroxiprogesterona, loque per mitiqueelprocedimientode sntesisde cortisonapasase de 37aII ctapasy seredujese su costo a16$/ g.A lolargo de losanos sehan introducido mejora, constantes en elproceso, quehan ido disminuyendo progresivamente losCOSlu, deproduccindeformaqueen1980steeradesloO,46$/g. Sehanaplicadotcnicasdebiotransformacinmicrobianasimilarespum la sntesis deotros esteroides,particularmente a1dosterona,prednisona y p,cu nisolona.Lastcnicassontambinimportantesparalasntesisdeotros cam puestosqulmicos,tantofarmacuticoscomosinaplicacionesmdicas. Vacunas Existenreferenciasacercadelasenfermedadesinfecciosasenalgunosunt i-guos escritos hindesy evidencias arqueolgicas de lesionestuberculosas enlas momiasdelasprimerastumbasegipcias. Lacapacidad de conferirresistenciaa la enfermedadmediantevacunacin fuedescrita enprimer lugarporlenner, en1798,quienobserv quelosindivi -duosinoculadosconviruelavacunaovacciniaeraninmunesalaviruela. Elempleodevacunas,ascomolainmunologia,comenzaronhacia1877, cuando Pasteurdirigisuatencin alascausas yformadeprevenirlasenfer-medades infecciosas delhombre y losanimales.En1890Behringy Kitasato in-munizaronanimalescontoxi nasinactivasde difteriayttanos,seguidamente KochaislelVibriochoferae y laprimera vacuna delclera fueadministrada en1894porFerrany Clua,mdico espaol,mediante inyeccinsubcutnea de caldosde cultivovivosamsde30.000espaoles.Durante laprimeraGuerra Mundiallosejrcitosfueronsometidosaprogramasdevacunacincontrael tifusy en la segunda Guerra Mundial seintrodujounprograma similar contra elttanos.Afinalesdelosaostreintacomenzlavacunacinmasivacontra la difteria.Eluso extendido delas vacunas contra la IOsferina y la poliomielitis dacuenta delxito obtenido enlosensayosrealizadosen1955con estasvacu-nas. Hacia1936 Calmette y Ourin observaron que el cultivo enserie debacilos tuberculososinfecciososovirulentosenunmedioartificial durantelargospe-riodosatenuaba suactividadhasta elpunto dequeyano erancapaces decau-sarlaenfermedad.TresaosmstardeseintrodujolaprimeravacunaBeG (BacilodeCalmette yOuerin) queinmunizabafrentealatuberculosis.Eluso de vacunasatenuadas sufri un granrevesdiez aos despus, enelllamado de-14 1lI011'CNOLOOIADEl AH .RMENI'ACION ' ''Mle deLbcck, enel que 72 de los 240 nil os vacunados con laBCG murieron ~ ( ) " ' O resullado deltratamiento Con unlote devacunasque contenanelbacilo dcla1ubercuJosisvirulento.Lasvacunasbacterianasutilizadashoyconsisten l' ncepasvivasatenuadasdelos organismosproductores de enfermedades ode r q)l\) rtlacionadas est rechamente, cepas patgenas muenas o componentes ce-IIllare>que contienenanligenosy que sonefectivospaminducirlainmunidad I,ollle3lascorrespondientes enfermedadesinfecciosas.Aunque laproduccin ue v'lcunas esuna aplicacin importante del proceso defermentacin, su escala demanufact ura es relati vamente pequea. La tecnologa de fermentacin utili -la procesos continuos o discontinuos cuyas condiciones deben ser diseadas con objetodeopti mizarlaproduccincelulardelmaterialinmunognico. Latecnologa de lasvacunasvricasfueprimitivadurante muchos aos, de-bido alanecesidad de emplear animalescomofuente devirus.Losembriones de pollo seutilizaron comofuente de virushasta que, hacia1950, se desarrolla-ronlas tcnicas decultivo celular.Con estas tcnicas,laproduccin de vacunas viricasentr aformarparte delcampo de la fermentacinindustrial .Las clu-lasdemami ferosse cultivan enunmedioapropiadoy,enunacierta etapa del crecimiento,seinoculan con los virus,que semultiplican enlas clulashuspe-des.Estatcnicapermitepreparargrandescantidades devirusmuchomenos contaminados por mat eriales extraos delhusped,bacterias ovirus,que esta-banpresentesenlosobtenidosporlosmtodosantiguos. ImpactodelastnologasdehibridomasydeDNArecombinante Losrecientese importantesavancesenlatecnologla dehibridomasy enla ingenieragenticahanextendidoelalcanceyelpotencialde latecnologa de la;fermentacionesindustriales. ANTICUERPOSMONOCLONALES En1975,KohleryMilsteinfusionaronunmelona deratn(clulade cn-cerdepiel)conunglbuloblancoproductordeanticuerposobteniendouna cl ula hibrida (hibridoma) que combinaba las di stintas capacidades de lasclu-laspadre,la divisincelular ylaproduccin de anticuerpos;tambin desarro-llaronla tecnologa bsica para la produccin deanticuerpos monocionales, pre-paraciones de anticuerpos especficos individuales obtenidos apartir declulas producidaspor unnico antepasado o clan. Los anticuerpos monoclonales tie-INI Rllllun IUN I nenunaelevadaespecificidllducuninareceptoresindividuales,moleul o' o superficies y tienenmuchas aplicacionespotenciales qucaprovechansus carac terlsticasnicas,particularmente enanlisis clnicosy enlaterapiapara deter-minadas enfermedades. El mercado deanticuerpos monoclonales ha crecido 1'11 -pidamentey seesperaquealcance elbillnde dlares en1990. Laproduccin de anticuerpos monoclonales se ha llevado a cabo invivo por inyeccin delclan delhibridomaenellquidodelacavidadabdominaldelanimal(usualmente ratones)oinvilroenunagranvariedaddesistemasdeculti vocelular.Estos sistemas permiten conseguiruna mayorproductividad globalpor lo que sehan diseado y comercializadouna gran variedadde reactores para cultivos celul ares. TECNOLOGIADEDNARECOMBINANTE Laingeniera gentica impli ca la formacin de nuevas combinaciones de ma-terialgenticomediante la insercin degenesextraos, producidosfueradela clula,aunorganismohuspedenel quenoexistendeformanatural.Elpri -mer genfueclonado en1973y desde entonceslas tcnicashan avanzadotanto queenlaactualidadsepodranproducirproteinasextraasencantidades comerciales apartir deuna gran variedad de cepasrecombinantes de procario-tasy eucariotas,incluyendo clulas deanimalesy plantas. La industriafarma-cuticahainvertidomucho eninvestigacin y desarrollo enestecampo, siendo elprimer producto que ha conseguidola autorizacinpara suusoteraputico lainsulina humana producida poruna cepa recombinante de E.coli.1lunbin sehanpreparado otras muchasprotenas mediante esta tcnica, entre ellas otras hormonas humanas y varios factoresde crecimiento, compuestos antitumorales yantivricos,yantgenosviralesyenzimas.Laprimeravacunaobteni dame-dianteingeniera gentica comercializada ha sido una vacuna de usoveterinario introducidaen1986contralapseudorrabia,unvirust ipoherpesqueinfecta aloscerdos. Lasinvestigacionespionerassobreingenjeragenticaylosprimerospro-ductos comercializados utilizaron E.coli como huspedyaque sussistemasge-nticoseran muy conocidos.Loscaballos de batalla delafermentacinindus-trial,Bacillus, Aspergillus y Saccharomyces pueden sermejores huspedes alargo plazo,unavezquesussistemasgenticosseconozcanconmsprofundidad. ElE.colinosecretaengeneralproteinas,mientrasquelosBacillusproducen rendimientos altos de protenas extracelulares.Como losprocariotas no glicosi-lan las proteinas, las diferentes especies deSaccharomyces y Aspergillus pueden serloshuspedesadecuadosparalaproduccindeglicoprotenasanimaleso humanas. Se sabe que Aspergillus niger es capaz de secretar hasta 20 gi l de pro-te!naapartirdeunnicogendeunenzimaextracelular.Algunosproductos OIOTBCNOLOOIADE' ION IlIrlllUCUUcosrccombinantes sehanobtenidomediante S.cerevisiae.Sinembar-Hn, Ins si stemas de secrecin y sntesis proteiea son signili cativamente ms com-pleJus ene,'tosmicroorganismos eucariotasqueenlosprocariotas,porloque queserinvestigadosmscompletamenteparapermitirelusodeestos orgunl smosenlosprocesosdefermentacin,particularmenteparala produc-cindeproductosrecombinantesnofarmacuticos,porejemplo,enzimas. Lasprotenasy los pptidos, productos detraduccin de losgenesestructu-nllcs,son elprimer objetivo obvio de produccin mediante la tecnologa de ADN recombinante.A largo plazo, podra serposible la manipulacin delmetabolis-moprimario y secundario para mejorar la produccin demetabolitosmediante laingenieragenticadeenzimasclaveenlasecuenciametablica. En lossiguientescapitulos sedescriben algunosdelosaspectosmsespec-ficosdeesteterna. Introduccin Captulo2 Biologa delosmicroorganismos deusoindustrial comercialmente importantes de lasfermentaciones industria-leseenecena4 categorasprincipales: um'crobianasdesas'y rios que no son necesarios para el crecimiento celular.Las clulas utilizadas pa-ra estosproductos tienenuna granvariedaddepropiedadesbioqumi-casyfisiolgicas.Laproduccincomercialdeproductosdefermentacinha empleadorincipalmente diversas especies de bacterias, levadurashonosaun-quelosavancesrecien teseneldesarrolloetCOleasecu tivodeclulasde animaleslantas hanperm"fIdomtroduclr clulasms comleas enloro-cesosdefermentacinEnestecaptulosevanatratarlaspropiedadesdelas especiesmsmportantesutilizadasas!como losaspectosgeneralesdelcreci-mientoy metabolismomicrobianosquesonimportantes paralosprocesosin-dustrialesdesucultivo. Microorganismosindustriales En la naturaleza existen dos clases fundamentales de clulas,asrocarlotas ylaseucariotas,ambasutilizadasenlosprocesosdefermentacinindustrial. 17 DIOTECN01.OGIADELAFERMENTACION ellcariotas tienenunncleo diferenciadorodeado por unamembra-IIlJ ,'i.s uADNnuclearestasociadoaprotenasyseencuentraenestructuras drli"ldasdenominadascromosomas.y ademstambintienenotrasestfUctu-11 orgnulos con funcionesbioqumicas o fisiolgicasespecficas. Por elcon-l,ul10.lasprocariotascarecendeunncleobiendefinido,detalmodoqueel lIIoterialgentico,enformadeADNendoblehlice,noestseparadodelos otros constituyentes de la clula por una membrana; estasclulas tambin care-cen de otros orgnulos especializados existentes enlaseucariotas, como por ejem-plolasmitocondrias,y losenzimas asociadosa estos orgnulos enlos eucario-tasse encuentran enelprotoplasma y enlamembrana plasmticadelasproca-riotas.EnlaTabla2.1secomparanlaspropiedadesdelasclulas eucariotas y procariotas.Enlosprocesosde fermentacinseempleanclulasbacterianas. que son procariotas, y hongos, levaduras y clulas animales y vegetales, que son eucariotas. Losmicroorganismostambinsedistinguenenfuncindesusnecesidades de oxigeno, pudiendo dividirse enlosaerobios estrictos, como losSlreplomyces y lamayora deloshongosfilamen tosos,quepueden llevaracabo sumetabo-lismoy crecimientonicamente enpresencia deoxigenoatmosfrico,losanae-robiosestrictos, como losC/oslridia,quenicamentepuedencrecerenausen-cia de oxigeno y losorganismos facultativos.entreelloslaslevadurasindustria-les,quepuedencrecerensituacionesdeaerobiosisydeanaerobiosis. Lasb-cterias implicadas enlosprocesos de fermentacin son _principalmen-tequimoorgantrofos, esto es.puedenobtener su energla y su carbono per oxi-dacindeloscompuestos. orgnicos,En;;Tabla2.2semuestranalgunasde Tabla2.1.Caractersticasque diferencianalaseucariotasdelasprocariotas Caracterfstica Orgdnulos Ncleo Mitocondria Rotlculoendoplsmico Genotna No.demolculasdeDNA ONA enorgnulos DNAformandoestructurascromosmicas ProcariotasEucariotas + + + > 1 + + l.Lasbacterias puedencontenerfragmentospequenos deDNA (plsmidos)adems del genoma principal. 1l10LOGIADELOSMIHOORGANISMOSDEUSOINDUSTRIAL Tabla2.2.Propiedadesdelgnerode bacterias quimo-organotrficasdeim portandaenlasfermentacionesindustriales Gllero Ell lrrobolaia J' Il'udomUl/llS .rlllffhom01Ul;J , Itdohacter A/rflligenes Dad/bu Clastridium LtuClJ lI()sllJ( I..(l(toballus Co ry11f bacterium Reaccin Gram ... + + + + Propiedades Endos-porasForma Varilla Varilla Varilla Varilla Varilla/coco +Varilla + Varilla Esfrica Varilla Irregular Ejemp/o deespecies Aerobias'(produclos) + + + + + E.coti (protelnas recombinanles) p.ovalis (cido glucnico) p.j1uorescens (2-oxoglucon.lO) X.campesr,.s (gom.xantano) A.aceti (cidoaclico) A.faecatis (gom. curdlao) B.subl iJis, B.licheniformis, B.amy/otiquefa-ciensetc. (enzimas extracelulares) B.coagulalls (glucosa isomerasa) Blicheniformis (bacitracina) B.brevis (grarnicidin.S) B.rhuringiensis (insecticida) eacerobutylicum (acetona, bulanol) eIhermocellum (acetato) L.mesenleroides (dextranol, _oL.delbruckii (cidolctico) +C.gluramicum (aminocidos) C.simple.x (conversin deoSlcrolde) 20BlarENOLOOIADELAFERMENTALAFERMI ' N I\CION del nu,substanciasaromatizantescomolaquininay cl lll ollladelJazmlnyla l1Iel1l3,O insecticidas como las piretrinas.Esposible que algunos deestoscom-puedan obtenerse enelfuturopor cultivos ensuspensin.Para obtener rendimientos altos demetabolitos secundarios vegetales parece ser necesario un cierto gradodeagregaciny diferenciacin celular,loquenosiempre esdesea-ble en unaplanta a gran escala yaque generalmente elperodo de cultivonece-sariopara lasclulasdiferenciadasesmslargoqueelnecesariopara lasno diferenciadas,loqueaumentaloscostosyelevaelriesgodecontaminacin microbiana. Regulacindelmetabolismo Una clula cualquiera tiene elpotencial gentico necesariopara producir apro-ximadamente1.000 enzimas. Naturalmente, con tan complejaredderutasme-tablicasoperando,estosenzimasdebensersintetizadosenproporcionesco-rrectasy debentrabajar enformacoordinada para permitir alaclulafuncio-nar como una unidadeficiente.Losmicroorganismos soncapacesde alterar su composicin y metabolismo en respuesta a cambios medioambientales, y los prin-cipalesmecanismos reguladores que lesconfieren esta flexibilidadoperan tanto aniveldelasntesisdeenzimascomodemodificacindesuactividad. En un proceso defermentacin dadoelflujodesubstrato a travs dela com-plejaredderutasanablicasycatablicaspuede verseinfluidoporuna gran variedaddemecanismos.Determinados enzimaslimitan tesdelavelocidades-tnsituadosestratgicamenteenlasdiversasrutas,y usualmentesonsensibles amecanismosdeinduccin/represin Y activacin/inhibicin(vasemsade-lante).Lasobreproduccindemetabolitosprimariossedebe alasaltasveloci-dadesdeflujodiferencialdelasreaccionesanterioresquedanlugaralaacu-mulacin delmetabolito y tambin a las bajas velocidades delas reaccionespos-terioresquepodriancausarsudegradacin outilizacin.Losprocesosquere-gulanlaproduccindemetabolitossecundariossonmscomplejosymenos conocidos,aunque esevidentequemuchosdeestosmecanismosson similares alosquecontrolanelmetabolismoprimario. Naturalmente, eneldesarrollodelosprocesosdefermentacinpara laso-breproduccin deunmetabolitoparticular,esesencialtenerencuentalosdi-versosprocesos de regulacin eneldiseo de las condiciones medioambientales ptimas,ascomo enelaislamientoo manipulacin delascepasmicrobianas productoras. 1JI0W\JI" 1)1'J(,MIf(()()1\I ANISMOSDEUSOtNDUSTRti\ L7 SI NTESISy Or:OI1AOACIONocENZIMAS Laconcelllracin totaldeunenzima intracelualrparticularpresente enlas clulasvienereguladaporlasvelocidadesrelativasde sntesisy degradacino inactivacin detalenzima. Enlas clula.>,las Il'0tenas estn siendo degradada delosenzimasjlroteolticos,deforma que cada protelDa llene una Vidalumtada. Las protenas varanensususceptibilidadfrente alataqueproteottico,deformaquelasntesisneta deunenzimaseproduce cuandosuvelocidaddesntesisessuperiora ladedegradaci. EnlaFigura2.11aseilustraelmecanismogeneraldesintesisproteicade los procariotas.Unanica ARN polimerasareconocey seune a centrosADN especficosdenominados promotores, iniciando lasntesis del ARNm y la Irans-cnpeln deunopern. En elextremo delgenestructural,unaregindetermi-nacIn hace que la ARN polimerasa ceselatranscripci n y sedisocie delADN. Enlosprocariotas, muchasARNm son policistrnicas, estoes;codifican cade-naspolipeptdicasmltiples,mientras que lamayora delosARNm deloseuca-riotas son monocistrnicos.La sntesisdecada protena se iniciapor launin delosribosomasauncentroespecficodelARNmylatraduccincomienza inclusoantesdequelaARNpolimerasahayaalcanzadolasealparala terminacin.. Enalgunoscasos la transcripcinbacteriana seinicia a una velocidadcons-tante(usualmentelenta),sinregulacin,entantoqueenotrosla velocidada laqueelARNinicialasntesisestgobernadaporprotenasqueinteractan 5'3__ Transporte Ncleo ADN Citoplasma Transcripcin primaria

Prolelna nacIente Ibl Flg.2.11.Snte,isproteicaenlos procariola,(a)y eucariotas(b). 38B10TECNOLOOIADELAFERMENTAION enIlnaformaespecficaconlasregionesdelADN denominadas operones, 10-cullladas cerca de los centros promotores. Lasprotenas reguladoras que seunen 11 los operones se denominan represoras o activadoras, dependiendo de sidismi-nuyenoincrementan la velocidadde iniciacin dela transcripcin.Algunos ope-Ionesestncontroladosporprotefnas activadorasyrepresorasy enlosproca-riotas los centros promotor-operador controlanfrecuentemente latranscripcin delADN que codifica ms de una protena.Lasregulaciones dela sntesis pro-teicatienenlugarenlamayoradeloscasosmediante controldelavelocidad deiniciacindelatranscripcin,aunque aveceslaregulacinseproduceen elmomento delaterminacin de la transcripcin oenlospumos deiniciacin delatraduccin. Enla Figura 2.11b seilustra elmecanismo dela sntesis proteica en los euca-riotas.Latranscripcin seproduce en elncleo, y el ARN primario que setrans-cribesemodificaampliamenteenelncleoantesdequesalgaalcitoplasma para asociarse con losribosomas.En los eucariotas elcontrol de lasntesis pro-teicapuede ejercersealniveldelprocesadodelARN as como enla transcrip-cin oen la traduccin.En losprocariotas laregulacinenlaetapa detraduc-cinesmuypocoimportante. 13.nto enlosprocariotas como en los eucariotas, la estabilidad o vida media delARNmtambinpuedeinfluirenla velocidaddesntesisproteica.Losdis-tintosARNm tienenestabilidades diferentes, deforma que elefecto en la snte-sisproteicaglobalescomplejo. Induccin Algunos enzimasseproducensiempre encantidadessubstancialescuando laclula est creciendo,mientrasqueotrossoninducibles, esdecir,seforman nicamente enpresencia dedeterminados substratos enelmedio.Los genes es-tructurales de los enzimas inducibles sonnormalmente inactivosu operan ave-locidadesbasales>.muybajasenausencia desubstrato.Cuandoelsubstrato se encuentra presente, el gen estructural sepone en marchay se produce la trans-cripcin y la traduccin; este proceso se ilustra segn el modelo deJacob y Mo-nodpara lainduccin de la l3-galactosidasa delE.co/i (Fig.2.12).Enausencia deinductor,ungenregulador sintetiza un represorque seuneaungenopera-dor,evitandoque laARN polimerasa semuevaalolargodelADN para trans-cribir elgenestructural.Sinembargo,enpresencia delinductor,ste seune al represor,arrancndolodelgenoperadorypermitiendoquetengalugarla transcripcin. Represinporelcarabolito Este fenmenoseproduce frecuentemente cuando la clula crece en unme-dio que contiene ms de unsubstrato utilizable para elcrecimiento. En la repre-OIOLOOtADELOSMICROROANISMOSDEUSOINDUSTRIAL o Represorpollm."" e sADN EnausenciadeInductor AAN poUmerasa

lehl Represor Represor Inactivo Coninductor I ADN '. Transcripcin , AANm 1Traduccin Enzima Flg.2.12.Representacindeunsistemaenzimticoinducible. si6nporelcatabolito carbono,sesintetizanenzimasquecatabolizanelmejor substrato,usualmente glucosa,y nicmentecuando steseha agotado sepro-ducenenzimasquedescomponenelsubstratomspobre.Lainhibicindela formacinde3' -5' -adenosnmono fosfatocclico(AMPc)pareceserelfactor clave enla represin por elcata bolito en elE.coli; esle compuesto esnecesario paralasntesisdeARNm.Elmetabolismodelaglucosareduceelcontenido de AMPc de las clulas unas1.000 veces.Elnivel de AMPc depende de la adenil ciclasa y la AMPc fosfodiesterasa, que sintetizan y degradan el AMPo, respecli-vamente.La adenilciclasaparece estar inhibida poreltransporte de compues-tosdecarbonoutilizablesenlaclula.Aunquelarepresinporla glucosase produceampliamenteenloshongos,levadurasyBacillus,losmecanismosre-guladoresannosonbienconocidos. .Muchosenzimas,por ejemplo lasproleasas,sonreprimidosporla presen-cIa de ammocldos o amoniaco ulilizables rpidamente (represin del cataboli-lOnitrgeno).Lalimitacin de amoniaco en el medio de crecimiento fermenta-tivodesreprimerpidamentelasntesisdeestosenzimas. 40 BlafECNOLOOIADELA FERMENTAIN Represinfeedback Mientrasquelasintesisdeenzimascatablicosestcontroladafrecuente-mentepor induccin yrepresindecatabolitos, la biosnlesis de enzimasana-blicospuedeestarreguladaporlarepresinfeedbackproducida pOIelpro-ductofinal.la represinfeedbackseutiliza ampliamente en la naturaleza para controlar la sntesis de aminocidos, purnas, pirimidinas y vitaminas. En elmo-delo clsicoderepresinfeedback(Fig.2.13)elgen regulador produce una pro-lena apo-represora, que,combinada conun ca-represor (productofinal),seune alcentro operadory bloquealatranscripcin.Enausenciade productofinal, noseproducelarepresin. tla.2.13. _POllmerasa./ Apo-represor '--------- ""'I'!""J"Repeeso< Co-represor R

-Apo-represor Ca-represorpresente ADN pollmerasa SARN '. Transcripcin

Traduccin ARNm Sinca-represorRepresentaci6ndeunsistemaenzimticoderepresinporretroinhibicin, 11101OC 11 11 11'itlSMilIltlUltOlINISMOSDEUSOINDUSTRIAl.41 MODULI>CIONOCLAACf IVIDADt NZIMATlCA MuchosenzimastienenunoO ms centros distintosalcenlroactivo,deno minados centros alostricos,queliganreversiblemenle metabolitosparticul ares omolculasefectoras,produciendouncambio enla configuracindelenzima y por tanto aumentando o disminuyendo su actividad. Las actividades de olros enzimasestnreguladasdeformacovalente,detalmodoquelaformacino degradacin enzimtica deunenlace covalente en el enzima sirvepara activarlo oinactivarlo. Compuestos como elATP,elADP,elAMP y losnucletidos de lanicotinamida,quereflejanelniveldeenerga disponibledelasclulas,mo-dulantambinlaactividadenzimticaycontrolanelmetabolismoajustando elbalance entrelosprocesoscatablicos ylosprocesosanablicos queconsu-menenerga. REGULl>CIONDELASRUTASMETABOLlCASRAMIFICADAS Lasrutasmetablicasbiosintticas tienenfrecuentementeuna secuenciade enzima comnconramificacionesque conducen alaformacindemsde un producto final . Losmicroorganismos han desarrollado mecanismos deretroali-mentacin(feedback),porloscualeslaacumulacin delproductofinalcausa un efecto en elprimer enzima de la rama que conduce a eseproducto. Adems, existenmecanisms en losque elproductofinalde unarutaramificadaprodu-celainhibicinfeedbackparcialdelprimerenzimadelasecuencia comn de forma que elflujodesubstrato que pasa atravsde esta secuencia sevare-duciendo proporcionalmente. Este efecto se consiguea nivelbiolgico median-teelusodeisoenzimasymecanismosderegulacinfeedbackconcertados yacumulativos(Fig.2.14).Estos efectosreguladorespueden ser dedostipos: inhibicindelaactividad enzimtica"yrepresindela sntesisdeenzimas.En loscasosenlosqueestnimplicadoslosisoenzimas(mltiplesformasdeun enzima capaces decatalizar lamismareaccin),la sntesisojnhibicin decada formaenzimticapuedeestarreguladaporunproductofmaldistinto.Enla regulacin feedback concertada, nicamente est implicado un enzima, aun-que debehaber ms de unproducto queinhiba su actividad o reprima susinte-sisoEn las regulacionesfeedback acumulativas, cada producto fmal produce una inhibicin orepresinparcial y son necesarios todos losproductos finalespara bloquearcompletamentelaactividadola sntesis. AsImilacindelsubstrato/secrecindelproducto Para el rpido crecimiento celular sonnecesariosunos mecanismos eficaces de flujo deentrada de substrato y de salida de producto, as como elsuministro 42U1OTECNOLOOlADELAFERMENTACION lSOENZIMAS r..E A -::::::OS- C/, F_G --l .I ,' .. -------- ------ - , - --' CONCERTADO/'" O' A-1-t>B----+C/ 'H--------- ----./': -- ----- - -- - -- - --- - - -- - - -- --- - - - - - - ---' ACUMULADO r ------- - - - -------- -- [ :O...... ,/ At"'"' I ___ ___ ___ ______ _H: L _ __________ ____ __ ___ _____ .J Ag.2.14_Mecanismoderegulacinporretroinhibicinderutasmetabijcasramifi-cadas(reproducidoconpermisodeDernaio,1971). de substratopara su conversinenmetabolitos primarios y secundarios y otros productos,yparalaexcreccindelproducto.Enlosprocariotas,elsubstrato semuevedentroyfuerade la clula directamenteatravesandolasmembranas asociadas con laenvoltura celular.Algunasfermentacionesbacterianas hansi-domanipuladas para alterar la membrana celular ola composicin de la pared con objeto demodificar los mecanismos de entrada ofacilitarlaexcreecin (vase Capitulo 9:produccin de cidoglutmico) . Adems delamembrana plasm-ticaexterna,loseucariotastambintienenunextensosistemademembranas y orgnulos internos. Algunosmateriales sontransportados a la clula por en-docitosis,proceso enelqueunaregindelamembrana plasmt icaseinvagina for mandounavesculaquecontieneelmaterialprovenientedelexteriordela cl ula.Lavesculasefundeconotro orgnulo,unlisosomaprimario,forman-do unIisosoma secundario enelque granparte delmaterial externo esdegrada-doytransportadoalcitoplasma.Losproduclos de degradacinsealmacenan enveslculas hasta ser expulsados por exocitosis(Fig- 2.15);estas vesculas estn presentesengrannmeroenlospicesdelashifasde loshongos.Enconse-cuencia,enloseueariotas, muchosdelosprocesosdetransporte de substratos yproductos atravsdelamembranaseproducenentreelprotoplasmadela clulay orgnul os,como por ejemplolasvesculasy el reculo endoplsmico. Lossolutossontransportados atravsdelasmembranas sinmodificacin (a)por difusinpasiva afavordeungradiente deconcentracin,(b)pordi fu-0101..00 1/\DI!LOSMICROORO/\NtSMOSDEUSOINDUSTRIAl. Lisosoma Membrana plasmtica Ha.2.15.Procesodeendoyexocitosisenloseucariotas. 41 sinfacilitadaporungradiente deconcentracin,pormediodeunsistema de transporte, que,aligualquelosenzimas, presenta cinticas desat uracin,y (e) portransporteactivo,quetambinimplicaunsistema detransporte peroque permite elmovimiento delsoluto contra ungradiente electroqumico. Los solu-tostambin pueden modificarse durante la translocacin por enzimas conpro-piedadesvectoriales. Lasprotenasdetransporteespecficasparecenserresponsablesdeltrans-porte demuchos solutos a travsdelas membranas, algunosdeloscuales estn ligadosa la energa y otros son inducibles.En labiosntesis de algunosproduc-tos extracelulares microbianos elenzima biosinttico fmalpuede estar asociado a lamembrana yfuncionandofacilitala excrecin.Por ejemplo, se ha implica-doalastranslocasasenlaextrusindeexopolisacridosdelasclulas. SECRECIONDEENZIMAS Losprecariotas y eucariotas Gram-posit.ivos tienen una nica membrana plas-mtica ensusuperficie.Porelcontrario,lasparedescelularesdelasbacterias Grarn-negativastienendos membranas separadas mediante un espacio peripls-mico.Los enzimas extraeelulares, sintetizados por las bacterias Gram-positivas, sontransportados atravs delamembranacitoplsmica,difundindosepor la pared celular y acumulndose en ellquido de cultivoextracelular. Los enzimas 44DI OTENOLOOIADELAFHRM'NTAIION rXI ",celul aresoprotenassecretorassonsintetizadosporloseucariotasenla 'lI[lcrOcie delretculoendoplsmieo ytransportadosatravsdelamembrana nie,pacio dedichoretculo.Lasprotefnaseonlenidas enestosespaciosvesieu-luresseprocesanposteriormenteenelaparatodeGolgiy enotrasvesculasy ,csecretanalmedioambiente externode laclula porfusinde lasvesculas eDillamembranaplasmtica (Fig. 2.16). Laglicosilaein de lasprotenas se pro-/'----1------+---+ Espaciocisternal ExoclloslsVesfculas secretoras AparatoRetlculo deGOIgIendoplsmlco rugoso Flg.2.16.Rutadesecrecindeproteinasenloseucariotas. duce en elespacio vesiculardelretculo endoplsmicoyen loscuerpos deGol -gi.Estaruta secretorageneralparece sersimilar en loseueariotassuperioresy en las levaduras y probablemente se produzca enloshongos filamentosos, aun-quepuedenexistirvariacionesenelproceso.EnlasbacteriasGrarn-negativas muchosenzimassontransportadosatravsde lamembrana citoplsmicay se localizanenelespacioperiplsmico. Lasprotenassecretadasatravsdelasmembranascontienenusualmente unpptido amn o terminal deextensn, denominado secuencia seal. El ppti-do seal, que sobresale del ribosoma, interacciona conla superficie ms interna delamembranaplasmticadelabacteriaoconelre((culoendoplsmicode los eucariotas, formandoun poro o canal . A medida que el polipptido se elon-ga pasa a travs delporo en lamembrana, enunproceso conocido como secre-cinco-traduccional,yunapeptidasaseallocalizadaenlaparteexternade lamembranaeliminaelpptido seal,permitiendo alaprotena asumir sues-tructura tridimensional normal_Enla Figura 2.17 se muestra undiagrama acer-cadelahiptesissealpara la secrecineo-traduccional de laprotena.A1gu-OIOtOOlAUItoS MI(KIIUUOANISMOSDEUSOINOUSTRIAI 1;=:-0,92R' -_" senali =~ \ ~ a = = rdelrlbosoma Receptor~sel'\al Centro deaccin delapeptidasasenal Flg.2.17.RepresentacindelasecrecincO-lranslacional(reproducidoconpermiso dePriest,1984) . nas protenas extracelulares son secretadas despus de que han sido sintetizadas en un proceso (quetambin implica unpptido seal) conocido como secrecin post-lraduccional. Captulo3 Sistemasde fermentacin Procesoscontinuosydiscontinuos LasfermentacionespuedenLlevarse a cabomediante procesos discontinuos, discontinuosalimentados aintervalos o continuos as como porvariaciones de estosprocedimientos.Loscultivosdiscontinuos..puedenconsiderarse comoun sistema cerrado, excepto para la_aireagn.,c;:madhmirada-demedio,enelqueelinoculadopasaatravsdeunnmerodefases-;5egn se muestra en lacurva tpicadecrecimiento discontinuo (vase Fig.2.6).Mien-trasque en elcultivo discontinuotodo eLsubslralQSeaade alcomienzo dela fermentacin,enlosprocesos discontinuos alimentados elsubstrato seva aa-diendoaintervalosalolargodelproceso;estaformadetrabajoeliminalos efectos derepresinpor lasfuentesde carbonouWizablesrpidamente,reduce la viscosidaddel medio y los efectos de los constituyentes txicos, o simplemen-te,hacequelaetapa deformacindeproductosealomslargaposible.Los sistemasdecultivodiscontinuo alimentados a intervalos,ocontinuos, seutili-zan en lamayora delosprocesos defermentacinindustrial y estn particular-menteadaptados a losprocesosdefermentacinenlosqueelproducto sefor-mamayoritariamente despusdela fasedecrecimiento exponencial.La princi-pal desventaja delasfermentacionesdiscontinuas cuandQpara la pro-duccindeproductosasociadosalcrecimiento,esquelaformacineficiente de producto tiene lugar nicamente durante una fraccin del ciclo defermenta-47 48 Inoculacin BI OTECNOLOGIADEFERMENTAION Ciclodelermentacin FOnT'Ia'cln deproducto efi caz II Proouclo Tiempo Recoleccindelproducto LavadodelfermentadO! Formacindelotes Esterilizacin Inoculacin Formacin deproductoeficaz Ag.3.1.Ciclodefermentacindiscontinuo. cin_(Fig.3.1).Lossistemas continuos con volmenes desalida de producto 'ele-vados puedenser,en consecuencia, muchoms eficaces endeterminadasaplica-cionesentrminosdeproductividad delfermentador(volumendeproduccin porunidaddevolumenporunidaddetiempo,Kgm - 'h - ') . Lasfermentacio-nescontinuaspuedenconsiderarsecomounsistemaabiertoenqueelmedio sevaaadiendocontinuamentealbiorreactorysevaeliminandosimultnea-mente igual volumen demedio fermentado.Existen dos tipos principales de reac-lorescontinuos,losreactoresdemezclacompletaylosdeflujopistn. En un cultivo discontinuo, la concentracin debiomasa por unidad de tiempo (t)es: Donde x XR x- x.= Y(S. -s) concentracincelulareneltiempot inculooconcentracincel ularinicial rendimientopara el substrato limitante (g de biomasa por g desubs-tratoconsumido) s= concentracindesubstratoeneltiempot SRconcentracininicialdelmedio Portanto x - )(R r=--S.-s SISTEMASDEFERMENTACION49 Lacantidadde biomasaalcanzada enlafaseestacionaria dependelerica-mentedelaconcentracin inicialdelsubstratolimitan!edelcrecimientoy de la eficacia delorganismo para convertir elsubstrato enmaterial celular.Por tanto. suponiendoqueelsubstratolimitan tedelcrecimientoseaS= O enlafase estacionaria r=- x-XR S. Enunreactorcontinuodemezclacompletaenunasolaetapa,laadicin de substrato a unavelocidad adecuada combinada con laeliminacin a una ve-locidad volumtrica igualdemediodecultivodelrecipiente produceun estado estacionario enelquelaformacinde biomasaest enequilibrio conlaprdi-dadeclulas.Enestascondiciones: (a)Lavelocidaddecrecimiento especfico(JL)vienecontroladapor lave-locidaddedilucin(D)puestoqueJL =D (b)La concentracin desubstrato en estado estacionario, Tenelquimos-tato viene determinada por lavelocidad de dilucin, segn la ecuacin: silascinticassiguenelmodelodeManadyD < JLma, (e)La concentracin de biomasa en elestado estacionario, )( viene deter-minadaporlasvariablesoperacionalesSRyD,segnlaecuacin: x= r[s.- K,OJ _ EstasecuacionessededucendelaFigura3.2. En la Figura3.3 semuestra elefectodelavelocidad dedilucinenlascon-centracionesdesubstratoy biomasa enestadoestacionarioyen laproductivi-daddebiomasa.Como seve,amedida queD seaproximaaJLm", 'laconcen-tracinresidualdelsubstrato timitantenecesariapara soportarelaumentode velocidad de crecimiento se eleva,y por tanto la concentracin desubstrato tam-binaumenta (hasta ellmite superior s=SF)mientras que la de biomasa dis-minuye. Cuandoseemplea unsistemadecultivoen continuo,por ejemplo en elprocesodefermentacinindustrialdeproduccibdeprotenasdeorganis-mosunicelulares,lacantidad declulasproducidas porunidad detiempo(ve-locidad de produccin) y por unidad de substrato utilizado ('Y)deben ser mxi -mas.En estado estacionario,lavelocidaddeproduccin ser igualalproducto delavelocidaddeflujoporlaconcentracincelular.Paraquelaproduccin 50Ul OTECNOLOOIADELAIAllON I.uvelocidaddedilucinD(h - 1),querepresentaelflujodelmedioenelquimoslalo Imrunidaddevolumendeliquidocontenidosedefinecomo: f) = Fj J' dondeV volumen(m') F velocidaddeflujo(m'h - 1) 1:.1 cambionetodebiomasa coneltiempo, suponiendoque todas lasclulas sonviables, puedeexpresarsecomo: dx/dl= crecimiento- produccin =ILt- Dx Enestado estacionariolaconcentracinde clulas enelreactoresconstante, portanto: d.\{d/ = O x =D.\ II=D CuandoD :S;. 0,9 .umax'lavelocidaddeproduccincelular enelfermentarlorest exacta-menteequilibrada conlavelocidaddeproduccincelular,y enestadoestacionarioesta condicinsecumple(x =constante).Porotrolado,cuandoelvalordeD essimilar aldePomu'laproduccindeclulas enelefluenteessuperiora suvelocidaddeproduc-cin porcrecimientoenelfermentadory seproduceelcolapso,siendodx/ dtnegativo 1" estrelacionado conlaconcentracin desubstrato (s)medianle la ecuacindeMonod Ilm:uS 1'=--I\, +s En estadoeslacionario, lA. = D.y para el modelo cintico deManad de crecimiento celular D= J1mllllT dondeses laconcentracindesubstratoresidualenestadoestacionario Ilmlu - D comoD- J.Lmax'entoncess-SR Laconcentracindebiomasaenelquimostatoenestadoestacionarioparaelcasode unaalimentacinestril(XR oXF =O),vienedadopor x= reS. - $) portanto cuandoD-- J.Lm ,x -- O Loproductividaddebiomasa,P' paraunprocesodefermentacincontinuoenesta-doestacionariovienedadaporc:.18.3.1. delcultivocontinuo.

0 E o :o

u

n o

SIS liMASt)l'FPRMnNTACION Velocidaddedilucin(O) p' e x s, Aa3.3.lnftuenciadelavelocidaddedilucinenlasconcentracionesdebiomasa Ix) y substralo(S) enelestadoestacionarioy productividaddelabiomasa(P;J. celularseamxima,lavelocidaddedilucindeber seralta,aunquenotanto queexcedaa I"maxo seproduzca laprdida dematerial.Laproductividadm-xima,oombinando una produccin elevada conuna utilizacin de substrato efi-caz, se obtiene a una velocidad de flujoigualalamxima veloci daddeproduc cin,o ligeramenteinferior, y conlamayorconcentracin desubstrato posible prcticamenteenelflujodealimentacin. En los procesos de produccin de algunosmetabolitos primarios, sepueden adoptar medidassimilarespara optimizarlascondicionesdelquimostato. Sin embargo,enelcasodemetabolitossecundarios,enelqueelproductonova asociadoalcrecimiento,nosepuedeutilizarunnicoquimostatodemezcla perfecta, sino que debenemplearse quimostatos multietapas para permitir que prevalezcandistintas condiciones medioambientales enlasetapas separadas, si las condiciones ptimas paJaelcrecimiento y laformacin deproducto son di ferentes.los quimostatos que incorporan procesos de reciclado de biomasa oon centradaparaincrementarlaconcentracindebiomasaenelreactorhanen-contrado aplicaciones industriales enlaproduccin dealcohol y eneltratamiento deefluentes. Enlosreactoresdeflujopistn,elcultivofluyeporunreactortubularsin mezclaencontracorriente.Enlaentradadelreactorsevanaadiendoconti-nuamente lasclulasy elmedio,porloquelacomposicindelmedi o,lacon 52BIOTECNOLOGIADELAFERMENTAION debiomasa y las concentraciones de producto varan con la longitud delrcactor deunaformaanloga a loscambios ocurridos a lo largo deltiempo ell1111 fermentadordiscontinuo.Usualmentedebeincorporarseunsistemade Icricladodelabiomasaparaobtenerunineulocontinuoenlaentrada. Biscodelfermentador Lafuncinprincipaldeunfermentador esladeproporcionar un medio am-bientecontroladoquepennitaelcrecimientoeficazdelasclulasy laforma-cin de prOdUct:- EIfermentador tpico moderno de laboratorio seha diseado comounaunidad sofisticada conlascaractersticas y lainstrumentacinnece-sariaspara llevara cabounagranvariedaddeprocesosdefermentacin.A la horade discutiracercadelosfermentadorespoto,deberarecordarsequelos fermentadoresa escala duroduccin industriilsOsualmente unidades cons-truidas a medida teniendo en cuenta loscostos y objetivos esped lCOS,y disea-dasparali"procesooUa seriedeprocesosrelaciOados,y enconsecuencia, nicamentetienenlascaractersticaseinstrumentacIn especl- icadosparaun procesodeproduccinparticular.---CONDICIONESPARAOPERARENMEDIOASEPTICO Muchos biorreactores tienenquetrabajar encondiciones aspticasutilizan-douninculo puro delmicroorganismoyexcluyendolosorganismos contami-nantes; porconsiguiente, elbiorreactor, aligualquelareddetuberias asocia-das,hasido diseado comounrecipienteapresindetalformaquetantoel ,istema como elmedio que contenga puedan esterilizarse a latemperatura/ pre-sinadecuadas, unminimo de121 C/ 15psidurante15-30 minutos. Las vlvu-lasuti lizadasenlasseccionesesterilizablesdebenserutilizadasencondiciones aspticas.Lasvlvulasdeestrangulamiento ylasdediafragma son particular-mente adecuadas, puesto que su mecanismo deoperacin est separado delme-dio Ifquido o gaseoso por un tubo Oundiafragma flexible.Los puntos de entra-da alrecipienteyel proceso para aadiry eliminar gaseso lquidosal / delreac-lor durante lafermentacintambin debenestar diseilados deforma queman-tenganlas condiciones aspticas(Thbla 3.1).EnlaFigura 3.4 seilustra una vl-vulademuestreoasptica. No todos los procesos defermentacinnecesitan condiciones totalmente es-triles;enalgunossereduce simplemente sucontaminacinpor pasterizacin, mientras que otros dependen realmente de la poblacin microbiana natural, por SISI [MASDEI' [RMENMCION Tabla3_1.Diseno delfermellladory operacionesrelacionada, conel",",1Ie nimientodesueSlerilidad ComponenteoprocesoFundamenlO 1.Recipiente 2.Entraday salidaal fermentador 3.Tuberfas 4.Vlvulas 5.Prensaestopasy cojinetesdel agitador Diseftadoparaseresterilizado convaporapresin, tentea la corrosin qumica yconmateriales no txicos paraelorganismo Esterilizablesconvaporde agua Sinbolsillos o espaciosmuer-tos,inclinadashaciael puntodedrenaj e Adecuadasparaoperarasp-ticamente.Losmaterialesde construccindebenserca-pacesdetolerarlascondi -cionesdetemperaturay presindelprocesoyser resistentesaloscomponen-tesqumicosutilizados Selladosparatrabajaren condicionesaspticas prolongadas Ejemploso comentarios (a)VidriodeunespesorapTO piadoparafermentadores pequeftosymirillas (b)Aceroinoxidableresis-tenteal pHdelproceso las ....lvu1asvaranensugrado de idoneidad.Lasvlvulasde compresiny lasdediafrag-masonespecialmenteaptas parausoasptiro.pueSloque sumecanismoestseparado medianteunluboflexibley 1.Ul diafragma,respectivamen-te,delcaldoodelgasque fluye (a)Capas de asbesto ode hi-losdealgodnempaque-tadoscontraeleje (b)Cierres:forrosdemetal, las condiciones aspticas se mantienenporcontacto superficialuniformede precisin entreunforrode cierre giratorio y el estacio-nariodelejedel agitador. Enloscierresmecnicos, elcomponente estacionario y el giratorio se mantienen juntos mediante resortes o fuellesqueseexpanden (e)Dispcsitivosdeagitacin magnticosquenopene-tran endrecipiente.Uneje externohace giw alejede unagitadorinternome-dianteunafuerzamagntica 54 B10TECNOLOOlA DELAFERMENTACION 'TilMa3,1.Continuacin ComponenteoprocesoFundamento (,.Entradadegas 7.Salidadegas 8.Alimentacin deaditivos 9.Alimentacin, inculoy lneasde muestreo Filtrodeaireparaesterilizarel airequeentra.EsteriLizable convapordeagua.Vlvula de noretomosituadaentre el difusory elfUtrode airepara evitarelflujoenconLraCo Trientedelmedioa1 filtro Diseadodeformaque nose produzca lacontaminacin porflujoencontracorriente Alimentacin esterilizada por calentamientoofiltracin Esterilizablesconvaporde aguaantesydespusdesu uso Ejemplosocomen/arios (a)Lana devidrio, fibra de vi drio u otromaterial empa-quetadoqueatrapafisi-camentelasparticulas (b)Filtro de membrana plega dafabricadoconsterde celulosa, niln polisulfona uotrosmateriales Elnitrode salida puedeutili-zarsecuando no sedeseela liberacin de organismos del cultivoalmedioambiente Acido,lcali(liquidoo gaseoso),carbohidrato, ....precursor Secuenciademuestreo(vase Fig. 3.4):(a) apertura de las vlvulas2 y 3 para esterili-lar latuberfa,(b)cierrede la vlvula 3,(e)apertura de lavlvula4 paraenfriarla tuber!a estril caliente antes deintroducir la muestra, (d) cierredelavlvula4,aper-turadelavlvula1,(e) desecharelcultivodeles-paciomuerto, (Orecogerla muestra,(g)cierre de la vl-vula1,(h)repetir(a)y (b) loqueeldiseodelreactory delequiponecesariosparacadaprocesodeben simplificarsedeacuerdoconesto. AIAEACIONyMEZCLADO Elprocesode fermentacinindustrialaerobiodebedisponerdeunsistema de aireacin y mezclado delcultivo.El reactor de tipo tanque conagitacin con-vencional incluyeunsistema deagitacin mecnicoconsistente enun eje verti-cal con variosagitadores,entanto que lamayoradelos biorreactores deplatos SISTEMASDEFERMENTACION Vapordeagua 3 f-..... AlreeS1rll Fermentadorf--r>-'-_.,. 4 2 55 Fig.3.4.Puertademuestreoasptico.Losnmeros1,2Y 3 correspondenavlvulas. (Rushton) estn equipados conturbinas de discoslocalizadas a lolargodeleje y condimensionescontroladasparaconseguirunbuenmezcladoy una buena dispersina...travsdelmedio.Ademsdisponendevariosdeflectores(usual-menteentre 4 y 6)cuya anchura representaelLO "',deldimetro delrecipiente, localizadosalolargodelpermetrodelreactorconobjetodeincrementarla turbulencia.El aire estrilse introducepor labase deltanque,normalmente por unanillopulveri zador,yesdispersadoeficazmenteatravsdelmedioporla accindelsistema de agitacin.EnlaFigura3.5seesquematizanloscompo-nentesdelsistemadeagitacin. Lageometriadelosfermentadoresaireadosdebedisearsedeformaque sefacilitelaeficacia delintercambiogaseoso.Lascaractersticasfinalesdeben tenerencuentalosfenmenosdetransportequeexistenenlosprocesos biolgicos. Flujodefluidos Losfluidossedenominannewtonianos cuandosuflujoobedece a la leyde viscosidad de Newton. Supongamos que un fluido est contenido entre dos pla-casparalelas deseccinAseparadasuna distancia X;siuna placa semueveen una direccin a unavelocidad constante, lacapa de lquido adyacente a la placa queest enmovimientotam binsemover enesadireccinimpartiendo parte de sumomento a la capa ms prxima, haciendo que semueva a una velocidad ligeramente inferior.LaleydeNewtonde la viscosidad establece que lafuerza S6D1OTECNOLOGIADELAFERMEN IA( ()N Relaciones geoml !lcas lIp1cas Dellector H V 02.5- 3.0 f -- O 1 D. w A I ~ 0.25- 0.33 H i-D I L Agitadordeturbinadedi sco I ~E T ~ -h 025 Y I 4 I+-lT d.da wW y0.75 - D.5 1---d----+l ZEntradadeai re ..Enesteaparatoelairees SISTEMASDEFERMENTACION (,1 aspiradoy distribuidomedianteunrotordeturbinadecuerpohuecodenllo velocidad,conectado aunatubera desuccinde aire.Elaireador esaUloa,pi -ranteyportantonosenecesitaairecomprimido(vaseFig.7.8). Elreactordetipotanqueconagitacineselbiorreaclormsutilizadoen lasfermentacionesaireadasdebido asufiabilidadyflexibilidad.Noobstante, loscostesdemantenimientoe inversinsonrelativamenteelevados,y adems seplanteanproblemas alahora de di searagitadorespalalosfermentadores muygrandesdebidoala longitud deleje delagitador.Enlosbiorreactores sin agitacinmecnica,comolosbiorreactorestipotorreylosdebucle,laairea-cinyelmezcladosellevanacaboutilizandocaudalesdegaselevados. Enlosfermentadorestipotorre(Fig.3.7)elaireseintroduceporlabase delaparatoyelmezcladoseproduceporlasburbujasascendentes,deforma quelafuerzade cizallaquesufrenlosorganismosesmnima.Estetipodefer-menladoressehautilizadopara producircidoctrico,congrnulos deA.ni-Tubode clarlflcacin Indicador detemperatura Salida deaire ~ J " \ _Salida deliquido Dellector Entrada deaire .. . PuntodemueSl reo Ha.3.7.Fermentadorlipo torre (reproducido con permiso deKristianseny Chamber-lain,1983). (,2ulen E(;NOIOOIi\DE1 i\ H' HMI N 111< IoN Uf"YdeCandida guilliermortdii,y tambinparalaIlrouucch\1Iuevl na-Illcoholindustrialy cerveza.Comoelmezcladovertical""rclullvamcnte 111010enlosfermemadoresdetipotorre,sepuedeoperardeformaconti nua, conalimentacinporlapartebajaysalidaporlapartealta,consiguindose as!una retencindebiomasa elevada.Enlosfermentadorestipotorre no airea-dos,utilizados enlaproduccin decerveza O de alcoholindustrial, laretencin debiomasa esmxima cuandoseemplean levadurasdefermentacinconbue-naspropiedadesfloculantes. El biorreactor de bucle impulsado por aire contiene untubo interno o exter-no, a veces con deflectores, que incrementa elmezclado alforzarunflujo direc-cionalenelsenodellquido(Fig.3.8).Lafuerzaimpulsoradelacirculacin se crea por ladiferencia dedensidad (debida a diferencias en la cantidad de bur-bujas de aire dispersadas) entre las secciones de!lujo ascendente y descendente. Enelreactorde estetipodiseadoporICI,porejemplo,elaireseintroduce por labasedelfermentadory pasa ala solucinporlapresinhidrosttica de lacolumna(vaseFigs.6.1ay6.1e).Enelcaptulo6podrversequesehan utilizado conxito diseos similarespara laproduccindebiomasa apartir de organismosunicelulares.Enelcultivodecaldosmicelianosfilamentososvisco-sos para la produccin de protenas de organismosurucel ulares sehandesarro-llado sistemas deagitacin y tubo derecirculacincombinados (vase Fig.6.1f). Alc.t Aire lal :;;; o '. o oo o' o Aire Ibl Jile.3.8.Biorreactor conbucleinterno(a) y externo(b)(reproducidoconpermisode Smith,1985). Mil111 1IHMIN 1lit ION111 Enlasfcrmcnlnckll1csIlIdu,ltlub mn ,lulasdeanimalesy plantas,I1l t!.\MIS cepliblcsa ,ufrir donos lUIasIUCI L.1>decizalla quelasclula!>microbinllus, sehanaprovcchado IU$vcntaJasdelmenor efectode cizalladelosfermentadt) resagi tadosporairc. Enlossistemasdetratamientodeaguasresidualesconlodosactivadosbe han utilizado algunas variaciones deeslOStipos dereactores decultivo sumeri do.Elproceso convencionalsebasaenlaagitacinvigorosaconaireu oxige-no inyectado por difusores de burbujas, paletas, agitadores, etc.(Fig.3.9).Tam-binsehandesarrolladosistemasdecultivosumergidobasados enlosfunda-mentosdelfermentadordebucleimpulsadoporaire(Fig.3.10). Losrecientesy dramticosprogresosenelcultivodeclulasdeanimalesy enlatecnologa de hibridomas han conducido aldesarrollo denuevosproceso> de cultivo industriales para la elaboracin de productos derivados de clulas ani -males. La forma ms simple de crecimiento de clulas demamferos esenculti vosensuspensin.LamayoradelasclulasdeorigenleucmicouIinfoideo crecencomo clulasindividuales encultivosensuspensin estacionarioso agi-tados. Muchasclulasdependientesde anclajepuedenno crecerencultivosen suspensin, amenosqueseempleenprocedimientos especiales.Elmtodoms prometedorentalescasosutilizaperlasmicrotransportadoras,fabricadascon polfmeros naturales o sintticos, como soportes delasclulas.Entre losproble-masasociadosconlaproduccinagranescala declulasanimales encultivos en suspensin seincluyenlas densidades celulares limitadas conseguibles enlos sistemas de cultivoconvencionalesy lasensibilidaddelasclulasalasfuerzas de cizallas.Sehanutilizadofermentadoresagitadossuavemente deformame-cnica o por aire, as como reactores de tipos ms modernos.Laencapsulacin , Q, ". .. Incorporacin "'. r.' dearre "

...

'. ';': ....t} ,:,.,,.; :', ;',: ...:..:,! ;"w,. ' .. , ". :.J,', ".".\.\.... ... :\.'.;.

. Ha.3.9.Biorreactordelodosactivos(reproducidoconpermisodeSmith,1985). 1I1C)t heNO LOolADI>LAi'l' RMI 'N IAI 'ION Airo

- nec!. ImJuJuloUutl - """'>t--:--II 'e==-- '- Y;:;:- Salid. ;., f' ---Aireinicial tIl ' ,.\ _____II(IC l(l(loe/ Aireprocesado ,,, I IF Descendente Ascendente .:- Revesti mientodelreaClor Fig.3.10"Planta detraramiento de efluentes del tipo de pozo profundo. (Reproducido eOIlpermISOdeWheatley,1984). de clulas de hibridoma enperlas de alginato permite emplearreactores detipo tanqueconagitacin,producindose concentraciones elevadasdeclulasyan- delacpsula.Otro mtodoimplicaelusode sistemasdeper-fUSin,eqUIpadoscantubos porososy membranassemipermeablespara elsu-minIstrodenutnentesy gasesy paralaeliminacindelosproductosy delos meta bolitastxicos. Eldiseo debiorreactores destinados alcultivode clulas vegetales debete-nerencuentalascaractersticasnicasdetalesclulas:grantamao,sensibili-dadalasfuerzasdecizalla,crecimiento lento,formacindeproducto durante fasesde crecimientolentooestacionarias,y lanecesidaddequeexistaun ciertogradodecontactoclula-clulaodediferenciacinparalaproduccin de secundarios. Elcultivoensuspensin seutilizapara laproduc-Cinmdustrialdeshikonina. \ I SII MA' 1\1 ,I1Fermentacionesen slidos Lasfermemacionesensubstratosslidos,utilizadasparaelCllltivodemi -croorganismos en materiales slidos quecontieneno no una cantidad limitada de agualibre,seempleanenlaobtencindeenzimasfngicosporcultivosen superficieyenla produccindechampionesascomoenotrasaplicaciones. Lossubstratos utilizadosmscomnmentesonelsalvadodetrigo,losgranos decereal,laslegumbres,lamadera y lapaja.Losmicroorganismos quecrecen bien enlasfermentaciones ensubstratos slidos son usualmente organismos que puedentolerarunaactividaddelaguabaja(Aw). Los microorganismostienen respuestas distintasfrente a la activdad del agua, deformaquepor ejemplo, conuna Awinferiora 0,95seinhibeelcrecimiento bacteriano,entanto que losmohosy laslevaduraspuedencrecera una Awde aproximadamente 0,7.Lasfermentacionesensubstrato slidosellevanacabo dediferentesformasdependiendo de silos microorganismosutilizados sonlos indgenas O cultivos aislados puros.La elaboracin del compost para la produc-cindechampionesimplicalasactividadessucesivasdeunampliorangode poblaciones demicroorganismosindgenasque vandesdelas bacterias mesoff-licas,laslevaduras ylosmohos hasta loshongos termofilicos y losactinornice-tos.Elprocesotradicional Kojipara la fermentacin de granos y habas de soja y losprocesossimilaresparalaproduccin de enzimas industriales apartirde mohos, ambosconcultivosdeAspergilllls oryzaey especiesrelacionadas,son ejemplos defermentaciones ensubstratos slidos que utilizancultivosfngicos puros. Puesto que lamayora de lasfermentaciones ensubstratos slidos son aero-bias,lascondiciones defermentacindebendisearse deformaquelatransfe-renciade oxigenoy la eliminacindeC02 delsubstratoseaneficaces.Debido a las elevadas concentraciones de substrato por unidadde volumen,el calor ge-nerado tambin por unidaddevolumendurante lafermentacin esusualmente muchomayorque enlasfermentacionesliquidas, yel contenido menor dehu-medadhace ms difcil su eliminacin. La eleccindel tamao departcula del substrato esdeimportancia criticapara optimizarlosespaciosvacosinterpar-tculasquefacilitenlatransferencia degasesy decalor.Laeliminacindeca-lorpuedeversefacilitadaincrementando lavelocidadde aireacin delsistema. Entre lasventajasdelos sistemasdefermentacinsobresubstratos slidos enlasfermentaciones industrialesseencuentran lamayor productividad y sim-plicidaddela tcnica,losmenorescostos deinversin,la reduccindelconsu-mo energtico,elmenor volumen de aguasresidualesproducidas ylaausencia deproblemasdebidosala formacinde espuma, aunque tambintienenlimi-taciones,como laacumulacin decalor,lacontaminacin bacteriana, lospro 66fllOTECNOI.OOIADELAI ERMLNI\lION deaumentodeescalay ladificultaddecontrolar elni vddehUllledad del,ubstralo. 01110ejemplos dediseodefermenladoresconsubslratosslidos sepue-den cilarlossistemasde agitacincontinualenta(comolostamboresrotato-,;os),lossistemasdecubelasylosdeflujodeaire,enlosqueseinsuflaaire acondicionado alolargo dellecho de substrato enunacmara decultivo (Fig. 3.11).Lostamboresrotatorios estnequipadosusualmenteconuna entraday unasalidaparalacirculacin de airehumidificado y confrecuenciacontienen deflectoresoseccionespara agitarelcontenido.Losfermentadoresdecubetas tienencapasdesubstrato de1-2pulgadasde espesor apiladasencmarasque generalmente estn ventiladas conairehumidificado.Enlascmaras decultivo o ',' .. . , ' ,... .. ' ',:". '.:'.. ,:>' ' . ' 1,1 Salida_ dealfe OelleCIOI JJ) Entradade aire ____ humidificadoC==========..J lel Entradadeaire humidi fi cado Salida deaire -:

910TI!CNOI..OOI/\DI! 1. /\'' KMI ,N lA(ION ,;;.n oor. ce =--ie-;.....:;: .....: ....: ...,:::::a;eo':'j

oco,;"')....,.o 6UTIIIZADASENI'ERMENTACION 87 presin compl eta de unafuncin diferenciada.La diferenciacinimplica usuul -menteelcesedelaproliferacin. El empleodemediosqumicamentedefinidos,omedios sinsuero,permite a 105cientficos investigar los procesos encultivos celulares con elmnimo posi-bledeinfluencias extraas yfacilitaelaislamiento ypurificacin deproductos provenientes del cultivo de clulas de mamferos.Los medios libres de suero de-bentenerloscomponentesdelsueronecesariospara el cultivo,y satisfacerlas principalesfuncionesmostradasenlaTabla4.3.Adaptandolasclulasdesde medios de crecimientomnimos amedioscomplejosformuladospuede substi-tuirselacontribucin nutricional del suero.Lacombinacin de factoresde cre-cimientonecesariospara el culti vode clulasdemamferostiendea serespec-ficadecadaclula. EnlaThbla4.6 se da unalistageneraldefactoresdecreci-miento que pueden ser probados a la hra de ccnfeccionar elmedio libre de suero. Mediosdecultivoparaelcrecimientodeclulasvegetales La mayoradelosmedios de cultivode clulas vegetales tienenunacompo-sicinqumicadefinida,consistenteenunafuentedecarbonoorgnico,una fuentedenitrgeno,salesinorgnicasy reguladores delcrecimiento.Lafuente Tabl a4.6.Factores decrecimiento seleccionadospara posibleusoenmedios libresdesuero Factorestimulantedelaformacinde colonias(CSF) Estradiol Factor de crecimiento epidrmico (EGF) Factordecrecimientodelosfibroblas-tos(FGF) Fibronectina Hormonadecrecimiento Hemina Hidroconisona Insulina Factordecrecimientonervioso(NGF) FosfoHpidos Factordecrecimientoderivadodelas plaquetas(PDGF) Prolactina Prostaglandinas Acidoretinoico Selenio Albminasrica Somatomedina FactordecrecimientodelasclulasT Factordecrecimientotransforman te (TOF) lfansferrina Triyodotironina 881l10TECNOLOOIAD ~ LAFFRMrNMlllIN de carbono msutilizada eslasacarosa aunque lambinpueden c",ple",," ue ifugacindependedeltal11Uliodel o"SIIl, h 010y delcaudalrequerido,yenmuchoscasoshayquecompensarlacri enela de laseparacinfrenlealcaudal.Lascenlrfugasutilizadasenlasfermentado nesagranescalaconrecuperacinde slidostienenque sercont inuasy deben disponerdeunmecanismodedescargadeslidos.Porejemplolastoberasde descarga sonadecuadasparalarecuperacindelevadurasybacterias,aunque tiendena atascarseconlosmiceliosfngicosoconmaterialescuyotamaode partcula seagrande;lascentrfugas queexpulsan slidos (Fig.5.3),conmeca-nismos de descarga de slidos continuos o intermitentes, pueden ulilizarse para larecuperacin de biomasa bacteriana omiceliana;la centrfuga de tornHf o de-cantador(Fig.5.4),queesadecuadaparaeliminaraguademateriales slidos gruesos aconcentraciones elevadas de slidos,ha sido utilizadapara larecupe-racindelevadurasyhongos. Losfiltrosdeplacas(Fig.5.5)sonbaratosyverstil espuestoqueelrea superficialpuede ajustarsevariandoelnmero deplacas,aunquenosonade-cuados para la eliminacin degrandes cantidades de slidos deloscaldospues-toquelasplacasdebendesmonlarseparapoderprocederasurecuperacin. SOlidosgranulados Puertadel recipiente Descarga deslidos Fil.5.3.Centrifuga de descarga deslidos(reproducido con permisodeBailey y Ollis, 1986). Descalga I de"quldos t BIOTECNOLDGlADELAFERME!NTA('ICl N I ....- -----r J I1 \ Descarga deslidos 1 1 " __ i-' .,' ..'. < Entrada delapasta t Flg,5.4.Centrifuga decantadora delomillo (reproducida conpermiso dePenwaltCoro poration.Sharples-StokesDivision,Pa.). Entrada delamezcla Cabeza Salidadel filt rado Fil.5,5,Conjuntodeplacasyfiltros(reproducidoconpermisodeBlackieandSon Limited,GlasgowandLondon,1971). PROCESADODELACORRt ENT 'DESAlIDA Seutili zanampli amente como disposilivos delimpiezafinal paracl imillurCIIII tidadesbajas de slidos residualesdeloscaldos decultivoodeotrosliquidm Los filtrosrotatorios devacio(Fig.5,6) seutilizanmuchoparaclarificar grall desvolmenesdelquido con descargaautomtica de slidos.La acumul acilI de finoso desuspensiones gelatinosas debacterias u otras materiales enlosIil trospuedehacermslentalafillracinoinclusollegarabloquearl a,por10 queesunaprcticacomnelempleodeauxiliaresdefiltracinquemejoren laporosidaddelatortadefiltracin;estosauxiliarespuedenincorporarse31 mtro enforma de precapa o puedenmezclarse con elcaldo de cultivo. LamInI cincon flujotangencial(flujo cruzado) es unmtodo efectivopara la separa cin declulasapartirdeliquidasenlosprocesosqueestnimplicadospro duetosdealtovalor,yaqueelmovimientoparalelodelfluidoconrespectoa lamembranaayudaareducirelespesordelacapa declulasdelasuperficie delfiltro(Fig.5.7).Lavelocidaddeflujodefiltracinvienecontroladausual -menteporlaresistenciaofrecidaporestacapadeclulas,msqueporlade lapropiamembrana. Enla Thbla5.3seresumenlosprocesosmsimportantesdedisrupcin de clulasmicrobianas, Enlamayoradeloscasos seutilizanmtodos mecnicos Salida AnUlode la\l alvula automticaestaclonarta "r-".""nodecinta allamborNiveldelmaterIa! alIIuer Flg.5.6.Filtro devaciorotalorio.Lassecciones1-4sonlasfiltrantes,las512 sonlas de desaguado;latortadefiltracinse descargaenla seccin13(reproducido conpermi sodeAmetek,[nc.). UI01 LCNOLOOIA0[; 1 AF!:RMI 'N IAI1"'" O P " " I ~ >e PROC'I:.SMl{l1)11 1 /1. '11190 "lo),loquehace que sutransporte seaprohibiti-vo.Aunquelamayoradelosorganismosnoutilizanlactosa comofuentede carbono, laslevadurasKluyveromyces fragilis crecenfcilmente eneste carbo-hidratoporloquesehanconstruidoplantasdefermentacindestinadasala PRODUCCIONDI'OIOMASA11 1 produccin deprotenas de organi smos unicelulares para alimentacinhUm:U11I o animalutilizando este microorganismo.Algunas de estasplantas han,ido di seadas para producir tantoprotenas deorganismosunicelulares como elUl1ol , enfuncindelademandadelmercado. ElprocesoSymbadiseadoenSueciaparaproducirprotenasdeorgani\ masunicelularesapartir dealmidndepatatautilizados cepasdelevadura,. LosSaccharomycopsis fibuligeraproducenlosenzimasnecesariosparalade-gradacin delalmidn y permiten elca-crecimiento deCandida utilis.Elproce-sodeproduccin,destinadoalaproduccindealimentosparaanimales,fue diseadoparaaprovecharlosdesechosdelprocesadodelapatata,aunquese plantearon problemas debido a lafaltadecontinuidad enelsuministro de subs-trato.La glucosadecalidad alimentariafueelsubstrato elegidoporRankHo-visMcDougall para laproduccin deprotenas de organismos unicelulares fn-gicasutilizandoFusarium graminearum.Laestrategia adoptadafuelade tener en cuenta adicionalmente laventaja querepresentabaelcontenido de fibrami -celiana para producir un rango de productos de alto valor aadido entre los que seincluansucedneosdelacarneparaconsumohumano. Elprocesooriginaldefermentacindealcanospara laproduccindepro-tenasdeorganismosunicelulares,desarrolladoporBPensurefineriadeLa-verna,Francia,utilizabael10-20"lodelascerascontenidasenelgas-oil.Los costos del substrato eranmuybajos,por estar enformabruta, aunque senece-sitaba unproceso deextraccin exhaustivopara eliminar delaslevaduras elolor agas-oily losposiblescarcingenos.Thmbinexistauna ciertatendenciaa1:1contaminacinmicrobianadebidoalanaturaleza noaspticadelproceso.Es-tos inconvenientes hicieron que secerrara laplanta en1975.Todas estas desven-tajasjunto conelempleodegas-oi!brutoy decondicionesdenoasepsiafue-rontenidasencuentaporltalproteine,una jointventureentreBPy ANIC. Elproceso empleaba n-parafinas purificadas que eranutilizadas completanlen-te por las clulas,simplificando larecuperacin de lasprotenas de organismos unicelulares.Sinembargo,laplanta,de100.000Tm/ aodecapacidad,cons-truidaatalefectoenCerdea en1976,nuncafueautorizada aoperarcomer-cialmente. Las compaas japonesas Dainippon y Kanegufuchi, que trabajaban en lneassimilares a ladeltalproteine,fueronganando espacio enJapn alser susproductosaceptadosparalaalimentacinanimal,aunqueladecisinini -cialfuerevocadaacausa deunafuertecampaa delosconsumidoresbasada en eltemordelapresencia deresiduoscarcinognicos.Liquichimia obtuvola patente delprocesoKangufuchienItalia, construyendouna planta de100.000 Tm/ ao de capacidad,quenofueautorizada,aligualque laplantadeCerde-a.Seha indicado que enRumanaexiste una planta, diseada por Dainippon, queempleaCandidapichia. 114 ElmetanofueconsideradoinicialmcnlccomoI11l1tCllaprllllllp:ll t1 lapro-duccindeprotenas de organismosunicelularesyaque.,1 ungn,.lospro-blemas depurificacin despus de la fermentacin eranmini mas.Las desventa-jas asociadas conlos procesosbasados enelmetano estnrelacionadas con los mayoresrequerimientos de oxgenonecesariosparaoxidartotalmente elmeta-nocomparadoconlasparafinas,labajasolubilidaddelmetanoenelaguay elhechodequelaplantadefermentacindebeestarconstruIda pruebade fuego,puestoquelamezclametano-oxgenoesaltamenteexplOSIva.Smen;-bargo,elmetanosetransformafcilmenteenmetanol,QuenecesIta menos genoymenosenfriamiento enelfermentador,esmuysolubleenaguay tIene unosriesgos deexplosinmnimos.LalCI, quemanufacLU:ametanol gran-descantidades,ha escogidoestesubstratoparalaprodUCCInde de organismosunicelulares destinadasa alimentacin animal.LacompaIa had-seadounfermentadorconpresurizaci6nnomecnicaqueuuhzaalTetanto para la agitacin como para la aireacin en elfermentadorasptico aerobio sim-plems grande delmundo, de 3.000 mJ de capacidad. Elproceso, capaz depro-ducir 50-60.000 Tm/ao deproteinas de organismos unicelulares con Melhylo-phi/us melhylotrophus, estuvo enfuncionamiento en1979-80,aunque fue vcti-ma deldramtico incremento delprecio del metano\.Las dflcultades econmI-cas deICI conelprocesodestinadoa la alimentacin animaly lasmayores es-peranzas comerciales delproceso FusariumRHM condujeron a un,a Jomt ven-tureentre estascompaas en1983conobjeto de producIrprotemas de.orga-nismosunicelulares apartir deFusariumenlagranplantadefermentacInde lC\.Eletanol,cuyasventajascomosubstrato sonsimilares alasdel fueutilizadocomo substrato porPure Culture Productspara laprodUCCInde protenas de calidadalimentariaapartir deetanoldegradoalimentarioutili-zandoCandida uli/is en1975.Asimismo, la rentabilidad delprocesoseresm!.t tambincomoresultadodelincrementodeloscostosdeletano\. RENTABILIDADDELAPRDDUCCIONDEPROfEINASDEORGANISMOSUNICELULARES Lafilosofainicial de compaas como BPe ICIpara la produccin depro-tenasde organismos unicelulares era ladeobtener,abajo costo,protenasde altovalorapartir delpetrleo,para seraadidasalosalimentos industriales, como substitutos de los aditivosproteicosimportados,por ejemplolaharma m-tegralde soja.Losfactoresque contribuyerona la cada de las protenas de .or-ganismosunicelulares derivadas dehidrocarburosy que tuvIeronu.nmayorIm-pacto comercialfueron,en1973,eldramticoincremento delprecLOdelcrudo, queelevloscostosdeenergay demateriaprima,elincrementoparaleloen los costoS de produccin de lasplantas y elmenor incremento de precIos expen-1'll!lllI ll lIONIIrIIIOMASA li S mentadoporlo;producl O'tI!I (coltl ',po,' ejemplolasoja,conrespeclotilos industriales.Sisetieneencucmaquelospreciosde)crudoseincrementnroll enunfactor de seis en1973y que elcosto del substrato para elproceso de obten-cindeprotenasdeorganismosuniceluJaresrepresentadel40al6007.delo; costostotalesdefabricacin,sepuede comprender elimpactonegativosobre los procesos de produccin de estasprotenas a partir dehidrocarburos. Laagri -cultura,principalcompetidor deprotenasdeorganismosunicelularesparala alimentacin animal, tieneuna grancapacidadpara responderalas demandas delmercadomanteniendo laestabilidaddelosprecios.Ademsdeloscultivos convencionales destinados a laalimentacin animal,como por ejemplo lasoja, otros productos ricos en protenas como loscacahuetes, semillas de colza, semi-llas de algodn y habas aladas vanganando una parte de este mercado mientras quelaexpansin delaproduccin de gasohol a partirdemazhasuministrado nuevasfuentes de subproductos destinados ala alimentacin animal. Enconse-cuencia, larentabilidad delasprotenas deorganismosunicelularesdestinadas a laalimentacinanimalno es excesivamenteatractivapor loqueseestnbus-cando productosdemayorvalor,RankHovisMcDougally PureCulturePro-ducts adoptaronuna estrategia diferente y dirigieron susproductos hacia elmer-cado dela alimentacinhumana. En particular RHMaprovechlaventajade los componentesfibrososdeloshongosparaproducirsucedneos de carne de alto valor aadido conun alto porcentaje defibray un5007.deprotenas, ade-ms deotras ventajas apreciables, como subajo contenido ensodioyen grasa. Losprincipalesfactoreseconmicos queinfluyenenlaproduccindepro-tenasde organismos unicelulares sonlaproductividad, elrendimiento y elpre-cio de venta.Enla Tabla 6.1seresumen laproductividad y elrendimiento obte-nidos enlaproduccindeprotenasdeorganismosunicelularesutilizandodi-versas combinaciones organismo/ substrato.Elpesosecodeclulasy losfacto-resde dilucinsonusualmente de15-30Kgm -, y 0,1-0,4h - , respectivamente, conunaproductividad(pesodeclulasobtenidoporunidaddevolumenpor unidad de tiempo) de1,5-12Kgm - ,h -', Aunque la productividad est limita-dafrecuentementeporlasvelocidadesdetransferencia deoxgeno y porlaefi-caciaenelenfriamientodelfermentadordebidoalmetabolismoexotrmico losvaloresmsnormalesestncomprendidosentre3 y 5 Kgm - 'h -',elcosto delsubstratorepresentaunagranproporcin delcosto defabricacin de la mayora de losproductos deprotenas de organismos unicelulares, es esen-cialque elrendimientocelular(pesode clulasproducido porunidaddepeso de substrato utilizado) sea elevadoy la formacin de subproductos sea mnima. ELECCIONDELMICROORGANISMO Loscriteriosclaveutilizadosparalaeleccin decepasdestinadasalapro-duccindeprotenasdeorganismosunicelularessonlossiguientes: 116BIOTbCNOLOGtADELAFERMLNTAltON (1)Los substratos necesarios comofuentede carbono, energa y nitrgeno ylanecesidaddesuplementosnutritivos. (2)Velocidades decrecimiento especifico,productividady rendimientos ele-vadosconunsubstratodado. (3)ToleranciadepHytemperatura. (4)Necesidadesdeaireacinyriesgosdeformacindeespumas. (5)Morfologadelcrecimientoenelfermemador. (6)Seguridadynopatogenicidad,ausenciadeproductostxicos. (7)Facilidadderecuperacindelasprotenas deorganismosunicelulares. (8)Composicinproteica,contenidodeRNAyvalornutricionaldel producto. (9)Propiedadesestructuralesdelproductofinal. Engeneral,loshongostienenlacapacidaddedegradarunampliorango de productos vegetales complejos, particularmente lospolisacridos de lasplan-tas, y toleran pHs bajos, contribuyendo a reducir lasinfecciones en elfermenta-dor.Elcrecimiento deloshongosenformadefilamemosCarlosaltamente ra-mificados envezdecomo grnulos esesencialala hora de optimizar laveloci-daddecrecimiento;sin embargo,estamorfologafilamentosaproduce caldos defermentacinreolgicamentemscomplejos,quesondifici lesdeairear. Generalmente,lasbacteriascrecenavelocidadesmsrpidasqueloshon-gosya mayorestemperaturas,por loquereducenlas exigencias de enfriamien-todelfermentador.Lasfermentacionesconbacteriasy levadurassonmucho msfcilesdeairear,peroalcontrario queloshongos,que serecuperanfcil-menteporfiltracin,lasbacteriasy laslevadurasrequierenelusodetcnicas desedimentacin,incluyendolacentrifugacin. Usualmente los productosbacterianostienenunacomposicinproteica ms favorablequelaslevaduraso loshongos. Elcontenido proteico delasbacterias est comprendido entre el60 y el65'70,mientras que elde los hongos utilizados paralaproduccindebiomasa y el delaslevadurasest comprendidoentreel 33 y el45%.Sinembargo, junto conlosmayores nivelesproteicos bacterianos, tambin existe unnivelmayordel15 al25% de RNA indesable nutricionalmente. Losmicroorganismosutilizadosenlaproduccindeprotenasdeorganis-mosunicelularesdebensersegurosy aptosparaconsumoalimentario;node-benserpatgenos y tampocoformartoxinas,debenserestablesgenticamente de formaquesemantenganlascepasconcaractersticasfisiolgicasy bioqu-micasptimasdurante elprocesoa travs de cientosde generaciones.Adems, las institucionesresponsables consideran que la degeneracindelascepaspue-dedesembocarenlaproduccindeuna cepa concaractersticasnutricionales indeseables. PfU IUt Jt(IONI>PIJIOMASA :"1,. ....

> oce If"l l..'"': lcriorlllcllte a co, conproduccin de energla. 1 "h)hMelhylophilus,elformaJdch/doseasimila por lavadelaribulosa mo-",,/o;fato y seconvierte finalmente enfructosa-6-fosfato (Fig.6.4). Las clulas ,lecuperanpor aglomeracinseguida decentrifugacin,secadoinstantneo Iflluracin.Enelprocesosereciclaelaguadelfermentador. In laFigura6.5seilustra elprocesodeproduccindebiomasaoalcohol 1I1,ulllnte elcrecimientodeK.fragilis enlactosuero,que contieneaproximada-""' lileUI15OJo delactosa,0,8OJo deprotenas,0,7%demineralesy 0,2-0,6OJod,tleidolctico,y quepuederequerir lasuplementacinconbiolina.Lapro-d,,,;cin de biomasa necesitaunproceso de fermentacinaerobiomientras que p"mlade etanolla aireacin esmnima.Para labiomasa de calidad a1imenta-'l.' puede recuperarse todo el producto fermentado, que contiene levaduras, pro-II'I""Lcepasnicasy entoncesla . !fiabi lidaddesuactividadrepresentunserioproblema.Entrelasmedidas IIIInadasparacontrolarlacontaminacinporbacterifagosseencuentranla ll'Iragacin asptica de los starten>, la limpieza delequipo utilizado en laela-h", acindelQueso,elempleo detinascerradasy elaconamiento delost iem-pUl,.uemaduracin,aunqueestasprecaucionesfueroninsuficientes pararesol -,Ielprobl