OSGRADOEN CIENCIAS · DE TRANSCRITOS EN LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DE MUSA cv. AAA, MEDIANTE...
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CICY • S OSGRADOEN CIENCIAS ( BIOLÓGICAS Centro de Investigación Científica de Yucatán, A. C. Posgrado en Ciencias Biológicas POLIMORFISMO DE TRANSCRITOS EN LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DE MUSA cv. AAA, MEDIANTE cDNA-SRAP Tesis que presenta JORGE MANUEL ITZA CAN En opción al título de MAESTRO EN CIENCIAS (Ciencias Biológicas: Opción Bioquímica y Biología Molecular) Mérida, Yucatán, México 2011
Transcript of OSGRADOEN CIENCIAS · DE TRANSCRITOS EN LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DE MUSA cv. AAA, MEDIANTE...
~ ~
CICY
•
SOSGRADOEN
CIENCIAS ( BIOLÓGICAS
Centro de Investigación Científica de Yucatán , A.C.
Posgrado en Ciencias Biológicas
POLIMORFISMO DE TRANSCRITOS EN LA
EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DE MUSA cv. AAA,
MEDIANTE cDNA-SRAP
Tesis que presenta
JORGE MANUEL ITZA CAN
En opción al título de
MAESTRO EN CIENCIAS
(Ciencias Biológicas: Opción Bioquímica y Biología Molecular)
Mérida, Yucatán, México
2011
•
CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA DE YUCATÁN, A. C.
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
CICY
RECONOCIMIENTO
POSGRADO EN
CIENCIAS
/
Por medio de la presente, hago constar que el trabajo de tesis titulado POLIMORFISMO
DE TRANSCRITOS EN LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DE MUSA cv. AAA,
MEDIANTE cDNA-SRAP fue realizado en los laboratorios de la Unidad de Bioquímica y
Biología Molecular de Plantas del Centro de Investigación Científica de Yucatán , A.C. bajo
la dirección de la Dra. Rosa María Escobedo Gracia-Medrana, dentro de la opción de
Bioquímica y Biología Molecular de Plantas, perteneciente al Programa de Posgrado en
Ciencias Biológicas de este Centro.
Atentamente,
Dr. Osear A. Moreno Valenzuela
Director Académico
Mérida, Yucatán, México, 12 octubre 2011 .
•
DECLARACIÓN DE PROPIEDAD
Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos
Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las
actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó para
desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación
Científica de Yucatán , A.C., y que a razón de lo anterior y en contraprestación de los
servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados, dicha información, en términos
de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, le pertenece
patrimonialmente a dicho Centro de Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya
manifestado, reconozco que de igual manera los productos intelectuales o desarrollos
tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo correspondiente a dicha información, le
pertenecen patrimonialmente al Centro de Investigación Científica, A.C ., y en el mismo
tenor, reconozco que si derivaren de este trabajo productos intelectuales o desarrollos
tecnológicos, en lo especial, estos se regirán en todo caso por lo dispuesto por la Ley
Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, en el tenor de lo
expuesto en la presente Declaración.
•
Este trabajo se llevó a cabo en la Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas
del Centro de Investigación Científica de Yucatán , y forma parte de los proyectos titulados
ESTUDIO DE LA EMBRIOGÉNESIS EN Musa acuminata Colla: UN ENFOQUE DE
GENÓMICA FUNCIONAL, y APLICACIÓN DE LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA EN
VARIEDADES DE PLÁTANO DE INTERÉS AGRONÓMICO COMO UNA HERRAMIENTA
PARA SU MEJORAMIENTO GENÉTICO, bajo la dirección del Dra. Rosa María Escobedo
Gracia-Medrana.
..
AGRADECIMIENTOS
Al Centro de Investigación Científica de Yucatán (CICY) en especial a la Unidad de
Bioquímica y Biología Molecular de Plantas por proporcionar las instalaciones y el equipo
necesario para el desarrollo de este trabajo, así como al Programa del Posgrado en
Ciencias Biológicas por el apoyo en la educación brindada.
Al CONACYT por la beca otorgada No. 228289
A mi asesora la Dra. Rosa María Escobedo Gracia-Medrana, por la enseñanza y apoyo
que me brindo durante la realización de este trabajo.
Al comité de Tutora! integrado por la Dra. Elizabeth de la Luz Ortiz Vázquez, Dra. Renata
Rivera Madrid y Dra. Rosa María Escobedo G-M, por sus importantes observaciones a
este trabajo durante los 4 exámenes tutórales.
Al comité de evaluación de examen de maestría integrados por la Dra. Elizabeth de la luz
Ortiz Vázquez, Dra. Renata Rivera Madrid, el Dr. Felipe Sánchez Teyer, Dr. Rafael Rojas
Herrera, y la Dr. Rosa Ma. Escobedo G-M.
Al Dr. Muhammad Ahmad Almolakab Belkhirshy Muhammad Yossef, por su apoyo
técnico, consejos y recomendaciones.
A la Dra. Ruby A. Valdez Ojeda, por sus consejos y recomendaciones brindados.
Al M.C. José Roberto Ku Cauich, técnico del laboratorio 22 de la Unidad de Bioquímica y
Biología Molecular de Plantas, por el apoyo técnico.
Al técnico de laboratorio IQI. Wilma A. Gonzáles Kantun por su ayuda durante la
realización de este trabajo.
A la auxiliar del laboratorio QBB. Martha J. Burgos Tan, por su ayuda y consejos
brindados.
Al CONACYT por el apoyo económico brindado a lo largo de la realización de este
trabajo.
A todos mis compañeros y amigos de laboratorio.
•
DEDICATORIAS
A DIOS, dueño y luz de mi vida.
A mi familia por su compresión, cariño, y consejos, los cuales me han permitido llegar
hasta este momento tan importante de mi vida, muchas gracias.
•
ÍNDICE
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE CUADROS
RESUMEN
ABSTRACT
INTRODUCCIÓN
CAPITULO 1: ANTECEDENTES GENERALES
1.1 GÉNERO: MUSA
1.1 .1 TAXONOMÍA DE MUSA
1.1.2 BOTÁNICA MUSAssp.
1.1 .3 MUSA spp.
1.1.4 TAMAÑO DEL GENOMA DE MUSA
1.1.5 IMPORTANCIA ECONÓMICA
1.2 EMBRIOGÉNESIS
1.2.1 EMBRIOGÉNESIS CIGÓTICA
1.2.2 EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA
1.2.3 EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DE MUSA
1.2.4 EXPRESIÓN DE GENES DURANTE LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA
1.3 LA TÉCNICA cDNA-SRAP Y EL ANÁLISIS FUNCIONAL
1.3.1 POLIMORFISMO AMPLIFICADO DE SECUENCIAS RELACIONADAS
(SRAP)
1.3.2 CARACTERISTICA DE LOS CEBADORES SRAP
1.3.3 AMPLIFICACIÓN DE DNA
1.4 SÍNTESIS DE cONA
1.4.1 ACTIVIDAD CATAlÍTICA DE LA RT
HIPOTESIS
OBJETIVOS
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
Índice
iv
V
1
3
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9
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11
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13
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15
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20
20
21
22
23
23
25
25
26
•
Índice
1.5 BIBLIOGRAFIA 27
CAPITULO 11: MATERIALES Y MÉTODOS: AMPLIFICACIÓN DE cDNA-SRAP 39
2.1 MATERIAL BIOLÓGICO 39
2.1.1 PROLIFERACIÓN DE CALLO EMBRIOGÉNICO 40
2.2 SÍNTESIS DE cONA MEDIANTE LA TRANSCRIPCIÓN INVERSA DE 41
POLIMERASA (RT -PCR)
2.2.1 EXTRACCIÓN DE RNA 41
2.2.2 TRANSCRIPCIÓN INVERSA DE POLIMERASA 42
2.2.3 REACCIÓN DE SÍNTESIS DE cONA 42
2.3 AMPLIFICACIÓN DE FRAGMENTO DEL GEN rRNA 18S A PARTIR DE cONA 43
2.4 REACCIÓN PARA OBTENCIÓN DE cNDA-SRAP 43
2.5 ELECTROFORESIS EN GEL DE ACRILAMIDA 6% DESNATURALIZANTE 44
2.6 ANÁLISIS DE cDNA-SRAP 44
2.7 BIBLIOGRÁFIA 46
CAPITULO 111: RESULTADOS Y DISCUSIÓN DEL POLIMORFISMO DE 49
TRANSCRITOS MEDIANTE cDNA-SRAP
3.1 INDUCCIÓN DE CALLO EMBRIOGÉNICO Y AISLAMIENTO DE EMBRIONES 49
CIGOTICOS
3.2 EXTRACCIÓN DE RNA TOTAL
3.3 SÍNTESIS DE cONA POR TRANSCRIPCIÓN INVERSA (RT)
3.4 AMPLIFICACION DE cONA PARA GEN CONSTITUTIVO 18'S
3.5 AMPLIFIFCACION DE cDNA-SRAP
3.6 TRANSCRITOS EXPRESADOS DIFERENCIALMENTE CON cDNA-SRAP
3.7 ANÁLISIS DE BANDAS CANDIDATAS PARA SECUENCIACIÓN
3.8 DIVERSIDAD GENÉTICA DE TEJIDOS EMBRIOGÉNICOS DE MUSA spp.
3.9 CONCLUSIONES
3.10 PERSPECTIVAS
3.11 BIBLIOGRÁFIA
50
51
52
53
60
62
64
67
68
69
¡¡
ANEXO 1
ANEXO 2
ANEXO 3
ANEXO 4
ANEXO 5
•
Índice
73
75
77
79
81
¡¡¡
..
Lista de figuras
LISTA DE FIGURAS
1.1 DISTRIBUCIÓN DE LA SECCIÓN DE Musa 10
1.2 DIAGRAMA DE LA TAXONOMÍA DE Musa 11
1.3 COMPARACIÓN ENTRE EL PROCESO DE EMBRIOGÉNESIS CIGÓTICA Y 17
SOMÁTICA, Zimmerman, 1993.
14 CONSTRUCCIÓN DE CEBADORES SRAP 22
1.5 REPRESENTACIÓN DE LA SÍNTESIS DE cONA UTILIZANDO Oligo dT. 24
1.6 REPRESENTACIÓN DE LA SÍNTESIS DE cONA UTILIZANDO RANDOM 24
PRIMERS.
1.7 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
3.1 PROLIFERACIÓN DE CALLO EMBRIOGÉNICO
3.2 EXTRACCIÓN DE RNA TOTAL
3.3 AMPLIFICACIÓN DE cDNA-18'S
34 AMPLIFICACIÓN DE cDNA.SRAP
3.5 ELECTROFORESIS DE cDNA-SRAP, DE TEJIDOS EMBRIOGÉNICOS DE
Musa spp
3.6 SELECCIÓN DE PARES DE CEBADORES SRAP
3.7 PATRONES DE EXPRESIÓN DE TRANSCRITOS, cDNA-SARP, DE
DIFERENTE TEJIDO EMBRIOGÉNICO DE Musa
3.8 BANDAS CANDIDATAS PARA SECUENCIACIÓN
3.9 DENDOGRAMA PRESENTANDO cDNA's DE LOS TEJIDOS
EMBRIOGÉNICOS SINTETIZADOS CON ODT
3.10 DENDOGRAMA PRESENTANDO cDNA's DE LOS TEJIDOS
EMBRIOGÉNICOS SINTETIZADOS CON RP
3.11 DENDOGRAMA DE cDNA's DE TEJIDOS NO-EMBRIOGÉNICO (HOJA),
EMBRIOGÉNICO Y EC EMBRIÓN CIGÓTICO
26
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51
52
54
55
58
59
63
65
65
66
iv
•
Lista de cuadros
LISTA DE CUADROS
2.1. SECUENCIAS DE CEBADORES SENTIDO Y ANTISENTIDO UTILIZADOS EN 44
LA SELECCIÓN DE COMBINACIONES PARA EL ANÁLISIS DE cDNA-SRAP
3.1. LISTADO DE TEJIDOS UTILIZADOS PARA LA SÍNTESIS DE cONA. 57
3.2. COMBINACIONES DE LOS CEBADORES SELECCIONADOS PARA EL 61
DESARROLLO DE LA TÉCNICA cDNA-SRAP, Y PORCENTAJE DE
POLIMORFISMO QUE GENERÓ CADA PAR DE CEBADOR.
3.3. TRANSCRITOS DE cDNA-SRAP-OdT Y cDNA-SRAP-RP DIFERENCIADOS
ESPECÍFICOS DE LOS TEJIDOS EMBRIOGÉNICOS
62
V
•
Resumen
RESUMEN
Antecedentes: El banano es uno de los cultivos de frutales más importantes del
mundo. El mejoramiento convencional en las variedades comerciales es limitado por
su frecuente esterilidad y poliploidía. Por lo tanto, la embriogénesis somática es un
prerrequisito para su mejoramiento mediante el uso de herramientas biotecnológicas.
Los callos embriogénicos pueden inducirse utilizando el sistema de las flores
masculinas inmaduras en cultivares triploides de banano, Musa acuminata, cv. Gran
Naine, y cv. , Williams, con el genoma AAA, y utilizando embriones cigóticos inmaduros
de semillas de plantas diploides, de Musa acuminata ssp., malaccensis, AA, tipo
Selangor, sin embargo, los embriones diferenciados del primer sistema, a menudo
muestran un reducido porcentaje de germinación 35-45%, contrario al observado en el
segundo sistema que presenta un 90-95% de germinación. El análisis de expresión
genómica-global es una herramienta importante para el descubrimiento de genes
implicados en procesos celulares y de desarrollo, en particular, para la comparación de
la embriogénesis cigóticos vs somática en una planta no-modelo.
En este trabajo se analizó el polimorfismo de transcritos de genes que se
expresan en estadios específicos de la embriogénesis de Musa spp. Para ello, se
desarrolló la metodología de cDNA-SRAP, basada en la amplificación de secuencias
relacionadas polimórficas (Sequence Releated Amplified Polymorphysm, SRAP) a
partir de ácido desoxirribonucleico complementario (cONA).
El RNA total fue aislado a partir de callos embriogénicos (CE) , CE con
presencia de pro-embriones globulares, embriones somáticos maduros, y tejidos de
hoja jóvenes, de los genotipos triploides AAA y diploides AA, junto con embriones
cigóticos maduros. El seguimiento de patrones cDNA~SRAP, comparó tres etapas
específicas de la embriogénesis somática de los genotipos mencionados y los
embriones cigóticos de las especies diploides, frente a tejidos de las hojas jóvenes
como control de material no-embriogénico para los tres genotipos. De doce
combinaciones de iniciadores SARP seleccionados, el par Me1-Em7 y el Me4-EM3-
mostraron el mayor porcentaje de polimorfismo, 81,2 y 79,8%, respectivamente,
correspondientes a un número específico de las transcripciones por el tejido y el
genotipo.
1
Resumen
Se registró un total de 138 bandas de transcrito diferenciales al comparar las
diferentes etapas de la embriogénesis y los genotipos. Además, se registraron 43
bandas diferenciales de muestras de hojas, que separa a los grupos genómicos de los
tres genotipos analizados. La evaluación de los dendograma generados mediante el
análisis de agrupamientos de medias aritméticas no-ponderadas (UPGMA) utilizando
la información diferencial de los marcadores cDNA-SRAP, permitió visualizar y
discriminar claramente transcritos de acuerdo al tipo de tejido y en la base a la etapas
de desarrollo de la embriogénesis, así como al nivel de ploidia de los genotipos de
examinados. Los resultados muestran que la técnica de cDNA-SRAP es reproducible y
potencialmente puede ser adaptada para estudios relacionados con la expresión de
genes de la embriogénesis somática y cigóticos, y el mapeo de transcriptoma, en
Musa.
Los fragmentos derivados de transcritos (TDF) regulados diferencialmente en
las fases embriogénicos y tejidos de hojas jóvenes pueden ser aislados , clonados y
secuenciados, con el fin de identificar aquellos directamente relacionados con la
embriogénesis en Musa spp., y buscar su homologías en bases de datos.
2
Abstract
ABSTRACT
Background: Banana is one of the most important fruit crops worldwide. Constrains to
conventional breeding in commercial cultivars are set by sterility and polyploidy. Thus,
somatic embryogenesis is a prerequisite for the use of biotechnological tools for their
improvement. Embryogenic calli can be induced using the immature male flower
system in triploid banana cultivars of Musa acuminata, cv. Grain Naine, and cv.,
Williams, with genome AAA, and immature zygotic embryos on seeded diploid plants of
Musa acuminata ssp. , malaccensis, AA, type Selangor, however, differentiated
embryos on the former system often display reduced percentage of germination 35-
45%, contrary to the 90-95% of germination showed by the later system. Genome-wide
expression analysis is an important tool for discovering genes involved in cellul~u and
developmental processes, particularly for the comparison of zygotic vs somatic
embryogenesis in a non-model plant.
In this work the polymorphism of those genes expressed during specific stages
of Musa spp., embryogenesis was evaluated. For it, the technique of cDNA-SRAP,
which is based on the use of complementary deoxyribonucleic acid (cONA) with the
sequence related amplified polymorphism (SRAP) molecular marker, was
accom plished.
Total RNA was isolated from embryogenic callus (EC), EC with expression of
globular pre-embryos, mature somatic embryos and young leaf tissues, of the triploid ,
AAA and the AA diploid genotypes, together with mature zygotic embryos. Thus,
cDNA-SRAP follow-on patterns compare three specific stages of somatic
embryogenesis of the mentioned genotypes and the zygotic embryos of the diploid
species, against tissues of young leaves use as non-embryogenic control for all three
genotypes. Of the twelve SRAP primer combinations selected, pair Me1-Em7 and Me4-
Em3 exhibited the highest percentage of polymorphism, 81 .2 and 79.8% , respectively,
corresponding to specific number of transcripts per tissue and genotype.
A total of 138 bands differentially transcribed were recorded comparing those
different genotypes and stages of embryogenesis. In addition , 43 bands differentially
transcribe of leaf samples, separated the genomic groups of the three genotypes
3
•
Abstract
analyzed. Assessment of dendograms' created following the analyses of unweighted
pair-grouping method with arithmetic averages (UPGMA) using the locus information of
the cDNA-SRAP markers, clearly discriminate transcripts according to type of tissue
and base on developmental stages of embryogenesis, and the ploidy of the genotypes
examine. The outcome showed that the technique of cDNA-SRAP is highly
reproducible and could be potentially adapted for studies related with the expression of
genes related with somatic and zygotic embryogenesis and for t~anscriptoma mapping,
in Musa.
Thus the transcript-derived fragments (TDFs) differentially regulated in the
embryogenic stages and leaf tissues could be isolated and sequenced in arder to
identify those related directly with embryogenesis in Musa spp, and their homologies
sought in the databases.
4
•
Introducción
INTRODUCCIÓN
Los plátanos y bananos son plantas monocotiledóneas, herbáceas gigantes,
perennes y monocárpicas pertenecientes al género Musa. Este frutal ubicado entre los
cultivos alimenticios más importantes del mundo, con una producción mundial anual de
alrededor de 106 millones de toneladas, se cultiva en cerca de 120 países en regiones
tropicales y subtropicales. En México, su cultivo es una actividad agrícola de gran
impacto económico, ya que está entre los cinco frutales más importantes del país, y es
un fruto básico de autoconsumo y sustento para la economía familiar (Sagarpa, 2007).
La naturaleza de los plátanos y bananos son poliploides e híbridos, las
principales variedades comerciales se propagan vegetativamente; su forma de
propagación asexual y el monocultivo han traído como consecuencia que este frutal
sea altamente susceptible a plagas y enfermedades que disminuyen su producción.
Unas de las principales enfermedades es la Sigatoka negra, cuyo hongo causal
Mycosphaerella fijiensis Morelet es devastador para la planta ya que ocasiona una
reducción en la tasa fotosintética, la rápida defoliación e inevitable la muerte de esta.
El género Musa, esta dividido en cinco secciones, siendo Eumusa la sección
de mayor diversidad e importancia, entre la que se incluye a especies silvestres
seminíferas, tales como Musa acuminata, M. balbisiana y M. schizocarpa,
consideradas entre los ancestros de los plátanos actuales, y portadoras de genes que
confieren tolerancia total o parcial a diferentes condiciones de estrés abiótico y biótico .
Los cruzamientos intra e interespecíficos naturales, trascendieron en la formación de
híbridos como los cultivares actuales, con esterilidad total o parcial , y cuyos frutos
carentes de semillas se desarrollan por partenocarpia. La esterilidad constituye
entonces la mayor limitante en cuanto a las variedades que se pueden utilizar para
desarrollar mejoramiento genético por cruzamientos (Simmonds, 1952, 1953). En este
sentido, se vuelve entonces necesario implementary desarrollar nuevas metodologías
que permitan el mejoramiento de este frutal, tales como, la embriogénesis somática in
vitro y la transformación genética , entre otras; que en plátano, demandan de mayor
conocimiento básico y desarrollo, para su optimización y aplicación rutinaria.
S
•
Introducción
La embriogénesis somática (ES) in vitro, es una metodología que explota la
totipotencialidad de la célula vegetal en un medio sintético, donde se induce la
reprogramación de células somáticas diferenciadas al proceso embriogénico para
producir una estructura bipolar, el embrión. En plátano, la ES indirecta se induce in
vitro a partir de tejido foliar de flores masculinas y/o femeninas inmaduras, o
meristemos en proliferación denominados "escalpos. En un medio sintético adicionado
con la auxina del ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), las células diferenciadas de
dichos tejidos reinician ciclo celular, y son redirigidas hacia la adquisición de una
competencia embriogénica , bajo estas condiciones proliferan y forman callo. Después
de tres meses en cultivo, el tejido del callo embriogénico es proliferado en un medio al
que se le reduce la concentración de auxina del medio a %; bajo estas condiciones
cada célula embriogénica experimenta una serie de divisiones sucesivas que
conforman al pro-embrión globular, el cual crece, diferencia su polo apical y radicular
hacia el estadio de embrión cotiledonario, mismo que después de pasar por una fase
de maduración en que almacena reservas proteicas, germina en una planta completa
(Navarro et al. , 1997, Sholi et al, 2009) .
Estudios realizados en el grupo de la Dra. Escobedo indican que la respuesta
de las flores masculinas inmaduras hacia la formación de callo embriogénico depende
del genotipo y del estadio de desarrollo del tejido donador del explante; y que la tasa
de germinación de embrión somático es factible de incrementarse (Sholi et al, 2009;
Youssef et al., 2010) . Dichas evidencias en Musa spp., especie no-modelo, apuntan
hacia la necesidad de conocer qué genes están involucrados en la ES y cuál es su
función, con el fin de optimizar los protocolos en los genotipos poco o no responsivos
al proceso de la ES.
En la actualidad existen técnicas altamente eficientes para examinar a gran
escala la expresión de genes, i.e., la basada en el análisis serial de expresión de
genes (SAGE, sus siglas en ingles), las basadas en hibridación como los
microarreglos, y las basadas en huellas en gel, como cDNA-AFLP (polimorfismo de
long itud de fragmentos amplificados a partir de DNA complementario) y el despliegue
diferencial (Differential display) entre las más utilizadas, esta técnica se basa en la
amplificación de cONA con un par cebadores arbitrarios, la separación de los
fragmentos resultantes mediante una electroforesis y la reamplicacion de estos, su
clonación y secuenciación. Los métodos de huellas en gel son sumamente
6
Introducción
informativos cuando varios puntos de muestreos y procesos biológicos similares se
examinan para genotipos diferentes.
En este trabajo nos planteamos contar con una herramienta genético-molecular
para identificar posibles genes involucrados en etapas especificas de la ES in vitro de
los genotipos de los cultivares estériles, AAA, Williams, y Enano Gigante, de Musa
acuminata del subgrupo Cavendish, así como del genotipo diploide fértil , AA, Musa
acuminata ssp., malaccensis. Para ello se desarrolló y estandarizó la técnica de cONA
SRAP, y se analizó el polimorfismo de transcritos expresados en tejidos
embriogénicos, y foliar utilizado como control de tejido no-embriogénico, de los
genotipos señalados. La técnica utiliza la síntesis de ácido desoxirribonucleico
complementario (cONA) como templado, y el marcador molecular basado en
polimorfismo amplificado de secuencias relacionadas (Sequence Related Amplified
Polymorphism, SRAP desarrollado por Li & Quiros, 2001). La ventaja del método
cONA-SRAP es que, es sencillo, reproducible y no requiere de información previa de la
secuencia del genoma a analizar, además, el sistema se ha empleado con éxito en
varios cultivos para el análisis del patrón de expresión de genes, y el mapeo de cONA
(Li & Quiroz, 2001 , Li & Quiros, 2003) .
La aplicación de la técnica de cONA-SRAP con material biológico de tres diferentes
estadios de la embriogénesis somática, embrión cigótico y de tejido diferenciado de
hoja utilizado como control no-embriogénico, permitió detectar un total de 456 bandas
de transcritos relacionados con la embriogénesis para los tres genotipos de Musa ssp.,
estudiados, de estos el análisis de su polimorfismo distinguió 138 posibles transcritos
específicos de la embriogénesis somática y cigótica. Además, 43 bandas de
transcritos se identificaron de los tejidos foliares, mismas que permiten diferenciar a
los tres genotipos en su respectivo grupo genómicos, AA y AAA, por nivel de ploidía.
Los resultados mostraron que la técnica de cONA"SRAP es reproducible y
potencialmente adecuada para estudios de patrones de expresión de genes de la
embriogénesis y otros procesos en Musáceas. La aplicación de esta técnica y la
respectiva secuenciación de transcritos, favorecerá la comprensión genético
molecular de la embriogénesis en Musa al disponer de marcadores específicos para la
detección de genes de la embriogénesis que pueden ser blancos potenciales de
estudios más detallados e incluso la clonación de los mismos, y también para estudios
más amplios de expresión génica global.
7
Capitulo 1
CAPITULO 1
ANTECEDENTES GENERALES
1.1 GÉNERO: Musa
La ubicación taxonómica del género Musa, han sido propuesta por Cronquist
(1988).
Clase: Monocotiledonea
Orden: Zingiberales.
Familia: Musaceae.
Género: Musa.
Este género contiene entre 30 y 40 especies diploides, tales como Musa
acuminata y Musa balbisiana, ambas especies con número cromosómico 2n=2x=22 y
cuyos genomas se representan con las letras A y B, respectivamente , sin embargo,
existen otros grupos genómicos tales como S y T, de M. schizocarpa y M. textiles, que
en la naturaleza no son frecuentes (Simmonds, 1987; Pillay et al., 2004) .
El origen del género Musa se atribuye pertenece a la península Malaysia, en
Asia , como probable centro primario tanto de Musa balbisiana como de Musa
acuminata, cuyos cruzamientos originaron a todas las variedades comestibles
conocidas en la actualidad (Belalcazar, 1991).
9
Capitulo 1
Fig. 1.1 Distribución geográfica de las secciones de de Musa (Guinart et al., 2006)
1.1.1 TAXONOMÍA DE Musa.
La familia Musaceae, está constituido por los géneros Ensete, Musa y Muse/la
(Christelová et al., 2011). El género Ensete, se caracteriza por comprender plantas
que se reproducen por semilla, y de uso ornamental y de hábitat subtropical. El género
Musa esta actualmente dividido en cinco secciones Eumusa, Rhodochlamys,
Callimusa, Australimusa e lngentimusa, con base a su número cromosómico y
características morfológicas de sus miembros (Fig . 1.2). Las secciones Callimusa y
Australimusa poseen numero cromosómico 2n=2x=20, Eumusa y Rhodochlamys tiene
el numero básico cromosómico de 11 (2n=2x=22) (Horry et al., 1997, Roux et al.,
2008), mientras que la sección lngentimusa 2n=14 (Horry et al., 1997). La sección
Eumusa es la de mayor importancia económica y distribución geográfica mas
distribuido, alberga las especies más importantes, M. acuminata (genoma, A) y M.
balbisiana (genoma, B) y M. schizocarpa (genoma, S) que por hibridización intra e inter
especifica dieron origen a los plátanos y bananos comestibles. La especie acuminata
comprende ocho subespecies: banksii, burmannica, burmannicoides, malaccensis,
microcarpa, siamea, truncata y zebrina, (Roux et al., 2008) , mientras que las otras dos
secciones no tienen subespecies (De Lange, 2000) .
10
•
Capitulo 1
1 1 MUSA
1 1 1 1 1 Callimusa Australimusa E u musa Rhodochlamys lngentimusa
2n=2X=20 2n=2X=20 2n=2X=22 2n=2X =22 2n=2X=14
1 1 1 M. Acuminata M. Balbisiana M. Schizocarpa (Genoma A) (Genoma B) (Genoma S)
1
1 Subes!;!ecies silvestres 1
ma/accensis Di!;!loides BB . Di!;!loides AA BB CICY si a mea TuuGia
banski P. Berlin truncata Banana de cocción ABB
burmanica Cultivares AAA Bluggoe
Williams P. awak
Hibridos Gross Michel
Yankambi km5 FHIA 01 AAAB
Enano Gigante Tetra!;!loides A TMX-52951 AABB
FHIA-23
Fig.1.2: Diagrama de la taxonomía de Musa, Simmonds, 1962; Youssef et al., 2011 .
1.1.2 BOTÁNICA DE Musa spp.
Los bananos y plátanos son plantas con pseudotallos aéreos que se originan
de cormos en los cuales se desarrollan numerosas yemas laterales o hijos. Las hojas
tienen una distribución helicoidal (filotaxia espiral) y las vainas foliares circundan el
tallo subterráneo o cormo, dando origen al pseudotallo . La inflorescencia es terminal y
crece a través del centro del pseudotallo hasta alcanzar el follaje superior y salir. Cada
tallo produce una sola inflorescencia y luego muere; la planta continua su ciclo de vida
a través de la formación de hijuelos laterales. De esta manera la planta puede
propagarse vegetativamente por tiempo aparentemente indefinido. En las especies
silvestres seminíferas, la polinización es esencial para el desarrollo del fruto. El fruto
maduro contiene una masa de semillas negras y duras rodeadas de una pulpa escasa
y dulce que se desarrolla de las paredes del ovario y del septo (De Langhe, 1996).
Los bananos silvestres son diploides (2n = 2x =22 cromosomas) , producen
semillas, generalmente la semilla es fértil y la polinización es esencial para el
11
•
Capitulo 1
desarrollo del fruto. El óvulo es fecundado en las 24 horas siguientes a la floración . El
cigoto se divide en los siguientes quince días. El crecimiento del embrión es lento y la
diferenciación comienza aproximadamente después de 55 días. El meristemo apical y
caulinar aparece generalmente a los dos meses (Escalant & Teisson, 1987). En la
semilla madura, el embrión presenta la forma de "hongo" característico de las
Musáceas. La porción agrandada, "cabeza", se denomina haustorio y es la parte
principal del cotiledón. La porción angosta, "pie", del embrión representa el eje
epicotilo-hipocotilo-radícula, así como una parte del cotiledón . Esta porción se
encuentra dentro del collar del micrópilo (McGahan, 1961).
Los cultivares comerciales son la mayoría triploides (2n = 3x = 33 cromosomas)
y algunos diploides (2n= 2x=22 cromosomas), no producen semillas, solo en muy
raras ocasiones y en contados cultivares, y el desarrollo de los frutos no requiere de la
polinización (partenocarpicos) (Simmonds , 1996). La partenocarpia y la esterilidad son
producto de mecanismos genéticos diferentes. Existe esterilidad genética, así como
también la causada por la estructura híbrida del germoplasma. La esterilidad en los
triploides sería del tipo estructural; sus flores femeninas son altamente estériles, y las
flores masculinas no contienen polen viable (Simmonds, 1996).
1.1.3 Musa spp.
Las bananas son cultivadas en más de 120 países, estos incluyen zonas
tropicales y subtropicales dentro de los cinco continentes. La producción de bananas
representa una fuente esencial para la alimentación y a su vez una fuente de empleo
(Bakry et al., 2009). A nivel mundial existen dos tipos de producción agrícola de Musa
spp., la producción de bananos de exportación y la de plátanos para autoconsumo. En
nuestro país, la producción de banano es una de las actividades agrícolas de mayor
impacto económico en las zonas donde se desarrolla, por lo que está considerado
dentro de los cinco frutales más importantes (FAO, 2007). Se usa el nombre genérico
de plátano para designar ambos tipos de frutos, por ejemplo, los bananos de postre
como el plátano Dátil (con genoma AA) , el plátano Tabasco o Chiapas (AAA), o el
Manzano (AAB), y los frutos de cocción como el plátano Macho (AAB) y el Cuadrado
(ABB) (Orozco-Santos et al., 2001) .
12
•
Capitulo 1
1.1.4. TAMAÑO DEL GENOMA DE Musa spp.
El contenido del genoma nuclear de Musa es relativamente pequeño en
comparación a otras angiospermas (Dolezel et al., 1994). El tamaño nuclear de M.
acuminata es de 61 O Mpb (Kamaté et al., 2000, Hriibová et al., 2007), mientras que M.
balbisiana, se encuentra entre los de menor tamaño, 537 Mpb (Lysak et al., 1999,
Kamaté et al., 2000). Existe una variación de contenido de DNA a lo largo de genoma
de los cultivares triploides de Musa de 559 a 613 Mpb con valores de contenido 2C
de ADN que va de 1.61 a 2.23 pg. El tamaño del genoma de los tetraploides (2C=
4x=44) fluctúa entre 1.94 a 2.37 pg. El valor de la composición genómica de las bases
de Musa es de 40.8±0.4% de GC (Kamaté et al., 2000).
1.1.5 IMPORTANCIA ECONÓMICA.
Los bananos y plátanos constituyen uno de los cultivos alimenticios más
importantes en el mundo. Con una producción anual estimada de 106 millones de
toneladas (Lescot, 2006). Se encuentra entre los cuatro frutales más importantes
después del arroz, trigo y maíz (Roux et al., 2004), es fuente de alimentación de cerca
de 400 millones de personas en los 120 países menos desarrollados del mundo,
constituyendo hasta un 90% de los carbohidratos consumido (INIBAP, 2000) . Son
frutales considerados componentes de seguridad alimentaria en varios países
subdesarrollados, de su cultivo dependen los habitantes de distintas zonas tropicales
del mundo, ya sea como fuente de alimento o de ingresos (INIBAP, 2000).
Alrededor de 120 países producen bananos a través de regiones tropicales y
subtropicales (SAGARPA, 2007). Los bananos de postre se cultivan extensivamente
para su exportación a Europa (Occidental, Central y Oriental), China y América del
Norte, mientras que los bananos de cocción y algunos bananos de postre
generalmente se cultivan en los patios para su autoconsumo en los países tropicales.
En México, la producción de banano es una actividad agrícola de gran impacto
económico, siendo de los cinco frutales más importantes del país (FAO, 2007). En
nuestro país el principal estado productor de bananas es Chiapas donde se tienen
plantaciones en 21,115 hectáreas, y se obtiene una producción de 702,868 toneladas
anuales (FAO, 2007). Otros estados productores de plátano son en orden de mayor a
13
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Capitulo 1
menor producción son Tabasco, Veracruz, Colima, Michoacán, Jalisco, Nayarit,
Guerrero, Oaxaca, Puebla, Quintana Roo, Sinaloa, Yucatán , Campeche, Estado de
México, Morelos e Hidalgo. En los 17 estados productores de plátano, incluyendo
Tabasco, se tiene una superficie plantada de 76,313 hectáreas, las cuales produjeron
el año pasado, dos millones 196,154 toneladas de bananas, con un rendimiento por
hectárea de 29.5 toneladas de fruta por cada 1 O mil metros cuadrados de plantación
(SAGARPA, 2007) . Como importancia nutricional los plátanos y bananos como
alimento son fuente de carbohidratos, minerales y vitaminas (A, C y 86) (Roux et al.,
2004).
1.2. EMBRIOGÉNESIS.
El proceso de embriogénesis es uno de los más importantes durante el ciclo de
vida de las plantas, se inicia con la doble fertilización, seguido por la determinación de
los tres ejes del embrión (longitudinal, lateral y radial) y cambios morfológicos del
embrión (globular, forma de corazón y de torpedo) ; seguidamente, las proteínas de
reserva se acumulan para que los embriones inicien el proceso de desecación y
dormáncia. Dichos estadios del proceso son regulados por numerosos factores
incluyendo fitohormonas, enzimas y otras sustancias relacionadas con la
embriogénesis (lkeda et al., 2006).
La embriogénesis es un proceso complejo que incluye la división celular, la
diferenciación, el crecimiento y la morfogénesis ·que son altamente coordinados
(Mayer et al., 1998). Este proceso es tan complejo que, en Arabidopisis thaliana se
estima que al menos, 750 genes y sus productos intervienen durante el desarrollo del
embrión (Ding et al. , 2006). La capacidad de reproducirse vegetativamente y de iniciar
el desarrollo de un embrión a partir de la reprogramación de células somáticas es una
propiedad única de las plantas y de su totipotencialidad celular. Es por ello que se
sugiere que los embriones cigóticos y somáticos siguen patrones similares de
desarrollo, no obstante, el desconocimiento sobre los mecanismos moleculares que
subyacen a ambos procesos, como son los genes que se expresan y regulan los
estadios tempranos del desarrollo del embrión globular (Zimmerman, 1993; Ding et al.,
2006) .
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•
Capitulo 1
El proceso de embriogénesis, es importante para realizar estudios desde la
perspectiva de la genómica funcional a fin de investigar los genes relacionados con
procesos determinados y comprender varios eventos moleculares que involucran no
solo la expresión diferencial de genes sino también la transducción de señales para
activar/reprimir numerosos grupos de genes, el cual no se conocen aun en su totalidad
(Chugh & Khurana, 2002).
1.2.1 EMBRIOGÉNESIS CIGÓTICA.
Estudios realizados en Arabidopsis thaliana (Harada, 1997; Santos-Mendoza et
al., 2008) indican que la fase de morfogénesis ocurre por medio de una doble
fertilización realizado en el saco embriogénico dando origen al aumento del
endospermo y al cigoto; seguida de una serie de divisiones asimétricas que ocurren
para dar origen a células apicales y basales que posteriormente formaran al cigoto
con estructura globular y al suspensor respectivamente. Seguidamente ocurre una
serie de eventos consecutivos que dará origen a varios tejidos y órganos como los
meristemos, cotiledones e hipocotilo y la adaptación de cada uno de los tipos de
célu las para cada tejido dentro del embrión. La estructura acorazonada del embrión en
desarrollo se puede observar aproximadamente a 7 días después de la fertilización, en
este estadio ocurren eventos como es la des-diferenciación del protodermo en
epidermis, los agrupamientos pro-vasculares forman el sistema vascular y su forma
completa del embrión es determinada con organización de ambos meristemos apico
basales (brotes y raíz) y la formación de cotiledones simétricos mediante divisiones
laterales localizadas, procesos similares ocurren en monocotiledoneas, los estadios
iniciales, hasta la formación del embrión globular son idénticos, se diferencia en que el
cotiledón se desarrolla apicalmente y primero se diferencia el cotiledón y luego las
otras partes del embrión.
1.2.2 EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA.
La totipotencia de las células vegetales se manifiesta por la capacidad de estas
a seguir diversas vías de desarrollo según el tipo y duración del estimulo a que la
célu la o tejido este expuesta, un ejemplo es el proceso de embriogénesis somática
15
Capitulo 1
(ES). La ES (asexual o adventicia) consiste en el desarrollo de embriones a partir de
células que no son el producto de una fusión gamética, es decir, proceso por el cual ,
se produce una estructura bipolar, el embrión, a partir de una célula somática. Se
presenta con cierta frecuencia en la naturaleza, produciéndose de forma espontánea
en diversas familias, algunas tan importantes como las Crasuláceas, Crucíferas,
Cucurbitáceas, Gramíneas, Rosáceas, Leguminosas, Palmáceas, etc. Es pues, un
proceso tan natural como la embriogénesis cigótica, con casos tan conocidos como el
de los cítricos, en los que ambos tipos de embriogénesis ocurren casi
simultáneamente en el interior de la semilla (Halperin, et al., 1964; Nabors, et al.,
1983).
La ES, es una herramienta utilizada en el cultivo de tej idos vegetales, para la
propagación masiva de plantas, y la transformación genética, dicho proceso fue
reportado por primera vez en 1958, en tejidos de células de zanahoria (Reinert, 1958,
Steward et al., 1958).
La formación de embriones somáticos puede darse directamente sobre la
superficie de un tejido organizado a partir de una o un pequeño número de células
con competencia embriogénica, o indirectamente, a través de pasos intermediarios
como es la formación de callo o masa celular desorganizada de células totipotenciales
y cultivos en suspensión derivados del callo (Williams & Mashewaram, 1986). En estos
casos se requiere de condiciones de cultivo in vitro favorables, reguladores de
crecimiento, para disparar la división celular y lograr o mantener la determinación
embriogénica, y la posterior diferenciación del embrión .
Los reguladores, auxinas y citocininas, utilizados en el medio de cultivo de
tejidos son manipulados para lograr la inducción de los tejidos, la formación de callo
embriogénico y la subsecuente diferenciación de embriones somáticos. El genotipo,
tipo de explante, estadio de desarrollo, hormonas de crecimiento, estrés omótico,
temperatura y fuente de crecimiento son condiciones que pueden afectar a la
inducción de la embriogénesis somática (Kamada, 1980, 1996).
En la actualidad el sistema de la ES se ha establecido como modelo de estudio
de muchas especies vegetales (Zimmerman, 1993). Las evidencias experimentales
indican que existe cierta similitudes morfológica y fisiológica entre el desarro llo de los
embriones somáticos y embriones cigóticos (Fig. 1.3) ; por lo cual la ES sirve de
modelo para estudiar eventos fisiológicos, morfológicos, bioquímicos, mecanismos de
16
Capitulo 1
regulación de la expresión génica y otros procesos moleculares durante la
embriogénesis cigótica así como su comparación entre ambos sistemas.
( Embriogénesis Cigótica J
Cigoto Globular Corazón/Torpedo Cotiledón
( Embriogénesis Somática J
888o o ooo o Callos Globular Corazón/Torpedo Plántula
Expansión
Q Maduración Germinación
o Q o y
Desecación
Q Dormáncia
Regeneración de
planta completa
Crecimiento
Fig. 1.3 Comparación entre el proceso de embriogénesis cigótica y somática , Zimmerman,
1993.
1.2.3 EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA EN Musa.
Estudios realizados sobre la embriogénesis somática de Musa indican que la
respuesta de las flores masculinas inmaduras a la formación de callo embriogénico
depende tanto del genotipo, como del estadio de desarrollo del tejido donador del
explante (Youssef et al., 201 O). Por ejemplo, el mencionado autor encontró un mayor
porcentaje de formación de callo embriogénico en el cultivar Musa acuminata
Cavendish , AAA Williams cuando el tejido donador de explante provenía de
inflorescencias masculinas de 2 semanas de edad, a diferencia de M. , acuminata
Cavendish AAA cv. Enano Gigante, en cuyo caso se observó una mejor competencia
embriogénica en tejidos provenientes de flores masculinas de inflorescencias de una
semana de edad . De manera equivalente, Burgos, 201 O, presenta evidencias de
diferencias en cuanto a la respuesta embriogénica de los embriones cigóticos
17
Capitulo 1
inmaduros en los genotipos Musa acuminata malaccensis tipo Selangor (genoma AA)
y Musa schizocarpa (genoma SS), en función del nivel y tipo de regulador de
crecimiento utilizado en el medio de cultivo durante la inducción de embriones
cigóticos de diferentes edades.
1.2.4 EXPRESIÓN DE GENES DURANTE LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA.
La ES ha servido como modelo de estudio para elucidar los genes y las vías de
señalización del proceso embriogénico en plantas. En la actualidad, se han reportados
marcadores bioquímicos y moleculares que son utilizados para diferenciar entre
cultivos embriogénicos y no embriogénicos, entre estos marcadores se pueden
mencionar, la proteínas extracelulares, EP2 (Sterk et al., 1991),
arabinogalactoproteinas, AGPs, (Kreuger et al., 1993; Hengel et al. , 2001) y Quitinasas
(Harada, 1999; Passarinho et al., 2001 , Rojas-Herrera , et al. , 2002) y genes
expresados como SOMATYC EMBRYOGENESIS RECEPTOR LIKE KINASES, SERK
(Schmidt et al., 1997), genes LEAFY COTYLEDON, LEC (Lotan et al., 1998),
FUSCA3, FUS3, (LuerBen et al., 1998), ABA INTENSITIVE, ABI3 (Shiota et al. , 1998),
BABY BOOM, BBM (Boutilier et al., 2002), WUSCHEL, WUS (Zuo et al. , 2002) . Los
genes LEC, BBM y WUS codifican para factores de transcripción involucrados en
diferentes etapas de la embriogénesis somática (Yhang et al., 201 O) .
Comúnmente, los tejidos o células vegetales requieren de pulsos auxínicos
para promover la división celular y la competencia embriogénica de los tejidos; entre
los genes que incrementan su expresión en aquellos tejidos sometidos a la presencia
en respuesta al acido diclorofenoxiacético 2-4 O auxina sintética, se encuentra; SERK.
La expresión de dicho gen se observó por primera vez en suspensiones celulares de
zanahoria, encontrándose que se expresa de manera continua durante la formación de
las masas pro-embriogénicas y el estadio de embrión globular en la etapa temprana de
embriogénesis somática, desde entonces la expresión de genes SERK se ha
relacionado con la competencia embriogénica (Schmidt et al. , 1997) en diferentes
especies tales como, Dactilis glomerata (Somleva et al., 2000) , Helianthus annuus
(Thomas et al., 2004), Ocotea catharinensis (Santa-Catarina et al., 2004), Oryza sativa
(Hu et al., 2005), Theobroma cacao (de Oliveira Santos et al., 2005) , Cyclamen
18
•
Capitulo 1
persícum (Rensing et al., 2005), Arabídopsís thalíana (Salaj et al., 2008), y Musa
acumínata (Huang et al., 2009), entre otras.
Es notorio que durante la embriogénesis cigótica de zanahoria, la expresión del
gen SERK se observa solo en la etapa globular y no en etapas tardías. Con base en
estas observaciones se propuso que la misma vía de transducción de señales es
activada durante la inducción de la competencia embriogénica tanto para las células
somáticas como en la embriogénesis cigótica después de que ocurre la fertilización de
la ovocélula (Hecht et al., 2001) . La evidencias actuales sugieren que SERK constituye
una familia de genes cuya función es conservada en la embriogénesis de plantas, y
cuya proteína tiene una localización membrana! (Shah et al., 2002; Yang et al., 201 O).
Los genes LEC y FUS3 de Arabídopsís thalíana, que codifican para las
proteínas, LEC1 y LEC2, y FUS3 juegan papeles clave en el control del desarrollo del
embrión. A diferencia de la mayoría de otros reguladores de la embriogénesis que
funcionan durante etapas específicas de dicho proceso, los genes LEC tienen la
característica única de ser requeridos para el desarrollo normal tanto en las fases de
tempranas como tardías. En la embriogénesis temprana los genes. LEC son requeridos
para especificar el destino de las células del suspensor y la identidad del cotiledón .
Mientras que durante la fase tardía dichos genes son necesarios durante la
maduración del embrión para la adquisición de la tolerancia a la desecación (Siobhan,
et al., 2008).
Por otra parte, el acido abscísico (ABA) es una hormona de crecimiento que
regula varios procesos durante la embriogénesis, en la formación de semillas y se
sabe que se acumula también en respuesta a estrés. Las proteínas LEA así como los
genes EP que codifican para proteínas extracelulares que son excretadas al medio de
cultivo durante la embriogénesis somática (Chugh & Khurana, 2002) . Existen
evidencias de que los genes LEA (Late Embryogenesis Abundant), son también
inducidos por diferentes condiciones de estrés e.g., frío, calor, salinidad, estrés
osmótico, aplicación exógena de fitoreguladores, (Mowla et al., 2006).
19
•
Capitulo 1
1.3 LA TÉCNICA cDNA-SRAP Y EL ANÁLISIS FUNCIONAL.
El análisis de la expresión de genes, circunscrito de manera general en el
término "genómica funcional", representa el vínculo entre la fisiología y la biología
molecular de los procesos biológicos. En la actualidad son diversos los métodos
moleculares con que se cuenta para el análisis de la expresión de transcritos, RNA
mensajero (mRNA) . Utilizados de manera juiciosa, métodos tales como la transcripción
reversa de la reacción en cadena de la polimerasa (RT -PCR), el análisis por
microarreglos, la hibridación sustractiva, la secuenciación de etiquetadas expresadas
(EST), así como, la síntesis de DNA complementario (cONA) a partir de poblaciones
de RNA total o mensajeros en combinación con algún marcador molecular MM,
cDNA-AFLP y cDNA-SRAP (Li & Quiros, 2003) , son técnicas de gran utilidad para
elucidar los genes o diferentes grupos de estos expresados de manera específica y
diferencial en determinado proceso biológico de las plantas (Henry & Mandoli, 2003).
La metodología cDNA-SRAP representa una herramienta con gran potencial
para los programas de mejoramiento de los cultivos, tales como banano y plátano, ya
que, entre otras de sus aplicaciones, es útil en estudios de genómica funcional , y
mapeo genético del transcriptoma (Li et al., 2003, 2007; Choochai & Padrit , 2007; Gui
et al. , 2007; Gui et al., 2009). Con dicha metodología, por ejemplo, se identificaron y
clonaron los transcritos de genes responsivos a fotoperiodo en Driza sativa L. ,
(Choochai & Padrit, 2007), o aquellos involucrados en el proceso de elongación del
tallo de caña de azúcar (Wu et al., 201 O); mientras que en Brassica, la metodología de
cDNA-SRAP sirvió para definir la fracción de genes duplicados que sufren alteraciones
en su expresión por silenciamientos o activación presentes en alopoliploides naturales
(Gui et al., 2009) .
1.3.1 POLIMORFISMO DE SECUENCIAS AMPLIFICADAS RELACIONADAS
(SEQUENCE REAL TED AMPLIFIED POL YMORPHYSM, SRAPS).
El polimorfismo de secuencias amplificadas relacionadas, SRAP, es una
metodología para evidenciar diferencias genéticas a nivel de ADN , entre miembros
de un taxón o diferentes taxones. Este marcador molecular (MM) , desarrollado por Li y
Quiros (2001) , está basado en la reacción de PCR, para lo cual utiliza cebadores
Capitulo 1
diseñados para amplificarse dentro de los marcos de lectura abierta (Open Reading
Frames, ORFs, por sus siglas de ingles) de la secuencia de ADN templado. Este MM
ha sido ampliamente utilizado para caracterizar y estimar la variabilidad genética
dentro y entre poblaciones; la estimación de tasa de entrecruzamiento, el mapeo
genético de numerosos taxones, y la identificación de duplicados en colecciones
nucleares y como consecuencia de estos puntos la determinación de mejores
estrategias para la conservación de recursos filogenéticos (Li & Quiros 2001 ; Wang et
al., 2007, Valdez-Ojeda et al., 2008, Zaefizadeh & Goliev 2009; Valdez-Ojeda et al.,
201 O; Liu et al., 2011). En Musa, recién se demostró que el marcador SRAP es
adecuado para estudiar las relaciones genéticas y la diversidad del género, ya que
separa con buen soporte estadístico los 40 diversos genotipos de diferente
composición genómica y nivel de ploidía, i.e. , AA, AAA, 88, A8, AA8, A88, y SS;
ubicándolos claramente en las diferentes secciones en que se divide el género
(Youssef, et al., 2011); asimismo, este marcador identificó bandas únicas para
genotipos dentro de cada sección, esto hace del marcador SRAP, un buen candidato
para utilizarlo en trabajos de mejoramiento asistido y mapeo genético a nivel de
secuencias de ADN y de transcriptoma en Musa.
1.3.2. CARACTERÍSTICAS DE LOS CEBADORES SRAP.
Para desarrollar la metodología del MM SRAP, se utiliza un par de cebadores ,
uno de 18 nucleótidos y otro de 17 nucleótidos de longitud (fig .1.4). La estructura de
estos cebadores se encuentra dividida en dos partes, en el extremo 3' hay tres
nucleót idos selectivos, en la parte media cuatro nucleótidos constantes CCGG , para el
de 18 nucleótidos (sentido), y AATT para el de 17 nucleótidos (antisentido); mientras
que el extremo 5' está compuesto de serie de secuencias variadas de 1 O a 11
nucleótidos; el principio de estos cebadores es amplificarse mediante PCR dentro de
los marcos de lectura abierta (Li & Quiros, 2001) .
El propósito de utilizar la secuencia de "CCGG" en la secuencia del primer
cebador, es para que estos puedan alinearse a los exones de las regiones ORFs, esto
se basa a que los exones contienen regiones ricas en GC. El segundo cebador
contiene secuencias "AATT" por ser que en la región 3' contiene secuencias ricas en
AT.
21
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Capitulo 1
Nucleótidos selectivos
Sentido 5'- -3'
Secuencias variadas Secuencias constantes
L_ Secuencias nuclear _j
Antisentido 5'- fNNNNNNNNNNN11 )(AATT) -3'
Fig. 1.4: Construcción de cebadores SRAP (Li & Quiros, 2001 ).
Normalmente esto es encontrado con frecuencia en los promotores e intrones.
Los intrones, promotores y las secuencias espaciadoras usualmente se encuentran de
manera variable en las distintas especies, dichas disimilaridades pueden ser capaces
de generar bandas polimórficas basadas en los intrones y exones (Lin et al., 1999).
1.3.3 AMPLIFICACIÓN DE DNA.
La amplificación de cebadores SRAP se realiza mediante PeR, los primeros
cinco ciclos son a 94° e por 1 min, 3S 0 e por 1 min, y 72° e por 1 min para la
desnaturalización, seguido de 3S ciclos a sao e, la temperatura inicial de alineamiento
en los primeros cinco ciclos es 3Soe; esta temperatura se basa en la secuencia del
cebador a alinearse al DNA templado, la cual depende de la eficiencia de amplificación
del equipo; la temperatura de alineamiento es incrementada subsecuentemente a los
3S ciclos hasta alcanzar sao e para llegar a una alta reproducibilidad, ya que si se usa,
por ejemplo, 3S 0 e para todos 3S ciclos la reproducibilidad será muy baja. Los
fragmentos amplificados de DNA pueden ser separados utilizando geles de acrilamida
desnaturalizante y detectados por autorradiografía (Li & Quiros, 2aa1).
•
Capitulo 1
1.4 SÍNTESIS DE cONA.
Para realizar la síntesis de ONA complementario (cONA), se requiere de la
enzima Transcriptasa inversa (RT), la cual que lleva a cabo la transcripción de la
molécula del RNA mensajero (mRNA) en ONA. Esta enzima es esencial para el
estudio de los productos expresados en las células eucarióticas, tiene como numero
de clasificación enzimática EC. 2.7.7.49, fue descubierta por Baltimore (Baltimore,
1970, Varmus et al., 1985). Se obtuvo de la purificación del virus de la mioloblastosis
aviar (AMV); en 1985, se aisló de un tipo de virus de Leucemia (Moloney Mourine
Leucemia Virus (MMLV) RT de donde fue clonada, sobre exprésada en Escherichia
coli y purificada de dicha bacteria, para el mejoramiento de su eficiencia, actividad y
rendimiento, esta versión , fue modificada por la adición de la actividad RNasa H, que
tiene afinidad a la cadena de RNA no transcrita a cONA y se incremento la eficiencia
de la síntesis de toda la cadena de cONA mayor que las nativa, es decir, a las enzimas
AMV RT y MMLV RT (Varmus et al., 1985).
1.4.1 ACTIVIDAD CATALÍTICA DE LA RT.
La RT cuenta con dos actividades catalíticas, una como polimerasa para
sintetizar ONA y otra como Ribonucleasa H (RNase H) que reside como un simple
polipéptido. En el ciclo de vida de los retrovirus, la actividad de RT ONA polimerasa,
es la responsable de transcribir el RNA viral a doble cadena de ONA, la función de la
RNase H en la replicación, es de degradar el RNA genómico durante la síntesis de
ONA. La RT es utilizada extensivamente como tecnología de ONA recombinante , el
principal problema que se presenta en la síntesis de cONA, es la activad de RNase H
ya que puede hacer disminuir la cantidad de copias de cONA hasta en 50% por ser
que puede empezar a degradar la cadena de RNA antes de iniciar la síntesis de cONA
(Varmus et al., 1985).
La RT util iza como blanco el extremo de mRNA que contiene la cadena de poli
(A) y para ello se emplean cebadores oligo d (T) (Fig. 1.5) para completar la nueva
cadena de cONA, también es utilizada cuando se cuenta con RNA total de buena
calidad y se desee amplificar el fragmento total. Otra alternativa, para la síntesis de
23
•
Capitulo 1
cONA, es recurrir a hexámeros, que son cebadores aleatorios, en este caso, se
amplifican fragmentos de la cadena mRNA y es una alternativa cuando se cuenta con
mRNA sin la cola de poli(A) o se desee amplificar los fragmentos mas cercanos al
extremo 5' (Fig. 1.6).
poli A 3' U AA GCAU aaaaaaaaaaaa
mRN GC A CGT A t t t t t t t t t t t 5'Gppp CGCAUUGCCAAGGCCG CU
G
Dirección de Síntesis de cONA
Fig .1.5: Representación de la síntesis de cONA utilizando Oligo dT.
mRNA l poliA J' 5' Gppp UUGCCAAGGCCA CA UC GAGCAU aaaaaaaaaaaa
nnnnnn Random Primers
Dirección de Síntesis de cONA
Fig. 1.6: Representación de la síntesis de cONA utilizando random primers.
24
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Capitulo 1
HIPOTESIS
Es posible identificar la variación a nivel de transcritos en tejidos embriogénicos
y no-embriogénicos durante la embriogénesis de diferentes genotipos Musa mediante
la técnica de cDNA-SRAP.
OBJETIVO GENERAL
Evaluar el polimorfismo de transcritos de genes expresados en estadios
específicos de la embriogénesis de Musa mediante la aplicación de la técnica de
cDNA-SRAP.
OBJETIVOS PARTICULARES
1. Mantener y proliferar callo embriogénico de Musa acumínata, AAA, cvs. Williams y
Enano Gigante (Cavendish), y de la subespecie diploide AA, M. acumínata spp.,
malaccensís tipo Selangor.
2. Estandarizar la técnica de cDNA-SRAP en Musa, para detectar el polimorfismo de
transcritos de genes de la embriogénesis somática.
3. Analizar los polimorfismos de los transcritos detectados entre genotipos.
25
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Capitulo 1
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
Para lograr los objetivos de este estudio, se seguirá la estrategia experimental que
aparece en la figura 1.7.
Material vegetal
¡--········································································································¡ . . ; ;
Tejidos embriogénicos y No-embriogénicos de Musa AA
Tejidos embriogénicos y no
embriogénicos de Musa (AAA)
. . •• ••••••••• ••• ••••••••••••••••••••••••••••••••••••• •••••-ooo ooooooooonoo oooooooo •• ••••••••••••••••••••••••
r·····················································································
Extracción de
R~A .. Tratamiento con
DNasa
Electroforesis en gel de
;····• PCR-SRAP ······• secuenciación y tinción ¡-• Síntesis de cDNA ...... ! con plata •
. ..................................................................... .
Análisis de Resultados
Fig . 1. 7: Estrategia experimental que muestra las diferentes partes del trabajo para alcanzar los
objetivos planteados en este estudio.
26
•
Capitulo 1
1.5 BIBLIOGRAFÍA.
Ammirato, P. V. (1983). Embriogénesis, In: Handbook of plant cell culture. , Vol. l.
Techniques for Propagation and Breeding, (Evans D.A, W.R. Sharp, P. V.
Ammirato, Y. Yamada eds.) Macmillan, New York, 82-123.
Baltimore, D. (1970). Viral RNA-dependent DNA polymerase. Nature 226, 1209- 1211 .
Bakry, F. , Careel F., Jenny C., Horry J. P. (2009). Genetic improvement of banana, In
S.M. Jain ; P.M Priyadarshan (eds.) , Breeding plantation tree crops: Tropicals
species. Springer Science and Busines Media, pp 3-50.
Bartos, J., Alkhimova O., Dolezelová, M., De Langhe E., Dolezel, J. (2005) . Nuclear
genome size and genomic distribution of ribosomal DNA in Musa and Ensete
(Musaceae): taxonomic implications. Cytogenet Genome Res. 109, 50-57.
Belalcázar, S. (1991). El cultivo del Plátano en el trópico; Feriva: Cali , Colombia , p 376.
Berger, S. L., Wallace, D. M., Puskas R. S., Eschenfeldt, W. H. (1983) . Reverse
transcriptase and its associated ribonuclease H: lnterplay of two enzyme activities
controls the yield of single-stranded complementary deoxyribonucleic acid.
Biochem. 22, 2365-2372.
Boutilier, K., Offringa, R., Sharma, V. K., Kieft, H., Ouellet, T., Zhang, L. M., Hattori,
J., Liu, C. M., van Lammeren, A. A. M., Miki, Bla. (2002) Ectopic expression of
BABY BOOM triggers a conversion from vegetative to embryonic growth. Plant Cell
14, 1737-1749
Burgos-Tan, M. (201 O). Estudio de la embriogénesis somática en Musa. Tesis de
Licenciatura de Químico Biólogo Bromatólogo, Facultad de Química , Universidad
Autónoma de Yucatán, (UADY). Pp. 77.
Braybrook, S. A., and Harada, J. J. (2008) LECs go crazy in embryo development.
Review, Trends in Plant Science, 13, 624-630.
27
•
Capitulo 1
Campbell, M., Brunner A.M., Jones H.M. Strauss S.H. (2003). Forestry's fertile crescent:
the application of biotechnology to forest trees. Plant Biotech J. 1:141-154.
Choochai, N., Padrit, P. (2007). Detection responsive gene in KDML, 105 rice (Oryza
sativa L.) using cDNA-SRAP technique. Nat Sci.41 :651-659.
Chugh, A., Khurana, P. (2002). Gene expression during somatic embryogenesis:
recent advances, Curr. Sci. 83, 715-730.
Christelova, P., Valarik, M., Hribova, E., De Langhe, E., Dolezel, J. (2011). A multi
gene sequenced-based phylogeny of the Musaceae (banana) family, BMC Evol.
Biol. 11 :103-
Cronquist, A. (1988). The evolution and classification of flowering plants, 2a ed.; New
York Botanical Garden: New York, pp; 159-163.
De Langhe, E. (1987) Plátanos. In: Genotecnia de cultivos tropicales perennes. AGT
editor, S.A. 1987, p 411-437.
De Lange, E. (2000). Diversity in the genus Musa: its significance and its potential. Acta
Hort. 540. 81- 88.
de Oliveira Santos, M., Romano, E., Yotoko, K. S. C., Tinoco, L. M. P., Dias, B. B. A.,
Aragao F. J. M. (2005). Characterisation of the cacao somatic embriogénesis
receptor-like kinase (SERK) gene expressed during somatic embryogenesis, Plant
Sci. 168, 723-729.
Ding, Y., Liu, N., Tang, Z., Liu, J., Yang, W. 2006. Arabidopsis Glutamina-Rich Proitein
23 is essential for early embryogenesis and encodes a novel nuclear PPR motif
protein that interacts with RNA Polymerase 11 subunit 11, Plant Ce//, 18, 815-830.
Dolezel, J., Dolezenová, M., Novak, F. J. (1994). Flow cytometric estimation of nuclear
DNA amount in diploids bananas (Musa acuminata and Musa balbisiana). Biología
Plantarum 36, 351 -357.
28
•
Capitulo 1
Escalant, J. V. ; Teisson, C. (1989) . Somatic embryogenesis and plants from immature
zygotic embryos of the species Musa acuminata and Musa balbisiana. Plant Ce/1
Rep. 7, 665-668.
FAO 2007. Datos de FAOSTAT. Base de datos para estadísticas sobre comercio y
consumo agrícola. Producción de banano en México. URL:http//www.apps.fao.org .
Enero, 2011 .
Gerard, G. F., Fox, D. K., Nathan, M., D' Alessio, J. (1987). Reverse Transcriptase:
The Use of Cloned Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase to
Synthesize DNA from RNA. Molecular Biotechnology 8, 61-?7.
Gui, Q., Wang, J., Xu, Y., Wang, J. (2007). cDNA-SRAP, analysis of gene expression in
plants. Chinese journal of oil crop sciences. 29, 4 : 497- 502. (Idioma Chino)
Gui, Q., Wang, J., Xu, Y., Wang, J. (2009). Expression Changes of Duplicated Genes in
Allotetraploids of Brassica Detected by SRAP-cDNA Technique, GENOMICS,
TRANSCRI PTOMICS, PROTEOMICS. Molecular Biology (Molekulyarnaya
Biologiya) , Vol. 43, pp . 1-7.
Guinard, O., Arnaud, E., Sharrock, S. (2003). Preliminary analysis of the Musa
Germplasm lnformation System data for Southeast Asia using the Geographical
lnformation System software DIVA-G IS. INIFAP.
Gupta, P. K., Balyan, H. S., Sharman, P. C., Ramesh, B. (1996) . Microsatellites in
plants. A new class of moleculars markers. Current Science. Vol. 70, 45-54.
Harada, J. J. (1997). Seed maturation and control of germination. In: Advances in
Cellular and Molecular Biology of Plants, Vol. 4, Cellular and Molecular Biology of
Seed Development, B.A. Larkins, and I.K. Vasi, (eds.) , Kluwer Academic
Publishers.pp. 545-592.
Harada, J. J. (1999) . Signalling in plant embryogenesis, Curr. Opin . Plant Biol. 2, 23-27.
Harada, J. J. (2001). Role of Arabidopsis Leafy Cotyledon gene in seed development.
J. Plant Physiol., 158: 588-589.
29
•
Capitulo 1
Halperln, W., and Wetherell, D.F. (1964) . Adventive embryony in tis- sue cultures of
the wild carrot, Daucus carota. Am. J. Bot. 512, 274-283.
Hecht, V., Vielle-Calzada, J.-P., Hartog, M. V., Schmidt, E. D. L., Grossniklaus, U., de
Vries, S. C. (2001). The Arabidopsis somatic embriogénesis receptor kinase 1
gene is expressed in developing ovules and embryos and enhances embyogenic
competence in culture, Plant Physiol. 127, 803-816.
Henry, l. M., Mandoli, D. F. (2003). Precious cells contain information en: Methods in
Molecular Biology, vol 236; Plant functional genomics methods and protocols.
Edited by Grotewold Erich, Humana Press, NJ, pp . 59-78.
Hriibová, E., Dolezenová, M., Town, C. D., Macas, J., Dolezel, J. (2007). lsolation and
characterization of the highly repeated fraction of the banana genome.
Cytogenetics and Genome Research 119, 268-27 4.
Horry, J.P., Ortiz, R., Arnaud, E., Crouch, J.H., Ferris, R. S. B., Jones, D. R., Mateo,
M., Picq, C., Vuyleske, D. (1997). Banana and Plantain. In D. Fuccillo; L. Sears; P.
Stepleton (eds.) Biodiversity in Trust. Conservation and use of plant genetic
resource in CGIAR centres. Cambrige University Press. Cambrige UK. pp 67-81.
Huang, X., Yan, X., Tang, J., Kai, J., Mei, X., Xiao, W., Ping, Y., Feng, Y., Lin, X.,
(2010) . MaSERK1 Gene Expression Associated with Somatic Embryogenic
Competence and Disease Resistance Response in Banana (Musa spp.), Plant Mol
Biol Rep, 28, 309-316,
Hu Xiong L., Yang, Y. (2005). Rice SERK1 gene positively regulates somatic
embryogenesis of cultured cell and host defense response against uring infection,
Planta, 222, 107-117.
INIBAP: lnternational Network for the lmprovement of Banana and Plantain.
URL:http//www.inibap.org. Enero, 2011
30
•
Capitulo 1
lkeda, M., Umehara, M., Kamada, H. (2006). Embryogenesis-related genes; lts
expression and roles during somatic and zygotic embryogenesis in carrot and
Arabídopsís, Plant Bíotechnology 23, 153-161 .
Kamada, H. (1980) . Control in vitre asexual embryogenesis in higher plants. Chem. Reg.
plants 15, 62-78.
Kamada, H. (1996) . Physiological and molecular biological studies on somatic
embriogenesis. Che m. Reg. Plants 31 .1-11 .
Kamaté, K., Brown, S., Durand, P., Bureau, J. M.; De Nay, D., Trinh, T. H. (2000).
Nuclear DNA content and base composition in 28 taxa of Musa. Genome 44, 622-
627.
Kreuger, M., van Holst G.-J. (1993). Arabinogalactan proteins are essential in somatic
embryogenesis of Daucus carota L. Planta 189, 243-248.
Lescot, T. (2006). Banana in figures, the world's favorite fruit. Fruítrop 140, 5-9.
Li, G., Quiros, C. F. (2001). Sequence-related amplified polymosphism (SRAP), a new
marker system base on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene
tagging in Brassíca. Theor. Appl. Genet. 103, 455-461.
Li, G., Gao, M., Yang B., Quiros C. F. (2003). Gene for gene alignment between the
Brassica and Arabidopsis genomes by direct transcriptome mapping. Theor Appl
Genet. 107:168-180.
Lin, X., Kaul, S., Rounsley, S., Shea, T., Benito, M. l. (1999). Sequence and analysis of
chromosome 2 ofthe plant Arabidopsis thalíana. Nature, 402: 761-767.
Liang, P., Pardee, A. B. (1992) . Differential display of eukaryotic inessenger RNA by
means of the polymerase chain reaction . Science 257: 967-971 .
Liu, L., Xiaoju n, M., Jianhe, W., Jiaming, Q., and Changming, M. (2011) . The first
genetic linkage map of Luohanguo (Síraítía grosvenoríí based on ISSR and SRAP
markers) Genome 54, 19--25.
31
•
Capitulo 1
Lotan, T., Ohto, M., Yee, K. M., West, M. A. L., Lo, R., Kwong, R. W., Yamagishi, K.,
Fisher, R. L., Goldberg, R. B., Harada, J. J. (1998) . Arabidopsis Leary cotyledon
1 is sufficient to induce embryo development in vegetative cells , Cell 93,1195-1205.
LuerBen, H., Kirik, V., Herrmann, P., Misera, S. (1998). FUSCA3 encodes a proteína
with a conserved VP1/ABI3-Iike 83 domain which is of functional importante for the
regulation of seed maturation in Arabidopsis thaliana, Plant J. 15, 755-764.
Lysák, M. A., Dolezenova, M., Horry, J.P., Swenen, R., Dolezel, J. (1999) . Flow
cytometric analisys of nuclear content in Musa. Theoretical and Applied Genetics
98, 1344-1350.
McGahan, M. (1961). Studies of the seed of banana: Anatomy of the seed and embryo of
Musabalbisiana. Ame. J.of Bot. 48, 230-238.
Meudt, H. M., Clarke A. C. (2007). Almost forgotten or latest practice? AFLP,
applications, analyses and advantages. Trends in Plants Sci. 12, 106-117.
Mowla, S., Cuypers, A., Driscoll, S., Kiddle, G., Thomson, J., Foyer, C., Theodoulou,
F. (2006). Yeast complementation reveals a role for an Arabidopsis thaliana late
embryogenesis abundant (LEA)-Iike protein in oxidative stress tolerance, Plant J.
48, 743-756.
Nabors, M, W., Heyser J. W., Dykes T. A., DeMott K. J., (1983). Long-duration, high
frequency plant regeneration from cereal tissue cultures. Planta 157:385-391 .
Namasivayam P. (2007) . Acquisition of embryogenic competence turing somatic
embryogenesis. Plant Cell Tiss Organ Cult 90:1-8
Orozco-Santos, M., Farías-Larios, J., Manzo-Sánchez, G., Guzmán-González, S.
(2001 ). La Sigatoka negra (Mycospharel/a fijiensis) en México. INFOMUSA Vol.
10(1) 33-37.
Passarinho, P. A., van Hengel, A. J., Fransz P. F., de Vries S. C. (2001) . Expression
pattern of the Arabidopsis thaliana AtEP3/AtchitiV endochitinase gene, Planta 212,
556-567.
32
•
Capitulo 1
Pillay-Tenkouano, M. A., Ude, G., Ortiz, R. (2004) . Molecular Characterization
of Genomes in Musa and its Aplications. En Banana lmprovement: Ce/fular,
Molecular Biology, and lnduced Mutations. Jain, S. M.; Swennen R. , Eds.
SP: Enfield (NH) , USA, pp 271-283.
Reinert, J. (1958) . Morphogenesis and control of tissue culture from carrots . Natural
Sciences, 45, 344-345.
Rensing, S.A, Lang, D., Schumann, E., Reski, R., Hohe, A (2005) . EST sequencing . from embryogenic Cyclamen persicum cell cultures identifies a high proportion of
transcripts homologous to plant genes involved in somatic embryogenesis, J. Plant
Growth Regul. 24, 102-115.
Reverse Transcription System, Technical Bulletin , Promega, corp. A3500, pp.1-7,
2009.
Rojas-Herrera, R. , Loyola, V. M. 2002. lnduction of a class 111 acidic chitinase in a foliar
explants of (Coffea Arabica L. during somatic embryogenesis and wounding . Plant
Science.
Roux, N.S., Strosse, H., Toloza, A., Panis, B., Dolezel, J. (2004) . Detecting ploidy
level instability of banana embryogenic suspension cultures by flow cytometry. In:
Banana lmprovement. S. M. Jain (Eds.), Cellular Molecular Biology and lnduced
Mutagenesis. Swennen R. Scientific Publishers lnc. pp. 251 -261.
Roux, N., Baurens, F. C., Dolezel, Hribová, J., Heslop-Harrison, E. J. S.; Town, C.,
Sasaki, T., Matsumoto, T., Aert, R., Remy, S., Souza, M. P. (2008) . Genomics of
banana and plantain (Musa spp.) , Majar staple crops in the tropics . In: P. Moore; R.
Ming (eds.) Genomics of Tropical Crops Plants. Plant Genetics and Genomics.
Crops and Models Vol. 1, Springer, New York. Pp. 83-111 .
SAGARPA, Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural , Pesca y
Alimentación, Boletín de Noviembre, 2007.
33
•
Capitulo 1
Salaj, J., von Recklinghausen, l. R., Hecht,V., deVries, S. C., Schel, J. H. N., and van
Lammeren, A. M. (2008). AtSERK1 expression precedes and coincides with early
somatic embryogenesis in Arabidopsis tha/iana . Plant Physiol. Biochem. 46: 709-
714.
Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. (1977) . DNA sequencing with chainterminating
inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 74:5463-5467.
Santa-Catarina, C., Hanai, L. R., Domelas, M. C., Viana, A. M., Floh., E. l. S. (2004) .
SERK gene homolog expression, polyamines and amino acids associated with
somatic embryogenic competence of Ocotea catharinensis Mez. (Lauraceae) , Plant
Cell Tiss. Org. Cult. 79, 53-61 .
Santos Mendoza, M., Dubreucq B., Baud S., Parcy, F., Caboche M., and Lepiniec, L.
(2008) . Deciphering gene regulatory Networks that control seed development and
maturation in Arabidopsis . Plant J. 54, 608--620.
Shah, H., Gadella, T. W.J., van Erp, H., Hecht V., de Vries, S. C. (2001) . Subcellular
localization and oligomerization of the Arabidopsis thaliana somatic embriogénesis
receptor kinase 1 protein. J Mol Biol 309, 641--655
Shiota, H., Satoh, R., Watabe, K., Harada, H., Kamada, H. (1998). C-ABI3, the carrot
homologue of the Arabidopsis ABI3, is expressed during both zygotic and somatic
embryogenesis and functions in the regulation of embryo specific ABA-inducible
genes, Plant Cell Physiol. 39, 1184-1193.
Sholi, N. J. Y., Chaurasia A, Agrawal A, Bhalla SN (2009) . ABA enhances plant
regeneration of somatic embryos derived from cell suspension cultures of plantain
cv. Spambia (Musa sp.). Plant Cell Tissue Organ Cult. Online first,
doi: 10.1007 /s 11240-009-9585-z.
Simmonds, N. (1962). The evolution of the bananas, Longmans, London , 1962, 170 pp.
Schmidt, E. D. L., Guzzo, F., Toonen, M. A. J., de Vries, S. C. (1997) . A leucine-rich
repeat containing receptor-like kinase marks somatic plant cells competent to form
embryos. Development 124: 2049-2062.
34
•
Capitulo 1
Somleva, M.N., Schmidt, E. D. L., de Vries, S. C. (2000) Embryogenic cells in Dactylus
glomerata L. (Poaceae) explants identified by cell trucking and by SERK
expression, Plant Cell Rep. 19,718-726.
Sterk, P., Booij, H., Schellekens, G. A., van Kammen, A., de Vries, S. C. (1991).
Cell-specific expression of the carrot EP2 lipid transfer protein gene, Plant Cell 3,
907-921.
Steward, F. C., Mapes, M. O., Mears, K. (1958). Growth and organized development of
culture cell . 11. Orgenization of cultures grown from freely suspended cell. Am. J.
Bot. 45, 705-708.
SuperScript 11, Reverse Transcriptase. lnvitrogene, Life technologies, Cat. 18064-014,
pp. 1-4, 2003.
Termin, H. M., Mizutani, S. (1970) . RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous
sarcoma virus. Nature 226, 1211-1213.
Thomas, C., Meyer, D., Himber, Ch., Steinmetz, A. (2004). Spatial expression of a
sunflower SERK gene during induction of somatic embriogénesis and shoot
organogenesis, Plant Physiol. Biochem. 42, 35-42.
Valdez-Ojeda, R., Hernandez J. L., Aguilar, M., Rivera, R., Quiros, C. F. 2008.
Assesing morphological and genetic variation in annato (Bíxa ore/lana L.) by
sequence related amplyfied polymorphis and cluster annalisys. Hort Science 43,
2013-2017.
Valdez-Ojeda, R., Quiros, C.F., Aguilar, M., Rivera R. 2010. Outcrossing rates in
annato determined by sequence related amplifiéd polymorphism. Agromomy
journal 1340-1345.
Van Hengel, A.J., Tadesse, Z., lmmerzeel, P., Schols H., van Kammen, A., de Vries,
S. C. (2001). N-acetylglucosamine and glucosamine-containing arabinogalactan
proteins control somatic embryogenesis, Plant Physiol. 125, 1880-1890.
Varmus, H., in Weiss, R., Teach, N., Varmus, H., Coffin, J. (1985) . RNA Tumor
Viruses 2/Supplements and Appendixes, Cold Spring Harbar Laboratory, pp. 79-80.
35
•
Capitulo 1
Verma, l. M. (1977). The reverse transcriptase. Biochem. Biophys. Acta 473, 1-38.
Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., Van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A.,
Pot J., Pelem, J., Kuiper, M., Zabeau M. (1995). AFLP: a new technique for DNA
fingerprinting . Nucleic Acid Res. 23, 4407-4414.
Williams, E. G., Maheswaran, G. 1986. Somatic Embryogenesis:Factors influencing
coordinated behaviour of cells. Annals of Botany 57:443-462.
Welsh, J., Chada, K., Dalal, S. S., Ralph, D., Cheng, R., McCielland, M. (1992).
Arbitrarily primed PCR fingerprinting of RNA. Nucl Acids Res 20, 4965-4970.
Wu, J., Li , Y., Wang, A., Yang, L., Yang, L. (2010). Differential Expression Analysis of
Gibberellin-lnduced Stem Elongation Genes in Sugarcane by cDNA-SRAP.
Scientia Agricultura Sinica. 43, 19 (Idioma Chino).
Yang, X., Zhang, X. 201 O. Regulation of Somatic Embryogenesis in Higher Plants.
Critica! Reviews in Plant Sciences. 29: 1, 36-57.
Youssef, M., James, A., Mayo-Mosqueda, A., Ku-Cauich, J. R., Grijalva R., and
Escobedo-Gracia Medra no, R. M. (201 O) . lnfluence of genotype and age of
explant source on the capacity for somatic embryogenesis of two Cavendish
banana cultivars (Musa acuminata Colla, AAA). African Journal of Biotechnology
Vol. 9(15), pp. 2216-2223.
Youssef, M., James, A. C. Rivera-Madrid, R., Ortiz R., Escobedo-GraciaMedrano, R.
M. (2011). Musa Genetic Diversity Revealed by SRAP and AFLP. Mol Biotechnol.
47:1 89-199.
Zaefizadeh, M., & Goliev, R. (2009). Diversity and relationships among durum wheat
landraces (subconvars) by SRAP and phenotypic marker polymorphism . Research
Journal of Biological Sciences, 4, 960-966.
Zimmerman, J. L. (1993). Somatic embryogenesis: A model for early development in
higher plants. Plant Cell5, 1411-1423.
36
•
Capitulo 1
Zuo, J. R., Niu Q. W., Frugis G., Chua N.H., (2002). The WUSCHEL gene prometes
vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis. Plant J. 30: 349-359.
37
•
Capitulo 11
CAPITULO 11
MATERIALES Y MÉTODOS
AMPLIFICACIÓN DE cDNA-SRAP
En este capítulo se detallan los procedimientos para el establecimiento de un
protocolo de extracción de RNA total, el procedimiento para el desarrollo del cDNA
SRAP y su análisis mediante electroforesis en gel de secuenciación .
2.1 MATERIAL BIOLÓGICO.
El material biológico utilizado para la extracción de RNA total , consistió de: i)
Tejido de hoja cigarro (H), de los cultivares AAA, Williams (W) y Enano Gigante (EG)
de Musa acuminata, grupo Cavendish (plantas procedentes de cormos donados por el
Sr. Don José Salazar y Salazar propietario de la Finca Dolores, carretera
Villahermosa-Teapa, Tabasco, México), y de la especie seminífera AA, Musa
acuminata Colla subespecie malaccensis (Mam), tipo Selangor (accesión con numero
de ITC 1060, de la Colección Banano y Plátano del Centro 1 nternacional de Tránsito
con sede en la Universidad Católica de Leuven, Bélgica), éste se colectó de plantas
jóvenes y sanas con 1 (H) + 4 hojas expandidas, crecidas bajo condiciones de
invernadero en el Centro de Investigación Científica de Yucatán; el tejido de H sirvió
como control de tejido no-embriogénico en el análisis de transcritos de la
embriogénesis de Musa spp.; ii) Tejido embriogénico, dé callo embriogénico (CE), CE
con expresión de embriones (CEE), y embriones somáticos (ES), generado del cultivo
in vitro de flores masculinas jóvenes de los cultivares W y EG genoma AAA, y de
embriones cigóticos inmaduros (75 dpa) del genotipo AA de Mam ; y iii) embrión
cigótico (EC) de edad de 75 días posteriores a la antesis (dpa) , el EC fue extraído de
semillas de los frutos colectados de plantas de Mam tipo Selengor, crecidas en el
Banco de Germoplasma de Banano y Plátano que tiene el Centro de Investigación
Científica de Yucatán (CICY) que se ubica a los 20° 24' 40.1 0", Lat. N., y los
89°45'24.90" Long . W., a una altitud de 8 msnm., en el Campo Experimental del
39
•
Capitulo JI
Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP)
Uxmal, Mpo. Muna, Yucatán .
El muestreo del tejido de hoja joven de plantas de los genotipos antes
señalados consistió en colectar una sección del ápice de la hoja cigarro, se depositó
en bolsas de plástico Ziplock debidamente etiquetadas, el material se colocó dentro de
una nevera con refrigerante y se transportó al laboratorio. El material biológico
colectado se desinfectó con una solución de cloro al 0.20%' (v/v) y 1 mi detergente
líquido comercial y etanol al 70% (v/v); la lámina foliar se lavó primeramente con el
cloro y detergente líquido, seguido por un lavado con etanol (1 minuto de duración de
lavado por cada paso) y por último se enjuagó perfectamente con abundante agua
bidestilada. Se eliminó el exceso de agua con papel absorbente, seguidamente se
pesaron las muestras de 100 mg de tejido de cada muestra, para hacer un total de 1 O
sub-muestras por planta; el material pesado se envolvió en papel aluminio
previamente etiquetado, se congeló con nitrógeno líquido y el material congelado se
almacenó a -80° e en Ultra-congelador hasta su uso para la extracción del RNA total.
Los tej idos embriogénicos de CE, CEE, ES, procedentes de cultivos in vitro
generados por Youssef et al., 201 O, y Burgos, 201 O, se propagaron como se describe
en el inciso 2.1.1 . El muestreo del material biológico se realizó bajo condiciones de
esterilidad en campana de flujo laminar; la colecta de CE, CEE y ES fue a los 15 días
después de haber renovado el medio de cultivo; mientras que los embriones cigóticos
se extirparon de semillas extraídas de frutos de edad de 75 dpa, colectados de plantas
de M. a. m tipo Selengor crecidas en campo. Para ello porciones de 100 mg de cada
uno de los tejidos embriogénicos descritos, fueron transferidas a tubos de 1.5 mL
estériles debidamente etiquetados, e inmediatamente, se congelaron con Nitrógeno
líquido material biológico, y almacenó a -80° e hasta su uso para la extracción de
RNA total.
2.1.1 PROLIFERACIÓN DE CALLO EMBRIOGÉNICO.
Los callos embriogénicos se proliferaron en medio de cultivo, M1/30 para el
genotipo M. a. m., y M1/60, para W y EG, respectivamente, basado en Navarro et al.
1997. El medio contiene la 1/2 de la fuerza iónica de las sales de MS, Murashige and
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Capitulo 11
Skoog (1962), suplementado con vitaminas de Morel (1950) (Morel et al., 1950), 4.5
IJM de 2-4 O, 200 mg/L de KH2P04, 174 mM de sacarosa (348 mM para W y EG), el
pH del medio se ajustó a 5.8, se aforó y añadió con 2 g/L del gelificante (Gelrite). El
medio de cu lt ivo se dosificó a razón de 25 mi de medio por cada frasco de vidrio de
100 mL de capacidad (Gerber), los frascos se cubrieron con tapas plásticas, y el
material se esterilizó en autoclave a 120°C x 20 min. El medio de los cultivos se
renovó alrededor de cada 30 días. Las condiciones de cultivo fueron de 25 ± 2oc y
oscuridad.
2.2 SÍNTESIS DE cONA MEDIANTE LA TRANSCRIPCIÓN INVERSA DE LA
POLI M E RASA (RT -PCR)
La enzima transcriptasa inversa (RT) , es utilizada para sintetizar cONA a partir
de la molécula de mRNA, para lograr este procedimiento se requiere que el RNA total
sea de buena calidad para estandarizar el protocolo de síntesis de cONA.
2.2.1 EXTRACCIÓN DE RNA.
Para la extracción de RNA total se siguió el protocolo de Chomczynski and
Sacchi (1987) con algunas modificaciones, como se describe detalladamente en el
Anexo No. 1; cuidando en todo momento de utilizar material de porcelana , vidrio y
plástico libre de ONasa/RNasas. El protocolo de extracción de RNA se aplicó para los
tejidos de CE, CEE, ES y H de los genotipos W y EG, así como para Mam tipo
Selangor, del que además utilizó tejido de EC. El RNA total extraído se cuantificó
mediante espectrofotometría de UV utilizando una dilución de 2 IJL de RNA total en
248 IJL agua bidestilada estéril, y lecturas a longitudes de onda de 230 nm
absorbencia mínima de ácidos nucléicos, 260 nm absorbencia máxima para ácidos
nucléicos (pirimidinas), 280 nm absorbencia máxima para ácidos nucléicos (purinas),
320 nm para la corrección del ruido de fondo debido a que ni los ácidos nucléicos ni
las proteínas absorben a esta longitud de onda. Si la muestra de RNA total tiene una
absorbencia de 1 a 260 nm, contiene alrededor de 40 ng/IJL de RNA, si la relación de
absorbencia a 260/280 es de 2.0 se cuenta con ARN puro, si la proporción es menor
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Capitulo 11
de 1.7 indica que probablemente existe contaminación en la solución , generalmente
por proteínas o fenoles, mientras que para la relación 260/230 indica contaminación
por polisacáridos o polifenoles (lectura entre 1.0 hasta 1.9) (Stulnig & Amberger,
1994). La integridad del RNA extraído se analizó en un gel de agarosa al 1.0%. El gel
se cargó con 1 IJI RNA total más 2 IJI de amortiguador de carga. Se corrió con
amortiguador, 1X T AE a 80 volts durante 30 minutos. Después de la corrida se verifico
la integridad de las bandas con la ayuda de un foto-documentador BioRad®.
2.2.2 TRANSCRIPCIÓN INVERSA DE LA POLIMERASA.
El RNA total utilizado como molde para la síntesis de cONA requiere estar libre
de DNA para evitar su amplificación en las reacciones subsiguientes. Por ello antes de
la síntesis del cONA, el RNA total se trató con DNasa libre de RNasa
(Deoxiribonucleasa 1, grado amplificación, de lnvitrogen Cat. No. 18068-015)
siguiendo las instrucciones del proveedor. En breve, la reacción se realizó en un
volumen total de 1 O IJL, conteniendo: 1 ¡.Jg de RNA total, 1 IJL del amortiguador de
reacción 1 OX DNase 1, 1 UIIJL de DNase 1 (grado de amplificación), y agua libre de
DNasa/RNasas, seguidamente se incubó la reacción a temperatura ambiente durante
15 minutos, luego, se adicionó 1 IJL de 25 mM EDTA y se incubó a 65° C durante 10
minutos para desactivar la enzima DNase 1.
2.2.3 REACCIÓN DE SÍNTESIS DE cONA.
Subsecuentemente, para la síntesis de la primera hebra de cONA se utilizó
los 250 ng del RNA total tratado con DNasa 1, 2.5 ¡.Jg de Oligos (dT) o Cebadores
Aleatorios (SuperScript 11 , lnvitrogen, 2003) ; junto con 2.5 mM de dNTPs y se incubó a
65 o e durante 5 minutos. Seguidamente se adicionó, 1X de Amortiguador de enzima
transcriptasa reversa, 0.01 mM de DDT, 0.5 IJI de lnhibidor (RNA Out) y 0.45 u/IJI de
enzima transcriptasa reversa , La mezcla se incubó a 42° C durante 60 minutos y la
actividad enzimática se inactivó a 70° e durante 15 minutos, se transfirió
inmediatamente a 4° e y se almacenó a -80° e hasta su uso (Anexo 2). El cONA
42
•
Capitulo JI
sintetizado se cuantificó con espectrómetro, utilizado 2 iJL cONA en 248 iJL de agua
bidestilada estéril y lecturas a longitudes de onda de 260 y 280 nm.
2.3 AMPLIFICACIÓN DE UN FRAGMENTO DEL GEN RNAr 185 A PARTIR
DE cONA.
Después de la síntesis de la primera hebra del cONA, se amplificó un
fragmento del gen constitutivo RNAr 18S de tamaño esperado de 200 pb , para ello la
reacción en un volumen total de x !JI consistió de: 5 ng de cONA, 0.08 mM de dNTPS,
1 X' de Amortiguado de PeR, 1.4 mM de Mgel2, 0.8 mM de cebador 18'S sentido 5'
eGGeTAeeAeATeeAAGGAA-3' y antisentido 5'-GeTGGAATTAeeGeGGeT-3 ',
0.25 U Taq ONA polimerasa. Las condiciones de programación de PeR inician con un
ciclo a 94 o e por 30 segundos, 20 ciclos a 94 o e por 30 segundos, 60° e por 20
segundos, y 72° e por 30 segundos, una extensión final de 72° e por 7 minutos.
2.4 REACCIÓN PARA LA OBTENCIÓN DE cDNA-SRAP's.
Para la realización del cONA-SRAP, se utilizó como templado 25 ng de cONA,
junto con 1X de Amortiguador de PeR, 0.25 mM de dNTPs, 4 mM de Mge12, 0.8 pmol
de cada cebador SRAP (cuadro 2.1) sentido y antisentido y 0.625 U (0.25 IJL) Taq
ONA polimerasa. Las condiciones de programación de PeR contó con un ciclo inicial
a 94° e por 3 min, 5 ciclos a 94° e por 1 min, 35° e por 1 min , y 72° e por 1 min,
seguidamente de 35 ciclos a 94° e, por 1 min, 50° e por 1 min, y 72° e por 1 minuto y
una extensión final de 72° e por 5 minutos. En la tabla 2.1, en negritas se presentan
los cebadores sentido y antisentido utilizadas para la realización de las combinaciones
utilizadas en el trabajo previo de Youssef et al., 2011, en el mismo cuadro se presenta
con asterisco (*) los cebadores utilizados por Li & Quiros, 2001.
43
•
Capitulo JI
Cuadro 2.1. Secuencias de los cebadores sentido y antisentido utilizados en la selección de
combinaciones para el análisis mediante cDNA-SRAP. Negrita: Cebadores utilizados por
Youssef et al., 2011 * después de por Li and Quiros, 2001. Me, cebadores sentido; Em ,
Antisent ido.
Código Secuencia del cebador Código Secuencia del cebador Me-1* 5'- TgAgTCCAAACCggATA -3' Em-1* 5'- gACTgCgTACgAATTAAT -3' Me-2* 5'- TgAgTCCAAACCggAgC -3' Em-2 5'- gACTgCgTACgAATTTgC -3' Me-3* 5'- TgAgTCCAAACCggAAT -3' Em-3* 5'- gACTgCgTACgAATTgAC -3' Me-4 5'- TgAgTCCAAACCggACC -3' Em-4 5'- gACTgCgTACgAATTTgA -3' Me-5 5'- TgAgTCCAAACCggAAg -3' Em-5* 5'- gACTgCgTACgAATTAAC -3' Me-6 5'- TgAgTCCAAACCggTAg -3' Em-6* 5'- gACT gCgT ACgAA TT gCA -3' Me-7 5'- TgAgTCCAAACCggTTg -3' Em-7 5'- gACTgCgTACgAATTATg -3' Me-8 5'- TgAgTCCAAACCggTgT -3' Em-8 5'- gACTgCgTACgAATTAgC -3'
Em-9 5'- gACTgCgTACgAATTACg -3'
Em-10 5'- gACTgCgTACgAATTTAg -3'
2.5 ELECTROFORESIS EN GEL DE SECUENCIACIÓN EN ACRILAMIDA
AL 6% DESNATURALIZANTE.
Los fragmentos derivados de transcritos (TDFs) generados de la amplificación
descrita en el inciso 2.4, son separados mediante electroforesis en gel de acrilamida
desnaturalizante (Li & Quiros, 2001 , Choochai & Padrit, 2007; Gui et al., 2009). El
anexo No. 3, se detalla el protocolo para la elaboración del gel de acrilamida, montaje
y parámetros de la electroforesis; una vez terminado este proceso puede ser
visualizado mediante una tinción con nitrato de plata (Bassam et al., 1991).
2.6 ANÁLISIS DE cDNA-SRAP.
Con el propósito de evaluar el polimorfismo de TDFs entre los genotipos
evaluados de Musa, se construyó un dendograma, con los datos de cada locus
(juego de cebadores), que fueron registrados de los geles de poliacrilamida
desnaturalizante y transformados a una matriz en formato binario . La presencia de la
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•
Capitulo 11
banda (alelo) es representada por la unidad (1) y su ausencia por el cero (O) ; es decir,
en los geles obtenidos se contó las presencias y ausencias para cada una de las
muestras incluidas en la evaluación (carriles) a lo largo del gel , es decir, la presencia o
ausencia de las banda amplificadas a distintos tamaños en pares de bases (pb)
tomando como referencia el marcador de peso molecular. El numero total de las
presencias (1) y ausencias (O) determinan el porcentaje de polimorfismo para cada par
cebador utilizado. De igual manera, los datos binarios se utilizaron para calcular el
coeficiente de similitud de Jaccard (J = (A + B - C)/C), (Jaccard, 1901), donde: A
representa el número de especies comunes con similitud A; B representa el número
de especies comunes con similitud B, y e representa el número de especies con
similitudes comunes a A y B; el análisis de agrupamientos se efectuó con dichos
estimadores mediante el método de UPGMA (Unweighted Pair-Group with Arithmetic
Mean, por sus siglas en inglés, o agrupamiento de pares no-ponderados con media
aritmética), empleando el software NTSYS versión 2.2; esto es, la similitud entre una
accesión a otra y así obtener eldendograma (Anexo 4) .
45
•
Capitulo JI
2. 7 BIBLIOGRAFÍA.
Bassam, B. J., Gaetano-Anolle's, G., Gresshoff, P. M. (1991). Fast and sensitive
silver staining of DNA in polyacrilam ide gels, Anal. Bíochem. 196, 80-83.
Burgos Tan , M. J. (201 O) . Estudio de la embriogénesis somática en Musa. Tesis de
Licenciatura de Químico Biólogo Bromatólogo, Facultad de Química, Universidad
Autónoma de Yucatán, (UADY). Pp. 77.
Clarke L. A., Amaral M. D. (2003) . An RNase-retarding solution for storage and
transport of cell samples prior to RNA extraction. Protocol for RNase-retarding
solution for cell samples. Provided through: The European Working Group on
CFTR Expresión .
Chomczynski, P., Sacchi, N. (1987). Single step method of RNA isolation by
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction , Anal. Biochem. 162:156-
159.
Choochai, N., Padrit, P. (2007). Detection responsive gene in KDML, 105 rice (Oryza
satíva L.) using cDNA-SRAP technique. Nat Sci.41 :651-659.
Frost, M. R., Guggenheim, J. A. (1999). Prevention of depurinitation elution facilitates
the reamplification of DNA from differential display gels. Nucleíc Acíds Research,
27, 1-4.
Gui, Q., Wang, J., Xu, Y., Wang, J. (2009). Expression Changes of Duplicated Genes in
Allotetraploids of Brassíca Detected by SRAP-é:DNA Technique, GENOMICS,
TRANSCRIPTOMICS, PROTEOMICS. Mo/eku/yarnaya Bío/ogíya, Vol. 43, pp. 3-9.
Jaccard, P. (1901). Étude comparative de la distribution florale dans une portian des
Alpes et des Jura. Bulletin del la Société Vaudoise des Sciences Naturelles 37,
547-579.
Musashine, T., Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco tissue culture. Physiol Plant 15: 4 73-497.
46
•
Capitulo 11
Morel, G., Wetmore, R. H. (1951 ). Tissue culture of monocotyledos. American Journal of
Botany 38: 138-140.Navarro, C., Escobedo, R. M., A. Mayo, In Vitro plant
generation from embryogenic cultures of a diploid and triploid , Cavendish banana.
Plant Cell Tissue and Organ Culture. 51 :17-25, 1997.
Li, G., Quiros, C. F. (2001). Sequence-related amplified polymosphism (SRAP) , a new
marker system base on a simple PCR rraction : its application to mapping and gene
tagging in Brassica. Theor. Appl. Genet. 103, 455-461.
Deoxyribonuclease 1 amplification grade, lnvitrogene, Life technologies, Cat. 18068-
015, 2003.
Reverse Transcription System, Technical Bulletin , Promega, corp. A3500, pp.1-7,
2009.
SuperScript 11, Reverse Transcriptase. lnvitrogene, Life technologies, Cat. 18064-014,
pp. 1-4, 2003.
Stulnig, T. M., Amberger, A. (1994). Exposing contaminating phenol in nucleic acid
preparations, BioTechniques 16, 403-404,
Youssef, M., James, A., Mayo-Mosqueda, A., Ku-Cauich, J. R., Grijalva R. , Rosa
Grijalva-Arango2 and Escobedo-Gracia Medrano, R. M. (201 O). lnfluence of
genotype and age of explant source on the capacity for somatic embryogenesis of
two Cavendish banana cultivars (Musa acuminata Colla, AAA). African Journal of
Biotechnology Vol. 9(15), pp. 2216-2223.
Youssef, M., James, A. C. Rivera-Madrid, R., Ortiz R.,· Escobedo-GraciaMedrano,
R. M. (2011) . Musa Genetic Diversity Revealed by SRAP and AFLP. Mol
Biotechnol. 47:189-19.
47
•
Capitulo 111
CAPÍTULO 111.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
POLIMORFISMO DE TRANSCRITOS MEDIANTE cDNA-SRAP.
En este capítulo se presentan los resultados y discusión del trabajo relacionado
con la estandarización de la técnica de cDNA-SRAP, y el análisis de los transcritos
de genes que se expresan en diferentes estadios de la embriogénesis somática , y en
tejido joven de hoja, de tres genotipos de Musa spp.
3.1 PROLIFERACIÓN DE CALLO EMBRIOGÉNICO.
La figura 3.1 (A-D), presenta imágenes de la morfología macroscópica del callo
embriogén ico con expresión de embriones, CEE, de M. a. ssp., ma/accensis tipo
Selangor (A), y de Musa acuminata Cavendish cv. Williams (B), así como de la semilla
y el embrión cigótico inmaduro de alrededor de 75 dpa del primer genotipo, incisos e y D, respectivamente. En general, después de 3 a 5 meses de permanecer en un
medio de inducción, el tejido de embrión cigótico inmaduro forma un callo de aspecto
friable con porciones de coloración amarillo fuerte sobre el cual se desarrolla callo
embriogénico, CE; en el caso de las flores masculinas inmaduras, el CE se desarrolla
directamente de un callo blanco-cremoso, ambos callos embriogénicos son de
apariencia friable con pequeños agregados translucidos y de coloración blanca esto
sucede con el cambio de un medio de inducción a uno de proliferación (comunicación
personal de Youssef, y Burgos), y se asocia con la reducción de la presión de la
auxina (Navarro, et al., 1997). Con los sucesivos sub-cultivos aun en presencia de
auxina, se multiplica el CE, y con el tiempo se manifiesta pequeños embriones
somáticos globulares, este tipo de callo es el denominado, callo embriogénico con
expresión de embriones somáticos, CEE, y de este · se desarrollarán los embriones
somáticos ES, estos ES muestran mayor grado de diferenciación ya que en ellos se
puede observar la hendidura cotiledonaria e incluso la emersión de la plúmula, y un
cambio de color de translucidos a blanco como se observan en la figura 3.1, B.
49
•
Capitulo 111
Fig. 3.1. A, Callo con producción de embriones de Musa acuminata ssp., malaccensis tipo Selangor
AA. B, Callo con producción de embriones Musa acuminata Cavendish Williams AAA. C, Semilla de
Musa acuminata ssp., malaccensis tipo Selangor AA. D, Embrión cigótico de Musa acuminata ssp.,
malaccensis tipo Se/angor AA.
3.2 EXTRACCIÓN DE RNA TOTAL.
El RNA total de los tejidos de callo embriogénico (CE) , callo con expresión de
pro-embriones y embriones globulares translucidos (CEE), embrión somático (ES) y de
hoja joven de M. acuminata Cavendish AAA cultivares Williams y Enano Gigante,
además de embrión cigótico (EC) de M. acuminata Colla ssp. , malaccensis tipo
Selangor AA se extrajo siguiendo el protocolo reportado por Chomczynski and Sacchi,
1987, con modificaciones (Anexo1). bebido a que el tejido de CE de plátano es rico en
polisacáridos, y en particular, el tejido el CE y de hoja del cultivar Williams contiene
gran cantidad de polifenoles, la modificación al protocolo original consistió en
incrementar la razón 1:1 de tejido: volumen del reactivo Trizol a la de 1 :4 durante la
extracción del RNA total. Esta modificación se reflejó en la obtención de pastillas de
RNA total transparentes, fáciles de solubilizarse en agua ultra pura, que al visualizarse
en gel de agarosa se logra observar la presencia de RNA de buena calidad. La figura
3.2, presenta una electroforesis en gel de agarosa al 1%, donde se puede apreciar la
so
•
Capitulo 111
integridad del RNA total extraído de los tejidos de callo embriogénico, carril 1: M. a. m.
tipo Selangor AA, carril 2: M. a. cv. Enano Gigante AAA, carril 3: M. a. cv. Williams
AAA y carri l 4: embrión cigótico de M. a. m., tipo Selangor AA, adviértase que la banda
mas anódica tiene casi el doble de intensidad que la mas catódica, y representan a los
RNA ribosomales 25S y 18S, respectivamente (Martín et al. 1983).
25 S 18 S
¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡
--
2
-
3 4
-· -... ... Fig. 3.2. Electroforesis en gel de agarosa 1% de RNA total de tejido de callo embriogénico de
Musa . Carril, 1: M. a. m. tipo Selangor AA; 2, M. a. cv. Enano Gigante AAA; 3: M. a. cv. Williams
AAA; y 4: embrión cigótico (75 dpa) de M. a. m., tipo Selangor AA.
Con el fin de probar que el RNA total extraído se encontraba libre de fenoles,
polisacáridos y proteínas, y de conocer su concentración, se valoró este mediante
espectrofotometría. La concentración de RNA total varió de 670 a 1876 ng/j.JL según
el tipo de tejido y el nivel de ploidia del genotipo en cuestión, siendo la relación
260/280 nm;::: 1.8, y la relación A260/230nm de 1.7-1.8 (Anexo 5, A y 8) .
3.3 SÍNTESIS DE cONA POR TRANSCRIPCIÓN INVERSA (RT).
La síntesis de cONA a partir de tejido de material embriogénico y de hoja de
plátano se llevó a cabo como se describió en materiales y ·métodos y se resume en el
anexo 1. Para la estandarización de la metodología de síntesis del cONA, se probaron
cuatro concentraciones del RNA total, 100, 250 500 y 1000 ng, tratado con ONasa 1 y
sin tratar (datos no mostrados), extraído de callo embriogénico, CE, del cultivar
triploide AAA EG y de la especie diploide M.a.m., tipo Selangor, estas dos alternativas
fue para corroborar que la metodología de extracción de RNA total no extrajera
cantidades pequeñas de ONA. En la síntesis del cONA se utilizaron cebadores Oligos
dT, cuya función es unirse a la cola de poli (A) en el extremo 3' de la secuencia del
51
Capitulo 111
RNA mensajero (mRNA), el cebador proporciona un grupo OH libre necesario para
que la enzima RT pueda unir los nucleótidos y llevar a cabo la síntesis de la primera
hebra del cONA; alternativamente, se probó cebadores aleatorios (RP, random
primers), estos anclan aleatoriamente en secuencias del mRNA, otras de la cadena
de poli (A), mensajeros que se encuentran truncados. Para valorar la calidad del
cONA sintetizado se procedió a realizar la amplificación del gen constitutivo ribosomal
18S y el cONA-SRAP (véase incisos 3.4 y 3.5), previo a ello mediante
espectrofotometría se evaluó la concentración de los cONA's sintetizados; los valores
de concentración fluctuaron entre 400-1300 ng/¡JL, siendo algo similar entre los dos
tipos de iniciadores probados en la síntesis del cONA de cadena sencilla (Anexo 8, B) .
3.4 AMPLIFICACIÓN DE cONA PARA EL GEN CONSTITUTIVO 18'5.
La amplificación del gen constitutivo rRNA 18S a partir de cONA, confirmó que
el RNA total extraído era de buena calidad y que los cONA's de cadena sencilla fueron
sintetizados de manera eficiente, además de servir como prueba de amplificación para
los trabajos posteriores. En la figura 3.3., se aprecia la similitud en tamaño del
fragmento de -200 pb del gen 18S amplificado con el cONA sintetizado a partir de 250
ng de RNA total, los carriles 1-3 representan la amplificación del fragmento a partir del
cONA sintetizado con OligodT y los carriles 4-6 del cONA sintetizado con los RP's, que
proceden de tejido de callo embriogénico de M. a. m. tipo Selangor AA.
1000 pb
400 pb
200 pb
M 2 3 4 5 6
Fig . 3.3 Electroforesis en gel de agarosa 1.5%, productos de amplificación de cONA-188, de
callo em briogénico de M. a. m. tipo Selangor. Carriles : 1-3, cONA sintetizado con Oligo dT;
4-6, cONA sintetizado con R.P. M: Marcador de peso molecular Hipper Ladder 1, Bioline.
52
Capitulo 111
3.5 AMPLIFICACIÓN DEL cDNA-SRAP.
Después de corroborar la eficiencia del cONA sintetizado (inciso 3.4) , se
procedió a realizar la amplificación de transcritos utilizando cebadores SRAP. Primero
se probó el par de cebadores Me1- Em1 sentido y antisentido, respectivamente y
cómo templado el cONA, previamente sintetizado con Oligo-drs, cDNA-dT, y con
cebadores aleatorios, cDNA-RP. Dicho par de cebadores SRAP se seleccionó de
trabajos previos por ser informativo en el polimorfismo que detectado en Musáceas
(Youssef et al., 2011). En la figura 3.4, se presenta una electroforesis en gel de
agarosa 2.5% (porcentaje para obtener una mayor separación) , donde se observa el
cDNA-SRAP de doble cadena resultado de la amplificación, los carriles 1-4 presentan
el producto de la amplificación con cDNA-dT, nótese el barrido homogéneo y algunas
bandas evidenciando la amplificación de fragmentos, de mayor tamaño desde la parte
superior del gel y de menor tamaño en la parte inferior, según el genotipo del que se
extrajo el RNA, aquí se espera encontrar representados fragmentos completos,
cDNAs, que contengan el extremo 3'de genes. Asimismo, en los carriles 5 a 8 se
observó la amplificación de cDNA-SRAP cuando se utilizó cONA sintetizado a partir de
cebadores aleatorios, cDNA-RP, en este caso, los cDNA's representan fragmentos a
lo largo de la longitud del gen, de transcritos truncados e incluso fragmentos que
pueden ser cercanos al extremo 5' del gen; igualmente, en este caso los productos de
la amplificación de fragmentos cDNA-SARP, visualizados en el gel se relacionan con
el tejido y genotipo utilizado. En base a estas evidencias, se puede considerar que
con la enzima M-MLV RT utilizando cebadores oligo dT y/o cebadores aleatorios se
logran resultados consistentes de los fragmentos amplificados.
53
•
cDNA-SRAP Oligo-dT
cDNA-SRAP
Cebadores A
Capitulo 111
Fig . 3.4. Electroforesis en gel de agarosa al 2.5%, productos de amplificación de cDNA
SRAP. Carriles: 1 y 5, Callo embriogénico de EG, AAA, 2 y 6, Callo embriogén ico WT AAA, 3 y
7, Callo embriogénico Selangor AA, y, 4 y 8, Embrión cigótico de Selangor AA.
Con el fin de lograr una buena reproducibilidad en la técnica, se trabajó en
optimizar la amplificación del cONA-SRAP, probándose para ello diferentes
concentraciones de RNA total, 100, 250 500 y 1000 ng , para la síntesis de la primera
hebra de cONA, y se experimentó con diferentes concentraciones (25, 50, 250, 500 ng
cONA) de este templado para la amplificación de los cONA-SRAP de doble hebra,
estas combinaciones de concentraciones fueron probadas bajo diferentes condiciones
de programación de PCR (datos no presentados) . Finalmente, las condiciones bajo
las cuales se logró mejor reproducibilidad entre corridas independientes, fue utilizar
para la síntesis de cONA una concentración de 250 ng de RNA total , tratado
previamente con O Nasa 1, y para la síntesis del cONA-SRAP la mejor concentración
54
•
Capitulo 111
fue 25 ng del cONA templado con los cebadores SRAP's; las condiciones de PeR,
incluyen un ciclo inicial a 94° e por 3 min, 5 ciclos a 94° e por 1 min, 35° e por 1 min,
y 72° e por 1 min, seguido de 35 ciclos a 94° e , por 1 min, 50° e por 1 min , y 72° e
por 1 minuto y una extensión final de 72° e por 5 minutos (Anexo 11) .
En la figura 3.5, se aprecian amplificaciones de cONA-SRAP, en los carriles 1-
8 la síntesis del cONA-SRAP, los carriles 1 a 4 muestran amplificaciones en que se
util izó templado de cONA sinterizado mediante RT -O ligo d(T) , y los carriles 5 a 8
muestran el templado de cONA sintetizado por RT -RP; con estas condiciones se
obtuvo una mejor amplificación, con incremento en el número de bandas presentes
así como la definición de intensidad de las mismas en el gel , en la figura se puede
visualizar el despliegue diferencial entre los tejidos embriogénicos de los genotipos
utilizados.
2000 pb
1000 pb
400 pb
Fig. 3.5. Electroforesis en gel de acrilamida al 6% de cDNA-SRAP, producto de la amplificación
mediante RT-PCR. Carriles: 1-Callo embriogénico E.G.T. (AAA) , 2.- Callo embriogénico WT
(AAA), 3.- Callo embriogénico Selangor (AA), 4.- Callo embriogénico Selangor; Enzima MMLV
RT-Oiigo dT. 5.- Callo embriogénico E.G.T. 6.- Callo embriogénico E.G.T, 7.- Callo embriogénico
Selangor, 8. - Embrión cigótico Selangor; Enzima MMLV RT-RP. SRAP: Me1 -Em1 .
55
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Capitulo 111
Una vez estandarizadas las condiciones de reacción y PCR, se prosiguió a la
selección de pares de cebadores SRAP para ser utilizados en los experimentos de
expresión de la embriogénesis. Para ello, de 1 O pares de cebadores utilizados
previamente en Musáceas (Youssef et al., 2011), se exploraron 25 combinaciones,
seleccionándose al final 12 de ellas (tabla 2.1), los criterios para la selección de los
pares de cebadores fueron, i) cebadores que generaron patrones reproducibles de
bandas claramente definidas entre los 300 y 2600 pares de bases respecto del
marcador molecular, en al menos 2 corridas independientes de geles cargados con las
mismas muestras de amplificados de cDNA-SRAPs, y ii) el número de bandas
polimórficas detectadas entre los genotipos contrastantes diploide y triploides y los
tratamientos de las muestras evaluadas. En este caso, para la selección se utilizó
tejido de callo embriogénico de M. acuminata ssp., malaccensis tipo Selangor especie
diploide con genoma AA, y de Musa acuminata cv. Enano Gigante, grupo Cavendish
con genoma AAA.
El cuadro 3.1 enlista los tejidos y genotipos utilizados para la síntesis del cONA
para desarrollar de las reacciones con los cebadores SRAP. Como antes se señalo, la
síntesis de cONA puede utilizar iniciadores Oligo-dT y RP, en el presente trabajo se
probaron ambos con el fin de analizar si existen diferencias significativas a nivel del
polimorfismo que se detecta para los transcritos expresados durante la embriogénesis
somática de Musa, obsérvese el ejemplo de la figura 3.7. De 25 combinaciones de
cebadores SRAP probados, las 12 seleccionadas · detectaron un total de 4,17 4
transcritos para las reacciones con cDNA-OdT-SRAP, y un total de 4,006 con cDNA
RP-SRAP, descubriendo un polimorfismo de 69.12% y 58.27%, respectivamente.
Cabe señalar, que a nivel de nucleótidos es factible que exista variación en los
transcritos detectados, e incluso puede ser mayor.
56
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Capitulo 111
Cuadro 3.1. Listado de tejidos utilizados para la síntesis de cONA. Simbología : CE: callo embriogénico ;
CEE: Callo con expresión de embriones; ES: embrión somático; EC : embrión cigótico , H: tejido de hoja
cigarro. 1: Presencia , 0: Ausencia de bandas. (-) : Síntesis de cONA no realizada .
GENTIPO TEJIDO cONA (0. dT) cONA (R. P.)
CE ~ ~ Musa acuminata spp., CEE ~ ~
malaccensis, ES ~ ~ t ipo Selengor (AA) EC ~
. ~
H ~ -
CE ~ ~ Musa acuminata cv. CEE ~ ~ Williams, subgrupo
Cavendish ES ~ ~
(AAA) H ~ -CE ~ ~
Musa acuminata cv. CEE ~ ~ Enano Gigante
ES ~ ~ subgrupo Cavendish (AAA) H ~ -
La figura 3.6 muestra segmentos representativos de algunos geles de
electroforesis en poliacrilamida al 6% donde se evidencian los patrones de transcritos,
cDNA-SARP, de la embriogénesis somática de Musa spp, obtenidos con cuatro
combinaciones de cebadores SRAP. En los carriles 1-4 se despliegan transcritos
obtenidos con el par Me4-Em1, nótense pocos fragmentos diferenciales, entre
genotipos, y entre iniciadores OdT y RT, es decir, las bandas amplificadas en su
mayoría se encontraron presentes en todos los tejidos analizados de los dos diferentes
genotipos, por lo que esta combinación no se seleccionó; en contraste, las
combinaciones Me4-Em7, Me4-Em8, Me8-Em 1 (Negritas) lograron amplificar
fragmentos diferenciales y específicos para cada tipo de tejido-genotipo e iniciador,
(nótese las bandas marcadas con la flecha) dichas combinaciones si fueron
seleccionadas para continuar con el análisis de los patrones de transcritos
diferenciales de la embriogénesis en Musa spp., del presente estudio (Nótese las
bandas marcadas con la flecha) . Es conveniente aclarar que el hecho de no
seleccionar aquellos cebadores que arrojaron patrones de bandeo homogéneos entre
57
Capitulo 111
muestras, no significa que los fragmentos de dichos transcritos son iguales a nivel de
la secuencia de sus nucleótidos, ello deberá comprobarse por otros métodos
alternativos, e incluso la secuenciación.
2000 pb
1500 pb
650 pb
400 pb
6 7 8
Carriles/Combinación SRAP
1-4: Me4-Em1 5-8: Me4-Em7
9-12: Me4-Em8 13-16: Me8-Em1
Fig. 3.6. Patrones de expresión de transcritos de callos embriogénicos de Musa spp., mediante cDNA
SARP. Ejemplo de electroforesis en geles de acrilamida 6% mostrando amplificaciones con cuatro
combinaciones de cebadores SRAP y cONA sintetizado con Oligo-dT o RP. Carril es: 1 ,Selangor-OdT;
2,Selangor-RP; 3, EG-OdT; 4, EG-RP; 5, Selangor-OdT; 6, Selangor-RP; 7, EG-OdT; 8, EG-RP;
9,Selangor-OdT; 1 O, Selangor-RP; 11 , EG-OdT; 12, EG-RP; 13, Selangor-OdT; 14, Selangor-RP; 15,
EG-OdT; 16, EG-RP; M: marcador de peso molecular, MW, 1 KB Plus lnvitrogen.
La figura 3.7, presenta cuatro segmentos representativos de electroforesis en
geles de acrilamida al 6%; en estos se visualiza los transcritos de las amplificaciones
de los cDNA's (tabla 3.3) con los pares de cebadores, SRAP, Me y Em, sentido y
antisentido, respectivamente. Los carriles 1 al 9 exhiben transcritos diferenciales de
diferentes tejidos de embriogénesis somática, analizados, CE, CEE, ES y de embrión
cigótico, EC, y de tejido de hoja, H, incluido como tejido no-embriogénico, de M. a. m.
Selangor AA. En la porción 3.7a obsérvese que el número de fragmentos diferenciales
varía entre tejidos, e incluso entre cDNA-SRAP dependiendo si el cONA fue
sintetizado con iniciador OdT vs RP, respectivamente ; comparativamente, los
transcritos diferenciales generados con el cebador Me3-Em7, 3.7b, son mas variables
tanto en número como entre los diferentes tejidos analizados, y no así, con los otros
pares de cebadores (3.7c y 3.7d) , esto puede ser a que, en los cDNA's sintetizados
había pocos segmentos complementarios a los cebadores utilizados, o bien , ii) que el
límite de detección de transcritos está por debajo de la capacidad perceptible del ojo
58
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Capitulo 111
humano. En los carriles 10-16 se amplificaron cDNA's de M.a. cv. Williams AAA,
grupo Cavendish, obsérvese que los cebadores Me3-Em3 y Me3-Em7 fueron los que
arrojaron mayor numero de fragmentos diferenciales; en los carriles 17 y 23 se
amplificaron cDNA's de tejidos de M. a. cv. Enano Gigante AAA, grupo Cavendish,
distíngase también que los pares de cebadores antes citados fueron los que reflejaron
mayor número de fragmentos diferenciales entre tejidos. Los cDNA's de tejidos de hoja
cuyos amplificados se observan en los carriles 9, 16 y 23 sirvieron para diferenciar
transcritos específicos del procesos embriogénicos. En este último caso solo se
observa la amplificación cDNA-SRAP de la síntesis de cONA con Oligo-dT, pero ello
fue suficiente para diferenciar igualmente los genot ipos a nivel de sus transcritos de
hoja.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 M
500pb
1650pb
1000pb
2000pb
850pb 1000pb
d 1000pb
800pb
650pb
450pb
59
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Capitulo 111
Fig. 3.7. Patrones de expresión de transcritos, cDNA-SARP, de diferente tejido embriogénico de Musa ,
generado con los cebadores: a, Me3-Em3; b y d , Me3-Em7; e, Me4-Em3. M: marcador de peso
molecular, 1 "' carril izquierdo 50 Kb DNA plus ladder y ultimo a la derecha 1 Kb plus DNA ladder. Los
tejido analizados son: 1, CE de Sei-SRAP-OdT; 2, CE de Sei-SRAP-RP; 3, CEE de Sel- SRAP-OdT;
4,CEE de Sei-RP; 5, ES de Sei-SRAP-OdT, 6,ES de Sei-RP ; 7, EC de Sei-SRAP-OdT, 8 , EC de Sei-RP;
9, H de Sei -SRAP-OdT; 10,CE de WT-SRAP-OdT; 11 , CE de WT-SRAP-RP ; 12, CEE de WT-SRAP
OdT; 13,CEE de WT-SARP-RP; 14, ES de WT-SRAP-OdT; 15, ES de WT-SRAP-RP; 16,H de WT-SRAP
OdT; 17, CE de EG-SRAP-OdT; 18, CE de EG-SRAP-RP; 19, CEE de EG-SRAP-OdT; 20, CEE de EG
SRAP-RP; 21, ES de EG-SARP-OdT; 22,ES de EG-SRAP-RP; 23, H de EG-SRAP-OdT. CE: Callo
embriogénico; CEE: Callo con expresión de embriones; ES : Embrión somático ; EC: Embrión cigótico ; H:
hoja; Sel: Selangor AA; WT: Williams AAA; EG: Enano gigante AAA; OdT, síntesis con Oligo dT; RP,
síntesis con Random Primers. Electroforesis en gel de acrilamida 6%.
3.6 TRANSCRITOS EXPRESADOS DIFERENCIALMENTE CON cDNA
SRAP.
Finalmente, se usaron 12 combinaciones de cebadores SRAP con el cONA de
tejidos embriogénicos y foliar de tres genotipos de Musáceas, para descubrir y analizar
cambios a nivel de transcritos de genes relacionados con la embriogénesis somática,
y la variación entre genotipos. El cuadro 3.2, enlista los pares de cebadores y el
porcentaje de polimorfismo que generó cada uno de ellos, adviértase que los pares,
Me1-Em7 con 81.15% y Me4-Em3 con 79.8%, respectivamente, resultaron ser los que
revelaron mayor polimorfismo de transcritos para los estadios embriogénicos en los
genotipos estudiados. Cebadores con bajo nivel de polimorfismo evidenciaron , sin
embargo, diferencias entre los genotipos; obsérvese el número de bandas específicas
encontradas por cebador y las expresadas diferencialmente en los tejidos
embriogénicos por genotipo, excluyendo el tejido de hoja (cuadro 3.3), y nótese el
número ligeramente mayor de transcritos para el genotipo diploide Selengor (164)
respecto de los triploides Williams (140) y Enano Gigante (154) . Estas diferencias es
probable que también se encuentren a nivel de secuencia y se relacionen con genes
expresados para cada genotipo bajo las condiciones in vitro. Es pertinente señalar,
que macroscópicamente, los CE y los CEE de los tres genotipos, muestran diferencias
en la textura y coloración de los mismos, aun cuando histológicamente son
equivalentes estando constituidos por numerosas células embriogénicas, embriones
60
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Capitulo 111
bi- y tetra-celulares, y pre-embriones globulares con peridermis, respectivamente (Ku
Cauich, comunicación personal). Este es el primer reporte que utilización la técnica de
cDNA-SRAP para examinar transcritos de genes expresados de manera diferencial
durante la embriogénesis somática y cigótica, y de manera particular en Musa; es
notoria la falta de literatura respecto de la expresión de genes para estadios de
embriogénesis equivalentes entre genotipos de diferentes especies; de tal manera que
no podemos discutir nuestros datos contra la literatura ya que los reportes contrastan
más bien el tej ido de callo embriogénico vs., no-embriogénico para una especie, ya
sea por métodos de hibridación o de etiquetas de transcritos.
Cuadro 3.2. Listado de las 12 combinaciones de los cebadores seleccionados para el desarrollo de la
técnica cDNA-SRAP, y porcentaje de polimorfismo que generó cada par de cebador. El pol imorfismo
arrojado fue la sumatoria de los generados por cDNA-SRAP-OdT y cDNA-SRAP-RP.
Par de Cebador No. Total de No. total de % de polimorfismo Bandas Bandas diferentes
Me1-Em3 569 96 16.88
Me1-Em6 759 347 45.71
Me1-Em7 414 336 81.15
Me2-Em6 1150 901 78.34
Me3-Em6 713 511 71.66
Me3-Em3 506 332 65.61
Me3-Em8 736 506 68.75
Me3-Em7 1541 1000 65.74
Me4-Em7 736 561 76.22
Me4-Em3 1035 826 79.80
Me4-Em8 759 544 71 .67
Me8-Em1 897 631 70.34
61
•
Capitulo 111
Cuadro 3.3. Listado del número de transcritos diferenciales, cDNA-SRAP-OdT y cDNA-SRAP-RP,
específicos de tejidos embriogénicos de tres genotipos de Musáceas, se excluyó del análisis los
respectivos transcritos del tejido de hoja.
Par de cebador No. de bandas No. de bandas No. de bandas No. total de
Selangor AA Williams AAA EnanoG. AAA bandas
Me1-Em3 o 4 9 13
Me1-Em6 16 8 13 37
Me1-Em7 14 7 4 25
Me2-Em6 o 11 3 14
Me3-Em6 29 10 6 45
Me3-Em3 9 18 14 41
Me3-Em8 13 12 18 43
Me3-Em7 6 15 25 46
Me4-Em7 39 23 7 69
Me4-Em3 12 16 21 49
Me4-Em8 17 12 18 47
Me8-Em1 7 4 16 27
Total 162 140 154 456
3.7 ANÁLISIS DE BANDAS CANDIDATAS PARA SECUENCIACIÓN.
Con la amplificación de los cDNA's de los tejidos, los 12 pares de cebadores
SRAP detectaron transcritos especificas para cada . tej ido y estado de desarrollo del
proceso embriogénico, del total de 456 bandas diferentes ente genotipos (cuadro 3.2),
se seleccionó un total de 138 bandas diferenciales entre los tejidos sintetizados con
Oligo dT y RP del proceso embriogénico, y en el caso del tejido de hoja se seleccionó
43 bandas que diferencian a nivel de trascritos dos grupos genómicos, AA y AAA, de
los genotipos, estas bandas representan transcritos cand idatas para secuenciación y
su posterior análisis bioinformático.
62
•
Capitulo 111
En el gel de poliacrilamida al 6%, de la figura 3.8, obsérvense las bandas
específicas de los diferentes estadios embriogénicos para dos genotipos, uno con
genoma AA y otro AAA, marcadas con flecha, y que corresponden a transcritos
amplificados con los cebadores Me3-Em3, estos son candidatos para ser aislados,
clonados, secuenciados y analizados por medios bioinformáticos. Es probable que
con dicha información se puedan identificar genes invocados en el proceso de la
embriogénesis en musáceas, y corroborar la presencia del gen MaSERK1 , recién
reportado (Hang X, et al, 2011). La metodología de cDNA-SRAP favoreció la detección
e identificación de genes de Oryza satíva L., responsivos a fotoperiodo , (Choochai et
al., 2007); y asimismo, permitió elucidar que de un total de 1496 transcritos
expresados diferencialmente en especies de Brassíca, 92 bandas están relacionadas
con el silenciamiento en las especies tetraploides (Gui et al. , 2009) .
Fig . 3.8. Expresión de transcritos de tejidos embriogénicos y foliar de dos genotipos de Musa
mediante cDNA-SRAP. Separaron en gel de acrilamida 6%, y tinción con nitrato de plata;
ejemplo mostrando amplificación con cebadores Me3-Em3. Los Carriles: 1.- CE-SRAP-OdT, 2.
CE-SRAP-RP, 3.- CEE-SRAP-OdT, 4.-CEE-SRAP-RP, 5.-ES-SRAP-OdT, 6.-ES-SRAP-RP, 7.
EC-SRAP-OdT, 8.- EC-SRAP-RP, 9.-Hoja-SRAP-OdT (1-9 Selangor AA); 10.-CE-SRAP-OdT,
11 .- CE-SRAP-RP, 12.- CEE-SRAP-OdT, 13.- CEE-SRAP-RP, 14.- ES-SRAP-OdT, 15.- ES
SRAP-RP, 16.-Hoja-SRAP-OdT (10-16 Williams AAA). M=marcador molecu lar de 50 Kb DNA
plus Ladder.
63
Capitulo 111
3.8 DIVERSIDAD DE TRANSCRITOS EN TEJIDOS EMBRIOGÉNICOS Y FOLIAR
DE Musa spp.
Con el fin representar la similitud entre los transcritos expresados en la
embriogénesis, y visualizar la separación y agrupación de estos respecto de los
estadios de la ES para cada genotipo y su grupo genómico, se construyeron
dendogramas. La figura 3.9, presenta el dendograma con la información de los
transcritos de cDNA-SRAP, resultado de amplificar cDNA's sintetizados con Oligo dT
y doce pares de cebadores seleccionados, mencionados en la tabla 3.2. Obsérvese
en este caso, que los tejidos de los estadios de CE, CEE, y embrión somático de los
dos genotipo AAA, Williams y Enano Gigante, logran agruparse de manera cercana y
representan una de las dos ramas de un grupo mayor, y en cuya otra rama , la
extrema, se ubica el CE y embrión somático ES Selangor del genotipo AA, siendo que
los transcritos del CEE y de embrión cigótico AA-Selangor los que permanecen
separados en una rama aparte, es de notar que los transcritos de cada estadio de
embriogénesis mantienen su identidad y se agrupa con su genotipo o grupo genómico.
Por otra parte, la figura 3.1 O, presenta el dendograma formado a partir de la
información de transcritos cDNA-SRAP, cuyo cONA fue sintetizado con RP, al igual
que en el caso de los Oligo-dT, aquí se observa un grupo mayor con dos ramas, la
agrupación similar de algunos tej idos presentados, el CE, CEE y embrión somático,
ES de Enano Gigante y Williams se distinguen uno respecto del otro genotipo,
quedando separados el CE y embrión somático ES de Selangor, solo el CEE Selangor
no alcanzó a diferenciarse en el grupo externo pues quedó compartiendo la
agrupación con Williams, aquí el tejido de embrión cigótico de Selangor quedó aparte.
En el dendograma presentado en la figura 3.11 , formado con la información de
transcritos de los tejidos de hoja, que constituye el tejido no-embriogénico de los tres
genotipos, en conjunto con el tejido embrión cigótico de M. a. m. Selangor AA,
mostraron una clara separación dos grupos, diferenciando claramente al genoma
diploide AA de Selangor del tejido de los triploides AAA del grupo Cavendish , y separó
claramente al tejido de embrión cigótico, ello corrobora que con los pares de
cebadores seleccionados se puede diferenciar el tejido embriogén ico del no
embriogénico, y muestran la variación entre los genomas.
64
Capitulo 111
O.M CE_ S elangor
ES_ S elangor
CE Williams
0.~ 0.428
1
0.420 1 0.543
CEE EnanoG
ES EnanoG
o~ 0.413
CEE Williarm
ES Williarm 0.282
CE EnanoG
0.396 1 CEE_ Selangor
1 .
EC _S elangor
0 .00 0 .20 0 .40 0 .60 0 .80 1.00 Coefficient
Fig . 3.9. Oendograma presentando los 10 diferentes cONA's de los tejidos embriogénicos (CE:
callo embriogénico, CEE: callo con expresión de embriones, ES: embrión somático, EC:
embrión cigótico) amplificados con los cebadores SRAP (12 pares de cebadores
seleccionados). Síntesis de cONA con Oligo dT. Los valores presentados entre los grupos
corresponden al coeficiente de similitud.
0.00 0 .20
.-----------------CE_Selangor
M '-----------------ES_Selangor
o.3R ,-----------------ES_Williams
0.34,1.._ --~r0-.543 _____________ :::~~:G
0.318
'---------------ES_EnanoG
..------------------CEE_Selangor
0.357 ..-----------------CE_Williarm
~0.410 CEE_Williarm
'--------------------EC_Selangor
0.40 0.60 0 .80 1.00 C oefficient
Fig. 3.1 O. Oendograma presentando los 1 O diferentes cONA's de los tejidos embriogénicos
(CE: callo embriogénico, CEE: callo con expresión de embriones, ES: embrión somático, EC:
embrión cigótico) amplificados con los cebadores SRAP (12 pares de cebadores
seleccionados). Síntesis de cONA con RP. Los valores presentados entre los grupos
corresponden al coeficiente de similitud .
65
•
Capitulo 111
.------------------Hoja_Selangor
0 .367
,-----------------H~a_w~~
~ 0.447 0.260
L-----------------Hoja_EnanoG
'----------------------EC_Selangor
0 .00 0 .2 0 0.40 0 .60 0 .80 1.00 Coetficien t
Fig. 3.11 . Dendograma presentando 4 diferentes cDNA's de los tejidos no embriogénicos
(Hojas) y embriogénico (EC: embrión cigótico) ampl ificados con los cebadores SRAP (1 2 pares
de cebadores seleccionados). Síntesis de cONA con OdT. Los valores presentados entre los
grupos corresponden al coeficiente de similitud .
66
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Capitulo 111
3.9 Conclusiones.
Los resultados mostraron que la técnica de cDNA-SRAP es reproducible y
potencialmente adecuada para estudios de patrones de expresión de genes de la
embriogénesis y otros procesos y tejidos en Musáceas., debido a que es un método
independiente de que se disponga de información de la secuenciación del genoma.
El presente estudio es útil como punto de partida para elucidar las bases
moleculares del proceso de embriogénesis somática en plátano e identificar genes que
pueden ser blancos potenciales de estudios más detallados e incluso la clonación de
los mismos así como estudios más amplios de expresión génica global.
Los pares de cebadores SRAP, Me1-Em7 y Me4-Em3 detectaron el mayor
porcentaje de polimorfismo, 81.2% y 79.8%, respectivamente, lo que se traduce en
un número de transcritos específicos para los genotipos y tejidos analizados.
El análisis mediante dendograma sirvió para visualizar con claridad la
diferenciación a nivel de los transcritos según el nivel de ploidía de los genotipos, el
tipo de tejido, y con base a los estadios de desarrollo del proceso embriogénico.
Con la técnica cDNA-SRAP se detectaron 138 bandas de transcritos para la
embriogénesis somática de Musa spp., siendo 86 de ellas derivadas de cDNA-SRAP
OdT, y 52 con cDNA-SRAP-RP, candidatas para su secuenciación.
Además, se encontraron 43 bandas de transcritos de hoja que diferencian a los
grupos genómicos de los genotipos analizados.
67
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Capitulo 111
3.1 O Perspectivas.
Secuenciación y análisis bioinformático de las secuencias de las bandas de
transcritos seleccionados.
Validar la reproducibilidad del método de cDNA-SRAP para detectar transcritos
de genes expresados diferencialmente, mediante análisis de qRT-PCR, en tiempo real ,
para 138 transcritos candidatos.
Utilizar la metodología cDNA-SRAP con otros estadios de la embriogénesis
somática, y para otros tejidos o procesos de interés enMusa spp.
68
Capitulo 111
3.11 BIBLIOGRAFÍA.
Boutilier, K. , Offringa, R., Sharma V. K., Kieft, H., Ouellet, T., Zhang, L., Hattori,
J., Liu, C-M., van Lammeren, A. A. M., Miki, BLA., Custers, J. B. M., van
Lookeren Campage, M. M. (2002) Ectopic expression of BABY BOOM triggers a
conversion from vegetative to embryonic growth. Plant Ce//14: 1737-1749.
Chomczynski, P., Sacchi, N. (1987). Single step method of RNA isolation by
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction, Anal. Biochem. 162:156-
159.
Choochai, N., Padrit, P. (2007). Detection responsive gene in KDML, 105 rice (Oryza
sativa L.) using cDNA-SRAP technique. Nat Sci.41 :651-659.
Chugh, A., Khurana, P. (2002). Gene expression during somatic embryogenesis:
recent advances, Curr. Sci. 83, 715-730.
Huang-Xia, Lu. X-Y., Zaho, J-T, Chen, J-K., Dai, X-M., Xiao, W., Chen, Y-P., Chen,
Y-F., Huang, X-L (2010). MaSERK1 gene expression associated with somatic
embryogenic competence and disease resistance response in banana (Musa spp.).
Plant Mol. Bio/.28, 309-316.
lkeda, M., Umehara, M., Kamada, H. (2006) . Embryogenesis-related genes; lts
expression and roles during somatic and zygotic embryogenesis in carrot and
Arabidopsis, Plant Biotechnology 23, 153-161 .
Gui, Q., Wang, J., Xu, Y., Wang, J. (2009). Expression Changes of Dupljcated Genes
in Allotetraploids of Brassica Detected by SRAP-cDNA Technique, GENOMICS,
TRANSCRIPTOMICS, PROTEOMICS. Moleku/yarnaya Bio/ogiya, Vol. 43, pp.
3-9.
Martín-Lori, A. Ambion lnc. Ambion., Austin, TX. 1983.
69
•
Capitulo 111
Musashine, T., Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco tissue culture. Physiol Plant 15: 4 73-497.
Morel, G., Wetmore, R.H. (1951). Tissue culture of monocotyledos. American Journal
of Botany 38: 138-140.Navarro, C., Escobedo, R. M., A. Mayo, In Vitre plant
generation from embryogenic cultures of a diploid and triploid, Cavendish banana.
Plant Cell Tissue and Organ Culture. 51 :17-25, 1997.
Li, G., Quiros, C. F. (2001). Sequence-related amplified polymosphism (SRAP), a new
marker system base on a simple PCR rraction: its application to mapping and gene
tagging in Brassica. Theor. Appl. Genet. 103, 455-461.
Deoxyribonuclease 1 amplification grade, lnvitrogene, Life technologies, Cat. 18068-
015, 2003.
Reverse Transcription System, Technical Bulletin, Promega, corp. A3500, pp.1-7,
2009.
Schmidt, E. D. L., Guzzo, F., Toonen , M. A. J., de Vries, S. C. (1997). A leucine-rich
repeat containing receptor-like kinase marks somatic plant cells competent to form
embryos. Development 124: 2049-2062.
Somleva, M.N., Schmidt, E. D. L., de Vries, S. C. (2000) Embryogenic cells in
Dactylus glomerata L. (Poaceae) explants identified by cell trucking and by SERK
expression, Plant Cell Rep. 19,718-726.
Santos-Mendoza, M., Dubreucq B., Baud S., Parcy; F., Caboche M., and Lepiniec,
L. (2008) . Deciphering gene regulatory Networks that control seed development
and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54, 608-620.
SuperScript 11, Reverse Transcriptase. lnvitrogene, Life technologies, Cat. 18064-014,
pp. 1-4, 2003.
70
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Capitulo 111
Youssef, M., James, A. C. Rivera-Madrid, R., Ortiz R., Escobedo-GraciaMedrano,
R. M. (2011) . Musa Genetic Diversity Revealed by SRAP and AFLP. Mol
Biotechnol. 47:189-199.
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Anexo 1
Anexo 1.
Extracción de RNA total, Chomczynski & Sacchi, 1987, con
modificaciones.
1.- Pulverizar 100 mg de tejido con nitrógeno liquido, añadir 2 volúmenes de TRIZOL®
(2001-JL) y continuar la pulverización, inmediatamente transferir a un tubo de 1.5 ml y
añadir 2 volúmenes de Trizol (4 volúmenes = 400 IJL) , agitar vigorosamente (vortex) e
incubar en hielo durante 30 minutos.
' 2.-Centrifugar a 16060 g a 4°C durante 15 minutos, posteriormente transferir el
sobrenadante a un tubo nuevo de 1.5 ml.
3.-Adicionar 2/1 O volumen de cloroformo:alcohol isoamílico (24: 1), (por ejemplo,
adicionar 120 IJL si el volumen es de 600 IJL de tejido mas trizol) , agitar
vigorosamente (en vortex) y centrifugar a 16060 g a 4°C, durante 20 minutos.
4.-Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1.5 ml, adicionar 1 volumen de
isopropanol, agitar por inversión (cuidadosamente) e incubar a -80 oc durante 30
minutos.
S.-Incubar en hielo durante 5 minutos en hielo, centrifugar a 16060 g a 4 oc. 25 minutos
y desechar el sobrenadante.
6.-Lavar el precipitado con 300 IJL de etanol 70% (v/v) , agitar por inversion
(cuidadosamente) y centrifugar a 16060 g a 4°C durante 5 minutos (realize este
procedimiento 2 veces).
?.-Desechar el sobrenadante, adicionar 300 IJL de etanol 100%, centrifugar a 13060 g
a 4°C durante 15 minutos.
B.-Desechar el sobrenadante, dejar secar el precipitado y resuspender en 50 IJL de
agua libre de nucleasas. Realizar electroforesis en gel de agarosa 0.5% para
corroborar la integridad de ARN y cuantificar la concentración de ARN con la ayuda de
un espectrofotómetro realizando lecturas a diferentes longitudes de onda (230,260,
280 y 320 nm).
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9.- Una vez cuantificado el RNA total , preparar una dilución de RNA a 1 ¡.Jg en 1 O iJL
de agua grada biología molecular para el tratamiento con DNasa 1, (ver materiales y
métodos, sección 2 .2.2).
1 O. Almacenar en RNA total a -80° e (Stock y dilución) para evitar su degradación
hasta su uso.
Nota: Todos los materiales como los morteros, pistilo fueron esterilizados previamente
con luz UV durante 2 horas, las puntas y tubos fueron autoclaveados mientras que las
pipetas fueron limpiadas con NaOH 0.1 N y etanol al 96% .
Tratamiento con DNasa 1 (grado de amplificación).
El RNA total se trató con DNasa libre de RNasa (Deoxiribonucleasa 1, grado
amplificación , de lnvitrogen eat. No. 18068-015) siguiendo las instrucciones del
proveedor. En breve, la reacción se realizo en un volumen total de 1 O iJL, el cual
contiene: 1 ¡.Jg de RNA total , 1 iJL del amortiguador de reacción 1 OX DNase 1, 1 U/¡.JL
de DNase 1 (grado de amplificación), y agua libre de DNasa/RNasas, seguidamente se
incubó la reacción a temperatura ambiente durante 15 minutos, luego, se adicionó 1
iJL de 25 mM EDT A y se incubó a 65° e durante 1 O minutos para desactivar la enzima
DNase 1.
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Anexo 11
Anexo 2.
Síntesis de cONA, SuperScript 11 RT (lnvitrogene, Cat No. 18064-022).
Reacción 1
Reactivo [Final 1 Vol. IJL ARN total 250 ng/IJL 5 Oligo (dT) 1 Cebadores A 2.5 ¡Jg/IJI 1 dNTPs 0.50 mM 1 H20 5
1.- Incubar a 65 oc durante 5 minutos e incubar en hielo, seguidamente preparar la reacción 2 y mezclarlo con la reacción 1.
Reacción 2
Reactivo [Final] Vol. IJL First Strant Buffer 5X 1X 4 0.1 M OTT 0.01 M 2 Rnase Out 2 U/IJI 1 M-MLV RT 1 O U/ !JI 1 Vol. Final 20
2.- Incubar la reacción a 42° C durante 60 minutos en caso de utilizar aligo (dT).
Incubar a temperatura ambiente durante 1 O minutos y posteriormente incubar 42° C
durante 60 minutos en caso de utilizar cebadores aleatorios.
3.- Incubar la reacción la reacción a 70° e durante 15 minutos, transferir
inmediatamente en hielo y almacenar a -80° C.
4.- Cuantificar la concentración de AON con la ayuda · de un espectrofotómetro
realizando lecturas a diferentes longitudes de onda (230,260, 280 y 320 nm).
*El cONA sintetizado (primera cadena) , se utiliza como molde para la amplificación de
con cebadores mediante PCR, la cual mediante su amplificación se creara la doble
cadena de convirtiéndola de cONA a ONA mediante la Taq DNA polimerasa.
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Anexo 11
Amplificación de un fragmento del gen RNAr 18 S a partir de cONA.
Reactivo 1 [Final] 1 Vol. IJL H20 14.05 Buffer1 0X 1X 1 dNTPs 2mM 0.160 mM 2 Mge12 SOmM 1.4 mM 0.7 18S f 20 pmol 0.800 pmol 1 18S r 20 pmol 0.800 pmol 1 Taq Poi. Su/IJL 0.500 U/IJL 0.25 cONA Sng/IJL 1 ng/IJL 5 Vol. Final 25
Programación de PeR: un ciclo a 94° e por 30 segundos, 20 ciclos idénticos a 94° e
por 30 segundos, 60° e por 20 segundos, y 72° e por 30 segundos, una extensión
final de 72° e por 7 minutos.
Reacción para la obtención de cDNA-SRAP's.
Reactivo [Final] Vol. IJL H20 5.45 Buffer1 0X 1X 2 dNTPs 2mM 0.250 mM 2.5 Mge12 SOmM 4.0 mM 1.6 Me 10 pmol 0.800 pmol 1.6 Em 10pmol 0.800 pmol 1.6 Taq Poi. Su/IJL 0.625 U/IJL 0.25 cONA Sng/IJL 1.25ng/IJL 5 Vol. Final 20
Programación de PeR: un ciclo inicial a 94° e por 3 min , 5 ciclos a 94° e por 1 min,
35° e por 1 min, y 72° e por 1 min, seguidamente 35 ciclos idénticos a 94° e, por 1
min, 50° e por 1 min, y 72° e por 1 minuto y una extensión final de 72° e por 5
minutos.
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Anexo 111
Anexo 3.
Protocolo para la preparación de gel de poliacrilamida desnaturalizante
(40 cm).
Para el montaje de los placas de vidrio , primeramente los vidrios se lavaron con jabón
y luego con una solución al 70% (v/v) de etanol , y se secó perfectamente con papel
absorbente. Se agregó 2 mi de Repel (comercial) mismo que se esparció sobre la
placa de vidrio grande, 2 a 3 veces, con el fin de evitar que el gel se adhiera a la placa
grande; por otra parte, se adicionó 1 mi de solución con binding silane (1 OO!JI binding
silane, 24.25 mi etanol al 96% y 750 !JI ácido acético) a la placa más corta, se esparció
totalmente sobre ella y se dejo secar por un tiempo de 10-15 m in . Se colocaron los
espaciadores laterales sobre la placa grande, y a continuación se colocó la placa más
corta sobre la anterior, sin tocarla, se coloco el tercer espaciador en la base y se
sujetaron con broches (clips) . Se preparó una solución de poliacrilamida al 12%, (14
mi Acrilamída-Bisacrilamída (Stock 29-1, 30%), 31 .50 g Urea (8M), 7 mi TBE 10X,
aforar a 40 mi con H20 destilada, se adicionó 245 !JI de APS al 25% (v/v) y 40 !JI de
TEMED) posteriormente se vertió entre ambas placas de vidrio. El peine se puso en la
parte superior del gel con su parte plana hacia la solución de acrilamida, y se dejo
polimerizar por 2h. Se quitó los broches, peines y el espaciador inferior; con el fin de
eliminar el exceso de urea, se lavó la placas de vidrio con detergente líquido y agua, y
se secó con papel absorbente. Las placas con el gel se colocaron en la unidad del
equipo de electroforesis (S3S Owl Thermo Scientific). Una vez que se sujetaron las
placas se vertió el amortiguador TBE 1X en el reservorio superior y en la charola
inferior. Se conectó la fuente de poder, y se establecieron las condiciones constantes
de pre-corrida, fuerza W= 50 watts, 1700 voltios y 35 miliamperios, hasta que la
temperatura del gel alcance - 45°e . En seguida se insertó el peine hasta que los
dientes toquen el gel (1 mM dentro) , y se cargo aprox. 6 !JI de las muestras del
amplificado, desnaturalizadas previamente (90° e durante 5 minutos, después se
adicionó 8 !JI de amortiguador de carga con formamida y se almacenó a 4° e durante 2
hrs) .
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Anexo 111
Protocolo para la tinción con nitrato de plata
Una vez que terminó la corrida, justo cuando el frente del colorante salió del
gel, se apagó la fuente de poder, se desmontó el gel del equipo de electroforesis,
después se retiró el peine y los espaciadores, y en seguida se separó cuidadosamente
la placa grande de vidrio del gel. La placa corta de vidrio, con el gel, se puso en una
charola y se fijó con una solución, de ácido acético al 10% v/v, hasta la remoción total
del Repel, seguidamente el gel se lavó tres veces durante cinco minutos cada vez con
agua destilada. Enseguida, se agregó la solución de tinción de nitrato de plata (1 g/1
nitrato de plata con 1.5 mi de formaldehido al 37%, el cual se agregó justo antes de
iniciar la tinción) y se puso a agitar durante 35 min. Se retiró la solución de tinción y el
gel se lavó brevemente con agua destilada por 5-10 segundos. El agua se decantó y
se reemplazó por una solución reveladora fría de carbonato de sodio (30g/l) que
contiene 1.5 ml/1 de formaldehido al 37% y 8 IJI/1 de solución de 0.2 g/ml de tiosulfato
de sodio preparada en fresco el mismo día. El revelado se realizó de la siguiente
manera : se agrego la mitad (-750 mL) de la solución reveladora fría al gel y se agitó
fuertemente hasta que las primeras bandas se hicieron visibles en el gel (aprox. 5) ,
posteriormente, se reemplazó esta solución por la otra mitad (-750 mL) hasta que
todas las bandas fueron visibles (aprox. 1 O m in). Seguidamente, la solución se
reemplazó por la solución fijadora (de ácido acético) y se dejó en agitación por 3 min .
Luego, el gel se enjuagó con agua destilada por 5 min y dejó secar aprox. 6hrs para su
evaluación.
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Anexo IV
Anexo 4.
Evaluación del gel de Poliacrilamida.
Pasado unas horas de haberse secado el gel, puede procederse a su evaluación con la ayuda de un equipo de luz blanca o si lo prefiere puede digitalizar el gel de poliacrilamida a formato JPEG.
Los criterios de evaluación de gel de poliacrilamida, son los siguientes:
1.- Anotar en un cuadro o archivo Excel, anotar las presencia (1) y ausencias (O) encontradas en el gel de poliacrilamida (Fig.1 ). Una vez realizado esto, contar el número de presencias y ausencias para obtener el porcentaje de polimorfismo.
Ejemplo, siguiendo la Fig. 1:
Bandas presentes (BP)= 23 Bandas ausentes (BA)= 12 Bandas totales (BT)= 35
%POL.= BP/BT x100=
%POL.=23/35 x100=65.71
2.- Seguidamente, con la ayuda del programa NTSYS V.2.2 podrá el visualizar el dendograma y el coeficiente de similitud entre las muestras evaluadas, Fig.2.
MPM C1 C2 C3 C4 C5 C1 C2 C3 C4 es L1 1 o o
+-L1 L2 1 o +--L2 L3 L3 1 1 o
L4 1 1 o t=L4 L5 L5 1 1 o 1
+-L6 L6 o o o 1 L7 L7 o o o
Fig. 1. Izquierda: Segmento representativo de un gel de poliacrilamida. Derecha: Formato utilizado para las anotaciones de las presencias (1) y ausencias (O) encontrados en el gel de poliacrilamida .
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•
IJ • . . .
NTSYSpc Vtniul.lO
Anexo IV
.------- Cl .------1 C2
.----C3 '------l
L---C4
.____ _______ es
Coeficiente de similitud
Fig.2. Izquierda : Programa utilizado para la obtención de dendogramas y coeficientes de similitud tomando como base la matriz binaria obtenida en la evaluación . Derecha: Dendograma obtenido de las muestras evaluadas.
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Anexo V
Anexo 5.
Cuantificación espectrofotométrica de RNA
A.- Cuantificación de RNA total de tejidos embriogénicos y de hoja de Musa
acuminata ssp. , ma/accensis (AA, tipo Selangor), y los cultivares AAA, M. a. cv.
Williams y Enano Gigante del Grupo Cavendish .
Tejido Genotipo Relación Relación Concentración 280/260nm 260/230nm ng/tJL
Selangor 1.9 1.8 669.6 CE Williams 1.8 1.8 874.7
Enano Gigante 1.9 1.8 634.6 Selangor 1.9 1.8 855.4
CEE Williams 1.9 1.8 1024.3 Enano Gigante 1.8 1.7 1123.5 Selangor 1.8 1.7 895
ES Williams 1.8 1.8 1234 Enano Gigante 1.9 1.8 1876.2
EC Selangor 1.8 1.8 946.4 Selangor 1.9 1.8 1121 .8
Hoja Williams 1.9 1.7 1345.4 Enano Gigante 1.8 1.8 1234.7
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