Optimización y simulación de una celda de combustible microbiana con

Pseudomonas aeruginosa J.D. Mejía Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia

RESUMEN: Una celda microbiana de combustible (MFC, de sus iniciales en inglés) es un reactor biológico,

que convierte la energía presente en compuestos orgánicos a energía eléctrica, a través de las reacciones de

microorganismos en condiciones anaeróbicas. La crisis reciente en las fuentes de energía tradicionales ha ge-

nerado nuevo interés en las MFCs causando un avance considerable en el diseño y construcción de estas, sin

embargo, es de suma importancia poder generar modelos que permitan predecir el comportamiento de las

MFCs. Para este fin, este estudio presenta la simulación de una MFC con Pseudomonas aeruginosa (P. Aeru-

ginosa) basado en un análisis de flujo metabólico (MFA) el cual se plantea como un modelo de programación

lineal y que sirve de insumo para el modelo de la celda de combustible. El modelo lineal fue implementado en

Xpress MP y el modelo de acople en Comsol Multiphysics. Los resultados del MFA fueron consistentes con

el modelo in vivo y corroborados con resultados de la literatura. El modelo in silico predijo potenciales

máximos de 0.135V que fueron consistentes con los obtenidos en la celda experimental

ABSTRACT: A microbial fuel cell (MFC) is a biological reactor that turns chemical energy present in the

bonds of organic compounds into electric energy, through the reactions of microorganism in anaerobic condi-

tions. The recent crisis in traditional sources of energy has generated new interests in MFCs causing a consi-

derable advance in the design and construction of these, however, is of extreme importance to be able to gen-

erate models to predict their behavior. To this end, this study presents the simulation of a MFC with

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) based on a metabolic flux analysis (MFA), which was formulated

as a linear programming problem and was used as the input of the MFC model. The linear model was imple-

mented using Xpress MP and was further connected to a model developed in the software Comsol Multiphys-

ics®. The results from the MFA were consistent with the in vivo model and with the data from literature. The

in silico model predicted maximum potentials of 0.135V that were consistent to the ones obtained in the expe-

rimental cell.

1 INTRODUCCION

La demanda global de energía está aumentando de

forma alarmante. Los expertos aseguran que el con-

sumo global de energía aumentará en un dos por

ciento anual por los próximos 20 años. Alrededor

del 80% de la demanda de energía actual se suple

con combustibles fósiles [2], esta fuente de energía

es fácilmente obtenida, transportada y almacenada

debido a la gran cantidad de dinero ha sido destina-

do para crear, construir y mantener este sistema

A pesar de todos los beneficios que este tipo de

combustibles han aportado a la sociedad, también

han tenido un efecto adverso en el ambiente. Algu-

nos de estos incluyen la polución del aire debido a

emisiones de óxidos de nitrógeno y azufre, la con-

taminación del suelo debido a derrames de petróleo

y por último la acumulación de dióxido de carbono

en la atmosfera. Adicionalmente, se espera que la

demanda de estos combustibles no cese si no por el

contrario siga en aumento. [1]

Es imprescindible que el mundo cambie, se necesita

una fuente de poder que tenga bajas emisiones dañi-

nas, que sea eficiente y que tenga un suministro ili-

mitado de combustible para proveer de energía a

nuestra población en aumento.

Las celdas de combustible han sido identificadas

como una de las tecnologías más prometedoras para

alcanzar estos logros. En adición a esto, las celdas

de combustible tienen ventajas sobre otras fuentes

de energía renovables como la energía solar, eólica e

hidroeléctrica debido a que no son de gran tamaño y

no tienen que funcionar en el sitio donde se les cons-

truyó, sin embargo, según Spiegel [2], la opción ide-

al sería usar varias de estas tecnologías en conjunto.

Las celdas de combustible microbianas (MFC) son

sistemas que permiten la generación de una corriente

eléctrica a partir de la degradación anaeróbica de

materia orgánica por bacterias. [3]

La mayoría de los estudios científicos que se han

realizado sobre celdas de combustible se han centra-

do en el tratamiento de aguas mas no en la produc-

ción de electricidad, teniendo en cuenta esto y la

creciente demanda de electricidad es necesario que

se empiece a explorar el campo de las celdas de

combustible microbianas como una alternativa via-

ble de fuente de electricidad [4]

Las deficiencias de las MFC se centran en la baja

produccion de electricidad.Planteando el

metabolismo de la bacteria como un problema de

programacion lineal es posible, por un lado predecir

el comportamiento de la bacteria y por lo tanto de la

celda de combustible y, por otro lado optimizar la

produccion de electricidad por parte de las mismas.

Se han hecho varios estudios para simular el com-

portamiento de una celda de combustible microbiana

pero hasta ahora no se había tratado de acoplar el

modelo in silico1 de la bacteria a la simulación de la

celda de combustible con el objetivo de tener una

mejor predicción del comportamiento de la celda.

Se usó como especie P. aeruginosa, la cual es ubi-

cua a varios ambientes y es capaz de sobrevivir en

un gran rango de entornos [8], aunque es mejor co-

nocida por su carácter oportunista [9]. Recientemen-

te se descubrió que la P. aeruginosa puede formar

biopelícula bajo condiciones muy bajas de oxígeno

como las que se encuentran en la MFC. Es por estas

razones que se escogio esta bacteria.

El proyecto se llevo a cabo en dos fases. En primer

lugar se planteó el metabolismo de la P.aeruginosa

como un problema de programacion lineal y se

resolvió. Mas adelante las predicciones del problema

de programacion lineal se acoplaron a un modelo de

celda de combustible con el objetivo de simular el

desempeño de esta. Despues las predicciones del

modelo fueron comparadas con los resultados reales

1.1 Celdas de combustible

Una celda de combustible está compuesta por un

electrodo positivo (ánodo) y un electrodo negativo

(cátodo), los dos se encuentran separados y sumer-

gidos en una membrana. El propósito de la celda es

convertir la energía electroquímica de reactivos, en

el caso de las MFC estos reactivos o combustibles

1 Expresión que significa hecho por computador o vía simu-

lación computacional y normalmente usada en experimentos

biológicos.

pueden ser glucosa o glicerol, directamente en

energía eléctrica y energía térmica.

El combustible, se oxida en el ánodo liberando pro-

tones y electrones. Los protones se transportan hacia

el cátodo a través de la membrana, mientras que los

electrones recorren un circuito externo hasta que lle-

gan al cátodo. Para acelerar la producción de proto-

nes y electrones, se adicionan sustancias catalizado-

ras, normalmente metales nobles, tanto en el ánodo

como en el cátodo. En la figura 1 se puede observar

las reacciones que suceden en la celda de combusti-

ble de hidrogeno.

𝐴𝑛𝑜𝑑𝑜:𝐻2(𝑔) → 2𝐻+ + 2𝑒−

𝐶𝑎𝑡𝑜𝑑𝑜:1

2𝑂2 𝑔 + 2𝐻+ + 2𝑒− → 𝐻2𝑂

𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙:𝐻2 +1

2𝑂2 → 𝐻2𝑂 + 𝑒𝑛𝑒𝑟𝑔𝑖𝑎 𝑒𝑙𝑒𝑐𝑡𝑟𝑖𝑐𝑎 + 𝑐𝑎𝑙𝑜𝑟

Figura 1. Reacciones básicas en una celda de combustible.

Muchos tipos de celdas están siendo investigadas en

este momento, el trabajo en cuestión se centrara en

las MFCs. Actualmente se realizan diversas investi-

gaciones en las que energía bioquímica es transfor-

mada en electricidad, estas celdas son conocidas

como Celdas de Combustible Microbianas MFC. En

estas celdas ocurre una reacción de oxidación-

reducción de un carbohidrato como glucosa (com-

bustible) usando un microorganismo como cataliza-

dor.

El hecho de utilizar microorganismos como catali-

zador hace que los costos se reduzcan, pues se está

evitando el uso de metales nobles de costos eleva-

dos. Adicionalmente, las reacciones ocurren a un pH

neutro y a temperatura ambiente [2], lo cual también

reduce los costos ya que no se necesita de energia

para aumentar la temperatura o sustancias caras para

manetener el pH.

Una bacteria es un organismo unicelular que actúa

sobre compuestos orgánicos degradándolos en 𝐶𝑂2,

agua y energía. Al usar una MFC se puede convertir

parte de esta energía producida por los microorga-

nismos a electricidad.

Las bacterias viven en el ánodo y convierten un sus-

trato, glucosa, en 𝐶𝑂2, protones y electrones. Bajo

condiciones aeróbicas, las bacterias usan el oxígeno

o nitrato como el aceptor final para producir agua.

Sin embargo si no hay oxígeno entonces las bacte-

rias cambian su aceptor a un aceptor insoluble, por

ejemplo fenazina. Debido a esta propiedad de las

bacterias, se puede usar una MFC para recolectar los

electrones que se originan en el metabolismo micro-

biano. Dichos electrones se hacen fluir a través de

un circuito y generar una corriente eléctrica. Los

protones por su lado fluyen al cátodo a través de la

membrana y en el cátodo un aceptor de electrones es

reducido [6].

Se han hecho mejoras en las MFCs, más específica-

mente en la selección de los microorganismos, el

uso de diferentes mediadores para mejorar la trans-

ferencia de electrones, la cinética del proceso y el

uso de diferentes tipos de electrodos [5]. El presente

estudio plantea el metabolismo de la bacteria como

un problema de programacion lineal, en el cual las

restricciones son los balances de masa alrrededor de

cada metabolito Y el objetivo es maximizar la

produccion de electricidad por parte de las bacterias.

Para los investigadores el hecho de poder predecir el

comportamiento del organismo bajo diferentes

condiciones tiene un gran beneficio desde el punto

de vista económico ya que permite el ahorro de

dinero al no tener que ir al laboratorio cada vez que

se desea probar una configuración específica del

organismo. Por el otro lado, permite aumentar la

eficiencia de la celda al tratar con diferentes

configuraciones en el organismo in silico y ver cual

produce mayor electricidad.

En el presente estudio se utiliza una celda de cámara

única (single chamber MFC). Las celdas de única

cavidad con cátodo al aire son una gran promesa en

la investigación de celdas de combustible microbia-

no porque tienen una construcción fácil, una opera-

ción sostenible y densidades de corriente relativa-

mente altas [7].

1.2 Análisis de flujo metabólico

Una red metabólica es el conjunto completo de todos los procesos metabólicos que determinan las propie-dades fisiológicas y bioquímicas de una célula. De esta forma éestas redes se componen de todas las re-acciones químicas del metabolismo así como las in-teracciones reguladoras que guían estas reacciones. [40]

Existen varios enfoques para el estudio de redes me-tabólicas mediante métodos matemáticos, algunos son: Control de análisis metabólico, Análisis de flux metabólico, Análisis de rutas metabólicas, Teoría bioquímica de sistemas.

Para poder predecir el comportamiento del metabo-

lismo de las bacterias y optimizarlo se utiliza el aná-

lisis de flujo metabólico (MFA), metodología que

permite la determinación de caminos de flujos me-

tabólicos.

Un flux es la tasa a la cual cierto metabolito de una

red metabólica es transformado en otro metabolito

de dicha red [11].

El MFA constituye la base de la ingeniería metabó-

lica al ser una herramienta útil para conocer la dis-

tribución de fluxes dentro de la célula y su regula-

ción, lo que permite al ingeniero poder predecir

comportamientos de la célula y realizar mejoras a

esta in silico [37]. Esto conlleva a ahorrar tiempo y

dinero ya que es posible predecir los comportamien-

tos de la célula bajo diferentes condiciones y no es

necesario ir al laboratorio.

Para poder analizar, interpretar y predecir el com-

portamiento celular, cada reacción individual de la

red metabólica debe ser descrita. Debido a que de-

ntro de la célula, por su tamaño, no es posible cal-

cular ecuaciones de velocidad de reacción con

parámetros cinéticos es necesario utilizar otro enfo-

que. El método que se utiliza es el análisis de flujo

metabólico en donde se hace un balance de masa al-

rededor de cada metabolito, cada uno de ellos repre-

senta una restricción del problema de programación

lineal.

Para poder evaluar cada paso individual de la red

metabólica se deben evaluar teóricamente las capa-

cidades de un proceso celular integrado y examinar

las distribuciones factibles de los flux metabólicos

asumiendo estado estacionario.

En este enfoque de estado estacionario, los flujos in-

tracelulares son determinados usando modelos de

redes metabólicas estimados a partir de la literatura

y bases de datos (Figura A.1) para las reacciones in-

tracelulares principales y aplicando balances de ma-

sa alrededor de los metabolitos. Los balances de ma-

sa se vuelven las restricciones del problema.

Un conjunto de flujos extracelulares medidos son

usados como información de entrada para el modelo,

típicamente son las velocidades de consumo de sus-

tratos y las velocidades de secreción de metabolitos.

El resultado del MFA es el diagrama de todas las re-

acciones bioquímicas incluidas en los cálculos junto

con el estimado de la velocidad de estado estaciona-

rio a la cual cada reacción sucede [11]. En resumen

el MFA es un método computacional que calcula

flujo de reacciones, su distribución dentro de una red

metabólica y con esto calcula tasas de crecimiento

[12].

Para poder realizar el MFA, utilizando los balances

de masa, la red debe ser primero representada como

una matriz estequiométrica 𝑆. Por convención, las fi-

las de la matriz 𝑆 representan los metabolitos y las

columnas representan las reacciones. En esta matriz

los sustratos tienen coeficientes negativos y los pro-

ductos tienen coeficientes positivos. La matriz 𝑆 de-

be describir totalmente las reacciones en la red y

también debe tener en cuenta las reacciones de

transporte a través de la membrana, representadas

como reacciones que convierten compuestos intrace-

lulares a extracelulares [8].

En la figura 1 se puede observar un sistema metabó-

lico simple con su matriz estequiométrica 𝑆, en don-

de las columnas representan las reacciones y las filas

los metabolitos o compuestos. Las letras (A, B, C)

representan cada una un compuesto o metabolito de-

ntro de la red. Los fluxes o sea la tasa específica a la

cual se está formando o despareciendo un metabolito

está representado por V1, V2, etc.

Para poder obtener la predicción de los flujos se

asume que la red metabólica se encuentra en estado

estacionario, esto significa que la concentración de

los metabolitos intracelulares no cambia durante la

simulación. A partir del estado estacionario se puede

hacer un balance de masa para cada metabolito y de

este balance de masa generar una matriz este-

quiométrica. En la figura 2 se observa la matriz es-

tequiométrica en donde los productos tienen coefi-

ciente positivo y los reactivos tienen coeficiente

negativo.

Es este estado estacionario el que hace que los resul-

tados del MFA sean directamente comparables a los

datos medidos de las células y que el problema sea

de naturaleza lineal. Otra consecuencia de este su-

puesto es que solo los metabolitos que se localizan

en puntos extremos de las reacciones tienen que ser

considerados. Todos los intermediaros en una se-

cuencia lineal de reacciones se pueden eliminar [11].

Figura 2. Matriz estequiométrica[8]

La condición de estado estacionario se representa

con la ecuación 𝑆 ∗ 𝑉 = 0. Esta ecuación es un ba-

lance de materia para cada metabolito, en donde S es

la matriz estequiométrica y 𝑉 es un vector columna

de los fluxes en la red. Este balance forma un siste-

ma de ecuaciones (Figura 3). El sistema de ecuacio-

nes generado está conformado por K ecuaciones li-

neales (K Metabolitos) y J incógnitas (J

Reacciones). Por lo tanto los grados de libertad de

nuestro sistema son 𝐹 = 𝐽 − 𝐾

Figura 3. Problema de programación lineal general [8]

Por lo tanto algunos de los elementos de 𝑉tienen que

ser medidos para poder determinar los elementos

restantes. Si exactamente F flujos se pudieran medir

entonces el sistema estaría determinado y la solución

sería única y simple de obtener. En el caso de estu-

dio se conocen menos flujos que F aproximadamen-

te el numero de grados de libertad de nuestro pro-

blema es 1260, esto significa que el sistema está

sub-determinado por lo tanto, los flujos restantes so-

lo podrán ser determinados si restricciones adiciona-

les se introducen y un criterio de optimización se

impone sobre los balances metabólicos [11], todo es-

to

En la figura 3 se puede observar cómo queda el pro-

blema de programación lineal. La primera línea se

refiere a la función objetivo del problema en este

ejemplo seria el flux V5. Las siguientes tres líneas

de la figura 3 son las restricciones del problema, el

primer grupo de restricciones son los límites supe-

rior e inferior para cada flux, estos límites están da-

dos por restricciones de toma de sustrato y limites

termodinámicos. El segundo grupo de restricciones

son las restricciones que están dadas por el balance

de masa, el tercer grupo de restricciones son las de

no negatividad, estas restricciones de no negatividad

son necesarias debido a que el algoritmo usado para

solucionar el problema de programación lineal

(Simplex) así lo requiere

Como el sistema está sub-determinado existe infini-

to número de soluciones factibles para la red de flu-

jos. En este caso la programación lineal se usa para

determinar la distribución de los flujos intracelula-

res, dada una función objetivo apropiada que se

pueda especificar. La optimización de MFA está res-

tringida por la estequiometria de la red y los limites

superiores e inferiores de toma de sustrato y termo-

dinámicos (figura 3). A este problema también se le

pueden agregar restricciones condicionales como re-

gulación de genes [13]. Con este enfoque es posible

obtener una solución única para los flujos intracelu-

lares optimizando la función objetivo sujeta a las

restricciones de los balances metabólicos [11].

2 MATERIALES Y METODOS

2.1 Simulación

2.1.1 Reconstrucción de la red

La reconstrucción de la red se realizara usando como

base el mapa metabólico de P. aeruginosa desarro-

llado por un trabajo anterior [8]. La Tabla 1 mues-

tra un resumen del modelo para la P. aeruginosa

propuesto por Oberhardt[8] . Dicho modelo tiene

en cuenta 1056 genes relacionados con 883 reaccio-

nes (Tabla 1) incluyendo caminos anabólicos que

son necesarios para la síntesis de la mayoría de la

biomasa celular a partir de los precursores metabóli-

cos básicos.

Tabla 1 Descripción modelo de P. aeruginosa.

(Oberhardt.8).

Características IMO1056

Genes en el modelo 1056

Proteínas en el modelo 1030

Reacciones en el modelo 883

Asociadas a genes 839

No asociadas a genes 44

Numero de referencias de literatura 82

Confianza promedio de identificación de reacciones 2.22

El modelo tiene en cuenta la mayoría de los proce-

sos metabólicos incluyendo el proceso energético

que es el de principal interés para nuestro trabajo. En

la figura 3 se muestra un esquema de cómo están

distribuidas las diferentes reacciones de la red me-

tabólica dependiendo del subsistema al que pertene-

cen.

Figura 4. Reacciones por grupos.

A continuación se presenta un diagrama en donde se

muestra como están asociadas las diferentes interfa-

ces que se utilizaron en el proyecto [8].

Figura 5. Diagrama de las diferentes interfaces

usadas y su relación.

2.1.2 Formulación de la matriz 𝑆

Para poder realizar el MFA la red debe ser represen-

tada en la forma de la matriz estequiométrica 𝑆, co-

mo se muestra en la figura 2. Para poder hacer esta

matriz se construyó un macro de Visual Basic en

Microsoft Excel® (Anexo 1). El programa tiene co-

mo entradas las reacciones del sistema y los metabo-

litos en formato de texto y genera la matriz este-

quiométrica. Esta aplicación tiene la ventaja de una

gran flexibilidad de aplicación ya que puede ser uti-

lizada fácilmente para calcular la matriz de este-

quiométrica de cualquier red metabólica si se dispo-

ne de las reacciones y los metabolitos. La aplicación

se corrió en un computador Dell con 4GM de RAM

y un procesador Intel 𝐶𝑜𝑟𝑒2 Duo de 1.8 Ghz.

2.1.3 Programación lineal y análisis de flujo me-

tabólico (MFA)

Para poder realizar el MFA se definió una reacción

lineal de biomasa y una reacción lineal de produc-

ción de fenazina. La función objetivo hacia la cual la

distribución de flujo de la red se optimizará será la

suma de estas dos.

La función de biomasa representa una razón ponde-

rada de los componentes que forman el peso seco de

la célula, como también la hidrólisis del ATP para

tener en cuenta las necesidades de energía relacio-

nadas con el crecimiento celular y el mantenimiento

de la célula.

La optimización de la biomasa se justifica por el su-

puesto de que las bacterias han sido optimizadas

evolutivamente para crecer y estudios experimenta-

les han ratificado este supuesto [13], [15]. La opti-

mización de fenazina se justifica bajo el supuesto de

que en ausencia de oxígeno la célula necesita produ-

cir transportadores de electrones.

Como se explicó anteriormente, debido a su natura-

leza indeterminada, es necesario optimizar el siste-

ma.

Figura 6. Problema de Programación lineal.

El problema de optimización planteado (figura 6), se

resolvió usando una plataforma que permite resolver

problemas de programación lineal llamado Xpress

MP Professional®. El insumo de este modelo es la

matriz estequiométrica, el número de reacciones y

los metabolitos. El programa contiene las restriccio-

nes de los límites superiores e inferiores de los flujos

que se colocaron con base al problema de optimiza-

ción planteado arriba (figura 1,). Este programa

también se corrió en computador Dell con 4GM de

RAM y un procesador Intel 𝐶𝑜𝑟𝑒2 Duo de 1.8 Ghz.

2.1.4 Crecimiento celular de Pseudomonas aerugi-

nosa.

Aunque existen muchas leyes para la velocidad de

crecimiento celular, la expresión que se usa más

comúnmente es la ecuación de Monod para el creci-

miento exponencial (Ecuación 2). En nuestro mode-

lo asumimos que la concentración de sustrato es tan

alta que el sistema está saturado y la velocidad de

crecimiento específica es la máxima. El coeficiente

de crecimiento relaciona la cantidad de células nue-

vas formada con la masa de sustrato consumida. Con

esta información se puede calcular la velocidad de

desaparición del sustrato. (Ecuación 1).

Para poder acoplar apropiadamente el modelo de la

P. aeruginosa a la celda de combustible tendremos

que generar varios valores de salida del modelo a

través del tiempo para poder alimentar la celda de

combustible y de esta forma obtener unas curvas de

densidad de corriente con respecto al tiempo.

Para poder lograr que el modelo genere diferentes

valores de producción de fenazina lo tenemos que

alimentar con diferentes valores de sustrato. Para

esto vamos a usar un modelo matemático que predi-

ga como se va consumiendo la glucosa con respecto

al tiempo y con estos datos poder alimentar el mode-

lo de P. aeruginosa.

El modelo que usaremos será el siguiente:

𝑟𝑠 = 𝑌𝑆

𝐶

∗ 𝑟𝑔 (1)

𝑟𝑔 = 𝑢 ∗ 𝐶𝑐 (2)

Donde 𝑟𝑠 es la velocidad de consumo de sustrato

𝑔𝑟 ∙𝐺𝑙𝑐

𝑕𝑟 , 𝑌𝑆

𝐶

es el coeficiente de rendimiento

𝑔𝑟 ∙𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜

𝑔𝑟 ∙𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 , 𝑟𝑔es la velocidad de crecimiento celu-

lar(𝑔𝑟 ∙𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎

𝐿∙𝑕),𝑢 es la velocidad de crecimiento espe-

cifica 𝑕−1 y 𝐶𝑐es la concentración de células(𝑔𝑟

𝐿).

2.1.5 Modelo en Comsol Multiphysics®

Las simulaciones de la celda de combustible se rea-

lizaron utilizando el software Comsol Multiphy-

sics®, este software es un ambiente interactivo para

modelar sistemas científicos y de ingeniería basados

en ecuaciones diferenciales parciales (PDEs). Usan-

do el método de elementos finitos [16]. Este pro-

grama contiene la herramienta CAD (“Computer ai-

ded design”) que es la interface para la

especificación de ecuaciones, parámetros químicos y

físicos, generación de mallas, optimizadores así co-

mo también las herramientas de visualización y

post-procesamiento.

Para este estudio será necesario realizar un modelo

de la celda de combustible en Comsol Multiphy-

sics® y después acoplarle las reacciones de interés

que obtuvimos en el MFA. Para el modelo de la cel-

da de combustible los flujos de interés son la Pyo-

cianina y la phenazina-1-carboxamida, ya que en la

literatura son reportados como lo metabolitos que

funcionan como mediadores de la P.aeruginosa para

la transferencia de electrones entre la bacteria y el

ánodo. [17]

El modelo con el cual se va a trabajar consiste en

cuatro dominios: un ánodo (Ω𝑎), una membrana de

intercambio de protones de Nafion (Ω𝑚), un cátodo

Ω𝑐 y un medio de cultivo(Ω𝑔) . Cada uno de los

electrodos porosos está en contacto con un recolec-

tor de corriente 𝜕𝐶𝑎 ,𝑐𝑐 , 𝜕𝐶𝑐 ,𝑐𝑐 [18]

En nuestro caso, debido a que tenemos una celda de

combustible microbiana, debemos acoplar las reac-

ciones que suceden tanto en el cátodo como en el

ánodo.

Las ecuaciones que describen el modelo de la celda

de combustible son una combinación de las ecuacio-

nes de difusión-reacción en una partícula esférica y

la ecuación de Butler-Volmer, Ley de Darcy y la

ecuación de Maxwell-Stefan, la ecuación de Laplace

para potencial electrico

Para obtener más información acerca de las ecuacio-

nes del modelo de la celda de combustible y sus

condiciones de frontera ver en Anexo 5. En la figura

7 se muestra un diagrama de la celda de combustible

en el modelo.

Figura 7. Diagrama de la celda

Para calcular el voltaje en la celda se sacara un

promedioa de la densidad de corriente integrando

sobre todo el anodo y despues se utilizara la ley de

Ohm para calcular el potencial.

𝑉 = 𝐼 ∗ 𝑅

Ecuacion 23

2.1.6 Componentes de la celda (Single Chamber):

La celda que se uso en la experimentación consiste

de una celda de cámara sencilla con cátodo al aire

hecho en acrílico cristal. La celda tiene un compar-

timiento anódico de 3 cm y una longitud del tubo

central de 4 cm dando un volumen total de la celda

de 28,27 cm3

y logrando un área total del ánodo de 7

cm2. Debido a que las membranas PEM, son difíci-

les de conseguir y de un costo bastante alto, se deci-

dió reemplazarla con tela tipo J-Cloth, que son co-

merciales y realmente fáciles de conseguir [28], esta

tela se usa para evitar que haya difusión de oxígeno

a través del cátodo hacía la cámara anódica. La celda

se arma con tornillos que se aprietan con alicates

hasta lo máximo posible y se usan tapones sencillos

para asegurar que la celda sea hermética y a prueba

de fugas. En la simulación de la celda microbiana de

combustible en Comsol se utilizaran los mismos

parámetros de la celda experimental.

3 RESULTADOS

3.1 Simulación

3.1.1 Reconstrucción de la red

Se genero la matriz estequiométrica 𝑆 para la

P.aeruginosa usando el programa hecho en Micro-

soft Excel®. La Matriz generada está compuesta por

881 filas (metabolitos) y 1449 columnas (reaccio-

nes). El programa tomó 54 minutos en crear la ma-

triz 𝑆

3.1.2 Análisis de flujo metabólico

Se calcularon los flujos metabólicos del modelo in

silico para P.aeruginosa usando MFA. La tasa de

crecimiento máxima fue de

1.04793 𝐺𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎

𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎 ∗hor 𝑎 para un consumo de

glucosa de 10 (𝑚𝑚𝑜𝑙 𝐺𝑙𝑐 ∙𝑔𝑟

𝑔𝑟 ∙𝑕𝑟) , .Para unas condiciones

anaeróbicas la tasa de crecimiento tuvo un valor de

0.846 𝐺𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎

𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎 ∗hor 𝑎. Este valor encontrado para

la producción de biomasa cae dentro de los valores

que han sido determinados experimentalmente re-

portados en la literatura para condiciones similares

[24].

P.aeruginosa es reconocida por su habilidad de so-

brevivir en ambientes anaeróbicos por desnitrifica-

ción. El flujo para la desnitrifación fue incluido en el

modelo, ya que el organismo estará en condiciones

anaeróbicas en la celda de combustible, dando como

resultado una producción de biomasa de 0.846 𝑕−1.

También se calculo la producción de biomasa y fe-

nazina para diferentes consumos de glucosa con el

objetivo de evaluar la sensibilidad del modelo (Figu-

ra 8).

Figura 8. Grafica de la función objetivo vs sustrato

3.1.3 Crecimiento celular Pseudomonas aerugino-

sa.

Para calcular la producción de fenazina era necesa-

rio calcular la concentración de glucosa a través del

tiempo para de esta forma alimentar el modelo de

programación lineal y tener la concentración de fe-

nazina a través del tiempo:

Los valores de los parámetros escogidos de la litera-

tura para calcular la velocidad de consumo de sustra-

to fueron los siguientes [25]:

𝑢 = 0.02 𝑕𝑜𝑟𝑎𝑠−1

𝐶𝑐 = 1.725 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎/𝑙𝑖𝑡𝑟𝑜

𝑌𝑠𝑐

= 2.0472(𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎/𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎)

Esto resulto en un consumo de glucosa de:

𝑟𝑠 = 0.070628 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎/(𝑕𝑜𝑟𝑎 ∗ 𝑙𝑖𝑡𝑟𝑜)

En el estudio experimental cada 24 horas se le añad-

ían a la celda 5𝑚𝑙 de glucosa con una concentración

de 5𝐺𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎

𝑙𝑖𝑡𝑟𝑜 lo que daba una masa de glucosa

de 0.025 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎. En la siguiente tabla

podemos ver la glucosa en la celda en gramos y por 𝑚𝑚𝑜𝑙𝐺𝑙𝑐

𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎 ∗𝑕𝑜𝑟𝑎 con lo cual se alimenta el modelo

de Xpress.

00,20,40,6

0 1 2 3

Fun

cio

n o

bje

tivo

Tiempo

Funcion objetivo vs glucosa

Sensibilidad

Tabla 1.Glucosa con respecto al tiempo

Utilizando el dato de consumo de glucosa se predijo

la producción de fenazina a través del tiempo dando

la siguiente tabla y grafica como resultado.

Figura 9. Grafica de producción de fenazina con respec-

to al tiempo.

3.1.4 Modelo celda de combustible.

La entrada de fenazina al modelo de la celda de

combustible tiene que ser en fracción peso. Para este

fin, teniendo en cuenta las unidades del flujo de fe-

nazina que genera Xpress Professional, transforma-

remos el flujo de la siguiente manera.

En la tabla 2 se tabulo la fracción peso de fenazina

en la celda a través del tiempo. Donde W es la frac-

ción en peso de fenazina en la celda de combustible.

Tabla 2. Fracción peso de fenazina con respecto al tiempo.

Todos los parámetros de la celda de combustible se

estimaron a partir de la literatura. [38] [26] [28] [36]

[38] [3].

𝑘𝑠𝑒𝑓𝑓 = 20000 𝑆

𝑚

𝑘𝑚𝑒𝑓𝑓 = 0.124 𝑆

𝑚

𝑘𝑝 = 1−12 𝑚2

𝜂 = 2.1−5 𝑘𝑔

𝑚 𝑠

𝜀𝑚𝑎𝑐 = 0.6

𝜀𝑚𝑖𝑐 = 0.2

𝑃𝑟𝑒𝑓 = 7.4660 ∗ 104(𝑃𝑎)

𝑘𝑎𝑝𝑝𝑎𝑝 = 10−12 𝑚2

𝑆 = 250(𝑚−1)

En la figura 10 se pueden observar los resultados

que se obtuvieron de la simulación de la celda de

combustible. Se realizaron 10 corridas de la simula-

ción con cada dato de fenazina. Se asumió que la

celda de combustible la resistencia era de 1000

𝑜𝑕𝑚𝑖𝑜𝑠. Si comparamos los datos que se obtuvieron

de la simulación con los de la cronoamperometria en

la figura A5.3 los voltajes máximos obtenidos son

muy parecidos.

Glucosa(mMol/gramos celula*hora)

Glucosa(gra

mos) Horas

2.85 0.02500 0

2.62 0.02300 1

2.39 0.02101 2

2.16 0.01901 3

1.94 0.01701 4

1.71 0.01502 5

1.48 0.01302 6

1.25 0.01102 7

1.03 0.00902 8

0.80 0.00703 9

0.57 0.00503 10

0.35 0.00303 11

0.12 0.00104 12

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 5 10 15

Fen

azin

a(m

Mo

l/gr

amo

s ce

lula

ho

ra)

tiempo(horas)

Fenazina vs tiempo

Fenazina(mMol/gramos celula hora)

Horas Fenazina(mMol/gramos celula hora) Wfenazina

0 0.400 0.000400

1 0.368 0.000368

2 0.336 0.000336

3 0.304 0.000304

4 0.272 0.000272

5 0.240 0.000240

6 0.208 0.000208

7 0.176 0.000176

8 0.144 0.000144

9 0.112 0.000112

10 0.081 0.000081

11 0.049 0.000049

12 0.017 0.000017

Figura 10. Voltaje producido por la celda a través del tiem-

po.

En la figura 11 se puede ver el potencial eléctrico en

toda la celda como una grafica de superficie y en la

figura 13 la densidad de corriente en el ánodo.

Figura 11. Grafica de voltaje en la celda.

En la figura 12 se observa una grafica de la fracción

másica de fenazina en el ánodo, es importante desta-

car como va disminuyendo la concentración de fe-

nazina a medida que va reaccionando.

Figura 12. Fracción másica de fenazina en el ánodo.

Figura 13. Densidad de corriente en el ánodo.

4 DISCUSION Y CONCLUSIONES

4.1 Modelo in silico de P. aeruginosa

Se construyo un modelo in silico para P.aeruginosa

que se compone de 885 reacciones. El modelo in-

cluye caminos metabólicos necesarios para creci-

miento y para producción de la mayoría de los facto-

res de virulencia. El modelo se valido con datos

experimentales encontrados en la literatura y las

predicciones del modelo fueron consistentes con los

datos que se encontraron en la literatura.

El MFA es una herramienta fundamental que nos

permitió hacer predicciones, que fueron validados

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0 10 20

Vo

ltio

s

Horas

Voltaje vs tiempo

Simulacion 1

Simulacion 2

Simulacion 3

Simulacion 4

Simulacion 5

por datos experimentales, acerca del comportamien-

to de la bacteria sin tener que ir al laboratorio lo que

representa una ventaja importante ya que se ahorra

tiempo y dinero.

4.2 Modelo celda de combustible

Aunque tiene limitaciones sobre todo desde el punto

de vista electroquímico, el modelo de la celda de

combustible microbiana describió con un margen de

error aceptable el comportamiento de la celda en el

laboratorio se puede decir que es un buen primer

acercamiento a un modelo sofisticado de una celda

microbiana de combustible.

4.3 Trabajo futuro

Es necesario comenzar a pensar en aumentar la pro-ducción de fenazina en la célula y bajar los costos de producción. Para esto será posible utilizar el pro-blema de programación lineal desarrollado en este proyecto para probar diferentes estrategias para me-jorar esta producción de fenazina en el modelo in si-lico, encontrar la mejor estrategia y después prose-guir a la experimentación. Desde el punto de vista de reducción de costos será necesario empezara a traba-jar el modelo con sustratos diferentes a la glucosa, una opción interesante seria el glicerol por su rela-ción con los biocombustibles.

Desde el punto de vista del modelo de la celda de combustible sería interesante en un futuro incluirle ecuaciones que describan la reversibilidad de las re-acciones de oxidación de los transportadores de electrones ya que el modelo actual no describe dicha propiedad. También se podría incluir el crecimiento y la topología de la biopelícula dentro del modelo para acercarnos más a la realidad. AGRADECIMIENTOS Los autores quisieran agradecer a FICO por proveer las licencias de Xpress-MP Professional bajo el acuerdo institucional con la Universidad de los An-des.

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6. ANEXOS

ANEXO 1: Red metabólica de P.aeruginosa

Figura A.1. Diagrama de la red metabólica [8].

ANEXO 4. Descripción modelo celda de combustible. El modelo toma las capas activas de los dos electrodos como condiciones de frontera. Esto quiere decir que se

tratan la densidad de las corrientes de transferencia de carga, generalmente descritas usando la ecuación ciné-

tica de Butler-Volmer como una condición de frontera. Para la ecuación del potencial del electrolito esto re-

sulta en una condición en donde la densidad de la corriente iónica en el ánodo y en el cátodo se especifica con

la siguiente ecuación [18]:

𝑖𝑒 = 𝐿𝑎𝑐𝑡 1 − 𝜀𝑚𝑎𝑐 𝐽𝑎𝑔𝑔 ,𝑒 [6]

Donde 𝑒 es el subíndice para cátodo o ánodo,𝐿𝑎𝑐𝑡 es el grosor de la capa activa, 𝜀𝑚𝑎𝑐 es la porosidad ma-

croscópica y 𝐽𝑎𝑔𝑔 son las densidades de corriente dadas por el modelo aglomerado.

El modelo aglomerado describe la densidad de corriente en la capa activa, la cual consiste en aglomerados de

material conductor iónico y partículas conductoras de energía que están cubiertas parcialmente con cataliza-

dor. La densidad de corriente local puede ser expresada analíticamente resolviendo la ecuación de difusión y

la ecuación cinética de Butler-Volmer para un aglomerado que tiene potenciales iónicos y eléctricos constan-

tes. La ecuación resultante para la densidad de corriente es la siguiente. [19]

𝐽𝑎𝑔𝑔 ,𝑒 = −6𝑛𝑐𝐹 𝐷𝑎𝑔𝑔

𝑅𝑎𝑔𝑔2 1 − 𝜆𝑒𝑐𝑜𝑡𝑕𝜆𝑒 𝛽𝑒 (7)

𝜆𝑎 = (𝑖0𝑎𝑆𝑅𝑎𝑔𝑔2 )/(2𝐹𝐶𝐶13𝐻9𝑂𝑁3,𝑟𝑒𝑓𝐷_𝑎𝑔𝑔 (8)

𝜆𝑐 = 𝑖𝑜𝑐 𝑆𝑅𝑎𝑔𝑔

2

4𝐹𝑐𝑂 2,𝑟𝑒𝑓 𝐷𝑎𝑔𝑔𝑒𝑥𝑝(−

𝐹

2𝑅𝑇𝜂𝑐) (9)

𝛽𝑎 = [𝐶𝐶13𝐻9𝑂𝑁3,𝑟𝑒𝑓 − 𝐶𝐶13𝐻9𝑂𝑁3,𝑟𝑒𝑓 𝑒𝑥𝑝(−2𝐹

𝑅𝑇𝜂𝑎)] (10)

𝛽𝑐 = 𝐶𝑜2,𝑎𝑔𝑔 [11]

En donde otra vez el índice 𝑒 es el subíndice para cátodo o ánodo, 𝐷𝑎𝑔𝑔 es la difusividad del gas en el aglo-

merado (m2/s), 𝑅𝑎𝑔𝑔 es el radio de partícula del aglomerado (m), 𝜂𝑒 es el número de transferencia de carga 1

para el ánodo, -2 para el cátodo, 𝑆 es el área específica del catalizador dentro del aglomerado (1/m), 𝐹 es la

constante de Faraday.

𝐶𝑖 ,𝑟𝑒𝑓𝑓 Son las concentraciones de referencia de las especies, 𝐶𝑖 ,𝑎𝑔𝑔 son las concentraciones de las especies

en la superficie del aglomerado en el ánodo se supuso que la concentración de fenazina era 0 para que la fena-

zina migrara del medio de cultivo hacia el ánodo.

Para el dominio del medio de cultivo la concentración de fenazina de referencia va a ser la que nos dé la solu-

ción del problema de programación lineal.

𝑖0𝑎 , 𝑖0𝑐 Son las densidades de corriente de intercambio de referencia, 𝑇 es la temperatura y los sobre-voltajes

en el ánodo y cátodo están dados por las siguientes ecuaciones Donde 𝐸𝑒𝑞 es el voltaje de equilibrio [19].

𝜂𝑎 = 𝜙0 − 𝜙𝑚 − 𝐸𝑒𝑞 ,𝑎 (12)

𝜂𝑐 = 𝜙0 − 𝜙𝑚 − 𝐸𝑒𝑞 ,𝑐 (13)

Para los potenciales eléctricos, las condiciones de frontera de los electrodos son idénticas, lo único que cam-

bia son los signos.

La diferencia de potencial entre los recolectores de corriente en el cátodo y el ánodo corresponde al voltaje to-

tal de la celda de combustible. Si se escoge el potencial en el recolector de corriente en el ánodo como el nivel

de referencia y le ponemos un valor de cero. Entonces el voltaje total de la celda sirve como una condición de

frontera en el recolector de corriente en el cátodo. Como se puede ver en las siguientes ecuaciones

𝜙0 = 0 𝑒𝑛 Ω𝑎 ,𝑐𝑐 (14)

𝜙0 = 𝑉𝑐𝑒𝑙𝑑𝑎 𝑒𝑛 Ω𝑐 ,𝑐𝑐 (15)

Para modelar el flujo de gases en el cátodo se usa la ley de Darcy. La velocidad del gas se da por la ecuación

de continuidad:

∇ 𝜌𝑢 = 0 𝑒𝑛 Ω𝑐 (16)

Donde 𝜌 es la densidad de la mezcla de gases (Kg/m3) y 𝑢 denota la velocidad del gas (m/s). La ley de Darcy

para medios porosos dice que el gradiente de presión, la viscosidad del fluido y la estructura del medio poroso

determina la velocidad [18]

𝑢 = −𝑘𝑝

𝜂∇𝑝 (17)

Donde 𝐾𝑝 denota la permeabilidad del electrodo (m2), 𝜂 la viscosidad del gas (Pa*s) y 𝑝 es la presión (Pa).

La ley de gases ideales nos da la densidad para la mezcla de gases en el cátodo.

𝜌 =𝑃

𝑅𝑇 𝑀𝑖𝑋𝑖𝑖 (18)

Donde R es la constante de gases ideales, P es la presión, T es la temperatura y M es el peso molar de cada

gas. En las entradas y salidas de la celda es necesario especificar las presiones, en frontera del electrodo para

el cátodo, definimos las siguientes condiciones de frontera de presión para la ecuación de Darcy en el cátodo.

𝑃 = 𝑃𝑐 ,𝑖𝑛 𝑒𝑛 Ω𝑐 ,𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑑𝑎 (19) .

𝑃 = 𝑃𝑟𝑒𝑓 𝑒𝑛 Ω𝑐,𝑠𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎 (20)

En la frontera del electrodo para el cátodo, la velocidad del gas en se calcula a partir del flujo másico total

dado por las reacciones electroquímicas.

−𝑛 ∙ 𝑢 𝑐𝑎𝑡𝑜𝑑𝑜 =𝐽𝑐𝑎𝑡𝑜𝑑𝑜

𝜌𝐹(𝑀𝑂2

4+

1

2+ 𝜆𝐻2𝑂 𝑀𝐻2𝑂) (21)

Combinada con la condición de frontera anterior la ley de Darcy aplicada al modelo determina la velocidad de

flujo de gas y preserva la ley de conservación de masa para el gas en el cátodo [18].

Este modelo toma en cuenta dos especies en el ánodo 𝐶13𝐻9𝑂𝑁3,𝐻2𝑂 y tres en el cátodo 𝑂2,𝐻2𝑂,𝑁2 (aire).

El modelo usa una instancia del modelo de difusión y convección de Maxwell-Stefan para cada electrodo. Se

asumen dos cosas: el efecto de la temperatura sobre la difusión es insignificante y no fenómenos conectivos

en el ánodo solo difusivos.

El transporte de masa se puede describir a partir de las siguientes tres ecuaciones de transporte de masa de

Maxwell-Stefan que asumen que la difusión por gradientes de temperatura es insignificante (oxígeno=1,

agua=2, nitrógeno=3). Las siguientes ecuaciones modelan el transporte de masa para el cátodo, para el ánodo

las ecuaciones son similares pero sin términos convectivos.

Δ −𝜌𝑤1 𝐷1𝑗 ∇𝑥𝑗 + 𝑥𝑗 − 𝑤𝑗 ∇𝑝

𝑝 𝑗 = −(𝜌𝑢 ∙ ∇𝑤1) [22]

Δ −𝜌𝑤2 𝐷2𝑗 ∇𝑥𝑗 + 𝑥𝑗 − 𝑤𝑗 ∇𝑝

𝑝 𝑗 = −(𝜌𝑢 ∙ ∇𝑤2) [23]

𝑤3 = 1 −𝑤1 − 𝑤2 [24]

En estas ecuaciones 𝑃 es la presión, T es la temperatura (K) y 𝑢 es la velocidad del gas (m/s). El parámetro

𝐷𝑖𝑗 se calcula de las difusividades binaria encontradas en la literatura. Las fracciones másicas de alimentación

se especifican en la entrada del cátodo, para el caso del ánodo existe una fracción másica como condición ini-

cial pero es en la frontera entre el ánodo y el medio de cultivo. A las salidas del cátodo, condiciones de fronte-

ra de flujo convectiva se aplican. Para el caso del ánodo se aplican condiciones de frontera difusivas.

En la frontera entre la membrana y electrodo los flujos másicos de las diferentes especies se determinan a par-

tir de las cinéticas de las reacciones.

Para resolver este sistema de ecuaciones Comsol usa el paquete UMFPACK. Este paquete contiene un con-

junto de rutinas para resolver sistemas de ecuaciones lineales, Ax=b, cuando A es dispersa y anti-simétrica.

[41]