1

Desarrollo y optimización de un sensor óptico para

cuantificación y control de calidad de soluciones de

anticuerpos monoclonales

Olga RubioOlga Rubio

2

Sistema Inmune

Sistema inmune:Sistema inmune: conjunto de elementos conjunto de elementos especiales de un organismo, que le permite especiales de un organismo, que le permite defender su integridad biológica frente a defender su integridad biológica frente a agresiones esencialmente externas (virus, agresiones esencialmente externas (virus, bacterias, hongos, etc.) bacterias, hongos, etc.) estímulo antigénicoestímulo antigénico

Anticuerpos (Ac)Anticuerpos (Ac) o inmunoglobulinas (Ig): o inmunoglobulinas (Ig): proteínas producidas en respuesta a la proteínas producidas en respuesta a la inmunización del organismo con inmunización del organismo con antígenos antígenos (Ag)(Ag) Cada Ac reacciona específicamente Cada Ac reacciona específicamente contra el mismo antígeno que indujo su contra el mismo antígeno que indujo su formación.formación.

3

Antígenos (Ag) y Anticuerpos (Ac)

Los Ag son estructuras Los Ag son estructuras complejas cuyas superficies complejas cuyas superficies tienen diversos sitios que tienen diversos sitios que reconocen cada uno un Ac reconocen cada uno un Ac específico.específico.

Estas zonas se llaman Estas zonas se llaman epitopes o determinantes epitopes o determinantes antigénicos pudiendo cada antigénicos pudiendo cada una, unirse a un Ac una, unirse a un Ac diferente.diferente.

Los Ac se unen a los Ag Los Ac se unen a los Ag por sitios llamados por sitios llamados paratopes paratopes

En los mamíferos se En los mamíferos se distinguen 5 Ac: IgM, distinguen 5 Ac: IgM, IgA, IgG, IgD e IgE que IgA, IgG, IgD e IgE que difieren en tamaño y difieren en tamaño y propiedades.propiedades.

4

Estructura del anticuerpo

Las cadenas se unen por puentes disulfuro. Las cuatro poseen una parte constante y una variable. Las zonas variables, tanto de la cadena L como H, poseen a su vez regiones en las que se concentra la variabilidad: tres segmentos que forman las llamadas regiones hipervariables o CDR

5

Anticuerpos monoclonales (AcMo)

Cuando se realiza una inmunización con el objeto Cuando se realiza una inmunización con el objeto de producir anticuerpos frente a un antígeno, se de producir anticuerpos frente a un antígeno, se produce gran variedad de inmunoglobulinas (produce gran variedad de inmunoglobulinas (Ac Ac policlonalespoliclonales) que poseen función de Ac frente a ) que poseen función de Ac frente a diferentes epitopes del antígeno.diferentes epitopes del antígeno.

Los Los anticuerpos monoclonalesanticuerpos monoclonales son reactivos son reactivos biológicos homogéneos en su actividad, en biológicos homogéneos en su actividad, en contraste con los antisueros convencionales contraste con los antisueros convencionales (policlonales) que son una mezcla variable de (policlonales) que son una mezcla variable de inmunoglobulinas.inmunoglobulinas.

6

Uso de los AcMo

Caracterización y cuantificación de sustancias de Caracterización y cuantificación de sustancias de interés biológico que se encuentran en cantidades interés biológico que se encuentran en cantidades muy pequeñas (hormonas, interferones, etc.)muy pequeñas (hormonas, interferones, etc.)

Identificación de antígenos presentes en las Identificación de antígenos presentes en las membranas celulares.membranas celulares.

En los trasplantes de órganos: los AcMo dirigidos En los trasplantes de órganos: los AcMo dirigidos contra los linfocitos T, se utilizan en casos de contra los linfocitos T, se utilizan en casos de amenaza de rechazo agudo.amenaza de rechazo agudo.

En Oncología para la localización de células En Oncología para la localización de células tumorales y/o su destrucción. tumorales y/o su destrucción.

En la detección de grupos sanguíneos y estudios de En la detección de grupos sanguíneos y estudios de fenotipo.fenotipo.

7

Interacción Ag-Ac

La zona por La zona por donde se unen donde se unen Ag y Ac se Ag y Ac se encuentra a encuentra a nivel de los nivel de los puentes puentes disulfuro disulfuro intercatenarios intercatenarios de la molécula de la molécula de Ac. (Zona de Ac. (Zona Bisagra) Bisagra)

Los Ac se unen por enlaces no covalentes a los epitopes de los Ag en sus sitios activos también llamados paratopes.

8

Características de la unión Ag-Ac

Afinidad: Interacción físico-química precisa entre el sitio de Interacción físico-química precisa entre el sitio de combinación de un Ac y un Ag. Se expresa a través de la combinación de un Ac y un Ag. Se expresa a través de la constante de asociación. kkaa y k y kdd son las velocidades de asociación y disociación. son las velocidades de asociación y disociación.

Avidez: fuerza total que considera todas las interacciones fuerza total que considera todas las interacciones epitope/paratope que tienen lugar entre un Ag complejo y epitope/paratope que tienen lugar entre un Ag complejo y Ac multivalentes. Ac multivalentes.

Especificidad de la unión Ag-Ac: un Ac se une fundamentalmente a un Ag determinado.

9

Adsorción de biomoléculas en solución a superficies sólidas

Es la fijación a la superficie de un sólido, de Es la fijación a la superficie de un sólido, de moléculas, átomos, o iones (adsorbato), por moléculas, átomos, o iones (adsorbato), por ejemplo los que se encuentran en una solución ejemplo los que se encuentran en una solución puesta en contacto directo con esa superficie. El puesta en contacto directo con esa superficie. El proceso inverso se llama desorción.proceso inverso se llama desorción.

Es resultado de la atracción entre las moléculas de Es resultado de la atracción entre las moléculas de la superficie del sólido adsorbente y el adsorbato.la superficie del sólido adsorbente y el adsorbato.

10

Quimisorción y Fisisorción

Quimisorción o Adsorción químicaQuimisorción o Adsorción química

Moléculas adsorbidas a la Moléculas adsorbidas a la superficie como resultado de la superficie como resultado de la formación de un enlace químico formación de un enlace químico (muy fuerte comparado con las (muy fuerte comparado con las fuerzas de ligadura en la fuerzas de ligadura en la fisisorción)fisisorción)

Tiempo de adsorción de Tiempo de adsorción de ss a a hshs

Fisisorción o Adsorción físicaFisisorción o Adsorción física Interacciones débiles: Interacciones débiles: Van Van

Der Waals,Der Waals, de atracción de atracción electrostática o atracciones electrostática o atracciones dipolares entre sitios de la dipolares entre sitios de la superficie y moléculas superficie y moléculas adsorbidas. adsorbidas.

Barreras del orden 0.3 a 1 Barreras del orden 0.3 a 1 kcal/mol. kcal/mol.

Tiempo de adsorción de Tiempo de adsorción de s s aa msms

Experimentalmente se encuentran dos órdenes de magnitud diferentes para la atracción que produce la adsorción, indicando dos

formas en que las moléculas se pegan a las superficies

11

Modelo de adsorción de Langmuir

Todos los sitios de la superficie son independientes, Todos los sitios de la superficie son independientes, equivalentes, distinguibles y de las dimensiones equivalentes, distinguibles y de las dimensiones laterales de las macromoléculas adsorbidas y laterales de las macromoléculas adsorbidas y aisladas,aisladas,

las moléculas adsorbidas (adsorbato), sólo las moléculas adsorbidas (adsorbato), sólo interaccionan con la superficie,interaccionan con la superficie,

las interacciones entre moléculas adsorbidas son las interacciones entre moléculas adsorbidas son despreciables por ser de corto alcance,despreciables por ser de corto alcance,

el adsorbato forma una capa monomolecular sobre el adsorbato forma una capa monomolecular sobre la superficie,la superficie,

las macromoléculas adsorbidas no se desplazan las macromoléculas adsorbidas no se desplazan sobre la superficie.sobre la superficie.

12

Representación simbólica del proceso de adsorción

Donde:Donde:AA indica una molécula de adsorbato, indica una molécula de adsorbato,SS indica un sitio de la superficie adsorbente, indica un sitio de la superficie adsorbente, ASAS es es el complejo adsorbato-superficie, el complejo adsorbato-superficie,

kka a es la velocidad de adsorción y es la velocidad de adsorción y

kkdd es la velocidad de desorción. es la velocidad de desorción.

ka

A + S AS kd

13

Factor de Recubrimiento

donde:donde: NN es la cantidad total de sitios de adsorción

X X cantidad de sitios ocupados por moléculas

adsorbidas

N

X

adsorción de sitios de total nº

ocupados adsorción de sitios de nº

FFracción ocupada del total de sitiosracción ocupada del total de sitios

14

Variación del recubrimiento

La velocidad deLa velocidad de

adsorción de lasadsorción de las

moléculas a la interface moléculas a la interface

es proporcional a la es proporcional a la concentración de adsorbato concentración de adsorbato en la solución, y a la en la solución, y a la fracción de sitios vacantes fracción de sitios vacantes de la superficie :de la superficie :

La velocidad La velocidad

de desorción, de desorción,

es proporcional a la es proporcional a la fracción de sitios fracción de sitios ocupados de la ocupados de la superficie:superficie:

La adsorción y desorción sobre el sustrato, ocurren simultáneamente en distintos puntos del mismo

) - (1 C kdt

daa

a

kdt

dd

d

15

Cinética de Langmuir

Si se expresa CSi se expresa Caa como como (x,t)(x,t), donde:, donde: xx : es la distancia a la superficie : es la distancia a la superficie tt : es el tiempo de exposición de la solución : es el tiempo de exposición de la solución

a la a la superficie, superficie,

las dos variaciones vistas se resumen en una :las dos variaciones vistas se resumen en una :

.k)1).(t,0(.kdt

d da

θ

Aquí el primer término representa la contribución al Aquí el primer término representa la contribución al

recubrimiento de la adsorción y el segundo de la desorciónrecubrimiento de la adsorción y el segundo de la desorción

16

Fenómenos coexistentes en la interacción de solución y superficie

La adsorción de moléculas a la superficie se realiza enLa adsorción de moléculas a la superficie se realiza en aa = ( = (.. k.. kaa ) )-1-1

La desorción, tiene un tiempo característicoLa desorción, tiene un tiempo característico dd = k = kdd -1-1

La difusión generada por el gradiente de La difusión generada por el gradiente de ., ., se realiza se realiza con el tiempo característicocon el tiempo característico

D D = L= L22/D/D

Donde L es la dimensión característica de la molécula y D es su coeficiente de Donde L es la dimensión característica de la molécula y D es su coeficiente de difusión.difusión.

Según los tiempos característicos de cada fenómeno Según los tiempos característicos de cada fenómeno el proceso resultante tiene los siguientes casos límite:el proceso resultante tiene los siguientes casos límite:

17

• Límite de difusión rápida D << a

La deposición del Ac sobre la oblea, genera un gradiente en la La deposición del Ac sobre la oblea, genera un gradiente en la concentración, que produce difusión hacia la interface, concentración, que produce difusión hacia la interface, manteniéndose la concentración en la superficie manteniéndose la concentración en la superficie (0,t)(0,t) en el valor en el valor promedio promedio resultando: resultando:

)tk.(k

exp 1 (t)da

eq

θθ

donde:

k.k

.k

da

aeq

18

Velocidad de adsorción controlada por la difusiónVelocidad de adsorción controlada por la difusión

En este caso, la adsorción domina frente a la difusión, siendo En este caso, la adsorción domina frente a la difusión, siendo prácticamente inmediata la deposición total del Ac, y resultando prácticamente inmediata la deposición total del Ac, y resultando el recubrimiento, dependiente del coeficiente de difusión de la el recubrimiento, dependiente del coeficiente de difusión de la macromolécula D:macromolécula D:

• Límite D >> a

(t) (D t)½

Para proteínas en solución, el tiempo de difusión Para proteínas en solución, el tiempo de difusión característico, varía en forma típica entre 0,1 y 100 característico, varía en forma típica entre 0,1 y 100 s.s.

19

Selectividad

Sensibilidad

Poder de reconocimientode los sistemas biológicos

Diseño instrumental muy simple

Biosensores

20

Elementos de un biosensor

Elemento de reconocimiento molecular del analito

Elemento Generador de la señal

Transductor

Elemento clave

Integración del biosistema con el transductor

Componente Biológica

21

Clasificación considerando la Componente Biológica

Sensores basados en enzimasSensores basados en enzimas InmunosensoresInmunosensores Sensores de ADNSensores de ADN Sensores basados en receptoresSensores basados en receptores Biosensores de células aisladasBiosensores de células aisladas De tejidos animales o plantasDe tejidos animales o plantas

22

Clasificación considerando el Transductor

Biosensores Potenciométricos (electrodos Biosensores Potenciométricos (electrodos selectivos de iones o gases, FETs)selectivos de iones o gases, FETs)

Biosensores AmperométricosBiosensores Amperométricos Biosensores ConductométricosBiosensores Conductométricos Biosensores ÓpticosBiosensores Ópticos Biosensores Potenciométricos comandables Biosensores Potenciométricos comandables

por luzpor luz Biosensores TérmicosBiosensores Térmicos Biosensores PiezoeléctricosBiosensores Piezoeléctricos

23

Los Biosensores Ópticos se basan en la medición de

Absorción de la luzAbsorción de la luz Emisión de la luzEmisión de la luz Light scatteringLight scattering (dispersión de (dispersión de

la luz) la luz) Fluorescencia de la luzFluorescencia de la luz ReflectanciaReflectancia

24

Inmunosensores

Son biosensores que usan Ac como detector. El Son biosensores que usan Ac como detector. El parámetro que se mide puede ser: electroquímico, parámetro que se mide puede ser: electroquímico, óptico, cambios térmicos, de masa, etc. óptico, cambios térmicos, de masa, etc.

La interacción del analito con la componente biológica La interacción del analito con la componente biológica del biosensor es registrada por el detector integrado. del biosensor es registrada por el detector integrado.

Se basan en reacciones inmunoquímicas, por ejemplo la Se basan en reacciones inmunoquímicas, por ejemplo la ligadura del Ag a un Ac específico. ligadura del Ag a un Ac específico.

La formación de los complejos Ac-Ag debe detectarse La formación de los complejos Ac-Ag debe detectarse bajo condiciones en que se hayan minimizado las bajo condiciones en que se hayan minimizado las interacciones no específicas. interacciones no específicas.

25

Principios y Técnicas Ópticas utilizadas en Inmunosensores

26

Reflexión Total Interna - RTI

Al incidir una OEM, sobre un material rodeado por otro de menor índice de Al incidir una OEM, sobre un material rodeado por otro de menor índice de refracción, a partir de un cierto ángulo de incidencia, llamado ángulo crítico, la refracción, a partir de un cierto ángulo de incidencia, llamado ángulo crítico, la luz es totalmente reflejada dentro de ese material, y es "guiada" a través de este luz es totalmente reflejada dentro de ese material, y es "guiada" a través de este medio, sin trasmitirse luz al medio de menor índice de refracción ( fibras ópticas)medio, sin trasmitirse luz al medio de menor índice de refracción ( fibras ópticas)

N

nsen c

27

Onda evanescente

Aunque el haz de luz que se propaga a lo largo de una fibra óptica, queda limitado Aunque el haz de luz que se propaga a lo largo de una fibra óptica, queda limitado a la región central de la misma, se genera una a la región central de la misma, se genera una onda evanescenteonda evanescente que penetra una d que penetra una d en el medio de menor índice de refracción, atenuándose exponencialmente. La en el medio de menor índice de refracción, atenuándose exponencialmente. La aadsorción de moléculas que se realiza en este medio dsorción de moléculas que se realiza en este medio cambio local del índice de cambio local del índice de refracción refracción cambio en las condiciones de reflexión cambio en las condiciones de reflexión Estas variaciones son Estas variaciones son usadas como parámetro de medida.usadas como parámetro de medida.

28

Espectroscopía de onda evanescente

El campo electromagnético evanescente tiene una profundidad de penetración que depende de los índices de refracción de los medios y del ángulo de incidencia de la luz. Para luz visible, es del orden de 50 a 500nm.

Debido a esto, un cambio en el medio de índice de refracción menor, influencia las características de la propagación.

29

Resonancia plasmónica de superficie SPR

Al incidir un haz de luz monocromática polarizada, el campo evanescente penetra la lámina de metal excita ondas electromagnéticas superficiales dentro de la región formada por los electrones de conducción del metal (plasmones) las condiciones para SPR son sensibles a las variaciones de n.

30

Elipsometría

Determ inación de la Cinética de Interacción

Determ inación de la Concentración de m oléculasen una solución

Estequeom etría de enlace m olecular(a una interface solido/líquido)

Determ inaciones detalladas y precisas de la cinética de adsorción en tiem po real

(sin el marcado de la proteína)

Aplicaciones

31

Elipsómetro

Utilizado para determinar el cambio del estado de polarización de un haz colimado de luz monocromática polarizada, producido por la reflexión sobre una superficie pulida. Permite registrar las variaciones de la intensidad de luz reflejada por la superficie bajo diferentes ángulos de incidencia, y en diversos estados de polarización.

32

Reflexión de una OEM

Al incidir una OEM monocromática no polarizada Al incidir una OEM monocromática no polarizada sobre una superficie reflectante, la reflectancia varía sobre una superficie reflectante, la reflectancia varía según el ángulo de incidencia, observándose un según el ángulo de incidencia, observándose un mínimo en un ángulo llamado de mínimo en un ángulo llamado de incidencia principalincidencia principal (o de Pseudo Brewster para superficies conductoras o (o de Pseudo Brewster para superficies conductoras o semiconductoras).semiconductoras).

El campo E de cualquier onda incidente, se puede El campo E de cualquier onda incidente, se puede descomponer en dos componentes: una incluida en el descomponer en dos componentes: una incluida en el plano de incidencia, o plano de incidencia, o componente de polarización pcomponente de polarización p y otra perpendicular al mismo o y otra perpendicular al mismo o componente de componente de polarización spolarización s. .

33

Polarización por reflexión bajo ángulo de incidencia principal

OEM monocromática no polarizada, que incide bajo el ángulo de incidencia principal; la componente p se trasmite, la componente s en parte se trasmite y en parte se refleja. El rayo reflejado y el trasmitido resultan

perpendiculares.

34

Onda de polarización p queincide bajo ángulo principal

OEM monocromática incidente polarización p bajo OEM monocromática incidente polarización p bajo el ángulo de incidencia principalel ángulo de incidencia principal superficies dieléctricas superficies dieléctricas R Rmin min = 0= 0

superficies semiconductoras o conductoras superficies semiconductoras o conductoras R Rminmin 0 0

Alteración de las condiciones de la superficie Alteración de las condiciones de la superficie cambio en el índice de refracción de la interface cambio en el índice de refracción de la interface aumento en la intensidad reflejada aumento en la intensidad reflejada se puede se puede emplear para detectar la adsorción de moléculas a la emplear para detectar la adsorción de moléculas a la superficie.superficie.

35

Esquema del inmunosensor óptico por reflectometría láser

Haz láser incidente Haz láser reflejado

Oblea de Silicio

Anticuerpo

Aumento de Intensidad del

haz láser reflejado

36

Montaje Experimental

Plataforma del elipsómetro

Láser 633nmTubo Foto

multiplicador

Conjuntocelda -membrana - oblea

celda

membrana Oblea de Si

PC

37

Reflectancia de onda polarizada p, en incidencia bajo ángulo principal, para diferentes superficies

66 68 70 72 74 76 78 800,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0 Interfase aire-silicio

Ajuste polinómico

B = (73.2 ± 0.2)º

Reflectancia

ángulo de incidencia [º]

Interface aire-vidrion = 1,5

Semiconductor: Mínimo no nulo

Dieléctrico: Mínimo nulo

633 nm

38

Detección de biomoléculas por reflectometría

Se basa en la medición de los cambios de reflectancia, Se basa en la medición de los cambios de reflectancia, desde una superficie puesta en contacto con dicha desde una superficie puesta en contacto con dicha solución, debidos a la adsorción sobre la superficie, de solución, debidos a la adsorción sobre la superficie, de biomoléculas en solución. biomoléculas en solución.

Requisitos de la superficie:Requisitos de la superficie: plana y homogéneaplana y homogénea índice de refracción muy diferente del de las índice de refracción muy diferente del de las

biomoléculas biomoléculas (para detectar fácilmente los cambios relativos de las (para detectar fácilmente los cambios relativos de las intensidades de luz reflejada provocados por la adsorción de dichas intensidades de luz reflejada provocados por la adsorción de dichas

biomoléculas).biomoléculas).

39

Mediciones de Intensidad Reflejada

Intensidad láser reflejada en función del tiempo y curva Intensidad láser reflejada en función del tiempo y curva correspondiente al ajuste de datoscorrespondiente al ajuste de datos

0 20 40 60 80 100 120200

250

300

Inte

nsid

ad r

efle

jada

[u.

a.]

tiempo [s]

f(C) = (0.0125 ± 0.0007)1/s 80g de anti-AB Chi^2 = 0.63692R^2 = 0.98878 P1 261.25412 ±0.46234P2 37.57452 ±0.4567P3 10.07352 ±0.20403

gráfica corresponde al agregado de 80 gráfica corresponde al agregado de 80 g de anti-AB monoclonal a la celdag de anti-AB monoclonal a la celda

40

Cinética de adsorción de anticuerpos

t.kCk

da

maxa dae1 kCk

ICkAtI

Realizando los reemplazos

da

maxa

kCk

ICk

.kCk

1

da P1 = A P2 = y P3 =

(1)

3P

t

21 e1.PPtI

(1) se expresa

(2)

41

Casos límite

t3P

2P1P)

3P

t1(12P1P)t(I

. Si t 0, (2) resulta

. Si t , (2) tiende a Imax, resultando

C . ka 2P1P3P

2P)C(f

42

Resultados

Obtenidos

43

66 68 70 72 74 76 78

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

ángulo de incidencia [º]

Inte

nsid

ad R

efle

jada

[u.

a.]

Interfase aire-silicio Ajuste polinómico

B = (73.2 ± 0.4)º

Ángulo de Incidencia Principal para Interface Aire-Silicio

44

Ángulo de Incidencia Principal para Interface Si-solución fisiológica

60 62 64 66 68600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Inte

nsid

ad r

efle

jada

[un

id. a

rb.]

ángulo de incidencia [º]

Interfase Si-solución fisiológica Ajuste polinómico

B= (64.2 + 0.4)º

45

Curva de calibración

Valores de f (C) para cada cantidad de anti-AB agregadaValores de f (C) para cada cantidad de anti-AB agregada

-50 0 50 100 150 200 250 300 350

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035f(

c) [

1/S

] Y = A + B.x

A = 0.00735 ± 7.94999E-4 B = 7.15264E-5 ± 5.27211E-6 R = 0.98409 SD = 0.00138 N = 8 P <0.0001

g de AcMo adsorbidos al sustrato

Constante de adsorción

ka = ( 7.2 ± 0.5). 10-5 1/g.s

46

Determinación de una concentración incógnita

Se determinan los parámetros P1, P2 y P3 y f(C) para una Se determinan los parámetros P1, P2 y P3 y f(C) para una muestra incógnita, resultandomuestra incógnita, resultando

f(C) = (0.0198 ± 0.0007) 1/s. f(C) = (0.0198 ± 0.0007) 1/s.

Por interpolación sobre la curva de calibración se calcula Por interpolación sobre la curva de calibración se calcula la cantidad de AcMo adsorbido a la oblea:la cantidad de AcMo adsorbido a la oblea:

C ± C ± C = (173 ± 9) C = (173 ± 9) gg

Por método Colorimétrico se constata:Por método Colorimétrico se constata:

*que la muestra usada contenía (180 ± 10) *que la muestra usada contenía (180 ± 10) g de anti-ABg de anti-AB

en la celda, valor que cae dentro del entorno determinado.en la celda, valor que cae dentro del entorno determinado.

* la ausencia de AcMo en el sobrenadante, lo que indica * la ausencia de AcMo en el sobrenadante, lo que indica

que el total de proteína había sido adsorbido a la obleaque el total de proteína había sido adsorbido a la oblea ..

47

Aplicación a la determinación de una concentración incógnita

f(C) = (0.0198 ± 0.0007) 1/sC ± C = (173 ± 9) g

-50 0 50 100 150 200 250 300 350

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035f(

c) [

1/S

]

g de AcMo adsorbidos al sustrato

48

Obtención de la constante de desorción

Teniendo en cuenta que da 3

kCk

1P

Resulta )C(fP

1k

3d

kd = ( 0.09 ± 0.03) 1/s

Y en base a los valores promedio de f(C) y de P3 medidos se calcula la constante de desorción de los AcMo empleados:

49

Discusión y conclusiones Los valores de f(C) y de P3 son independientes de la intensidad Los valores de f(C) y de P3 son independientes de la intensidad

incidente en la interface oblea de Si-solución fisiológica. Por lo incidente en la interface oblea de Si-solución fisiológica. Por lo tanto, este método resulta independiente de las características de tanto, este método resulta independiente de las características de la fuente de iluminación.la fuente de iluminación.

Las gráficas obtenidas de I vs t son muy bien aproximadas Las gráficas obtenidas de I vs t son muy bien aproximadas (R>0,94) con la función de la correspondiente a la cinética de (R>0,94) con la función de la correspondiente a la cinética de adsorción de acuerdo con el modelo de Langmuir.adsorción de acuerdo con el modelo de Langmuir.

El método permite obtener la concentración de anticuerpo en El método permite obtener la concentración de anticuerpo en una muestra incógnitauna muestra incógnita

Se pueden obtener las velocidades de adsorción y desorción del Se pueden obtener las velocidades de adsorción y desorción del Ac a la oblea de SiAc a la oblea de Si

No es necesario marcado de la proteínaNo es necesario marcado de la proteína Se puede usar con mínima cantidad de proteínaSe puede usar con mínima cantidad de proteína