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UNIVERSIDAD DE JAÉN Facultad de Ciencias Experimentales

Trabajo Fin de Grado

Alumno: Manuel Arroyo Galán

Julio, 2016

Los exosomas urinarios como fuente de

biomarcadores de enfermedad renal

INDICE

1. RESUMEN……………………………………………………………………………1

2. INTRODUCCION………………………...…………………………………………..2

2.1Biosíntesis…………………………………………..…………………….3

2.2 Composición de los exosomas…………………………...……………6

2.3 Funciones biológicas de los exosomas...........……………………….7

3. OBJETIVOS………………………………………………………………………...10

4. AISLAMIENTO DE EXOSOMAS…………………........................................…11

4.1 Aspectos generales……………………………………………………………11

4.2 Métodos de aislamiento de exosomas………………………………………11

4.2.1 Pre-aislamiento………………………………………………………………12

4.2.2 Ultra centrifugación……………...…………………………………………..12

4.2.3 Filtración………………………………………………………………………14

4.2.4 Aislamiento basado en la inmunoafinidad…………………………….....15

4.2.5 Agentes de agregación…………………………..…………………………16

4.2.6 Cromatografía por exclusión de tamaño………………….………………16

4.2.7 Métodos basados en microfluidos…………………………………...…….17

4.2.8 Diálisis hidrostática……………………………..……………………………17

5. EXOSOMAS URINARIOS COMO BIOMARCADORES DE DISFUNCION

RENAL………………………………………………………………………………19

5.1 Enfermedades renales………………………………………………………..19

5.2 Daño renal agudo……………………………………………………………..21

5.3 Trastornos glomerulares………………………………….…………………..21

5.3.1 Nefropatía diabética…………………………………………..…….22

5.3.2 Glomerulonefritis………………………….……………….………..22

5.3.3 Nefropatía en la membrana basal (TBMN)……………….……….23

5.4 Fibrosis renal………………………………………….…………….……….…23

5.5 Trastorno poliquístico renal…………………………………………………..24

5.6 Trasplante renal………………………………….....………………………….24

5.7 Implicaciones en el cáncer………………………………………………..….25

5.7.1 Carcinoma renal celular…………………………………………….25

5.7.2 Cáncer de vejiga……………………………………………………..26

5.7.3 Cáncer de próstata……………………….…………………………26

6. CONCLUSION…………………………………………………………………….27

7. BIBLIOGRAFIA……………………………………………………………………27

1

1. RESUMEN

Gracias a los avances en ciencia, se siguen descubriendo más secretos acerca del

funcionamiento del cuerpo humano. Hace pocos años se descubrieron los

exosomas, un tipo de microvesícula, que se libera por las células al medio

extracelular. En un principio se creía que solo tenían función de eliminación de

sustancias, pero con el tiempo se ha descubierto que participan en muchos más

procesos fisiológicos (Comunicación intercelular, fuente de biomarcadores en

patologías, etc.). Este trabajo proporciona una visión particular y especifica de la

metodología y aplicaciones que poseen los exosomas urinarios como fuente de

biomarcadores en disfunciones renales y demuestra que el uso y análisis en clínica

de estos compuestos se está convirtiendo en una metodología muy recomendada

para el diagnostico de diferentes patologías renales.

Palabras Clave: fracción exosomal, aislamiento, biomarcador, exosomas urinarios,

aplicación.

ABSTRACT

Thanks to advances in science are still being discovered more secrets about the

human body. Few years ago, exosomes were found, a kind of microvesicle, wich is

released by cells to extracellular medium. At first, it was believed that only had

substance removal function, but over time it has been discovered that they involved

in many physiological processes (intercellular communication, source of biomarkers

in diseases,etc).This work provide a particular and specifies view the methodology

and applications that urinary exosomes have as a source of biomarkers in renal

dysfunction and shows that use and analysis in clinical of these vesicles is becoming

a highly recommended methodology for the kidney diseases diagnostic.

Key words: Exosomal fraction, isolation, biomarker, urinary exosomes, application.

2

2. INTRODUCCION

Durante los últimos años, los exosomas han sido objeto de gran interés científico. Se

trata de pequeñas microvesiculas liberadas por diferentes tipos de células (Keller S.

et al., 2006), las cuales pueden ser localizadas en varios fluidos corporales como

plasma, orina y saliva (Lasser C. et al., 2011; Witwer KW. Et al., 2013).

Los exosomas son un tipo de vesículas extracelulares (EVs), este término incluye

diferentes tipos de vesículas, fundamentalmente los exosomas (EXs), ectosomas

(también conocidos como micro-vesículas) y cuerpos apoptoticos. Esta

diferenciación se efectúa en relación a varios aspectos, por ejemplo con respecto a

su tamaño, los exosomas poseen un diámetro de entre 30-150 nm, las micro-

vesículas (Ectosomas) son más grandes, su diámetro comprende entre 100-1000

nm y los cuerpos apoptoticos tienen un tamaño y forma heterogéneo. De la misma

manera, también se encuentran diferencias en su origen, los exosomas son

derivados de la invaginación de la membrana plasmática de los grandes cuerpos

multivesiculares, los ectosomas se producen por una brotación directa de la

membrana y los cuerpos apoptoticos proceden de células que mueren y que arrojan

vesículas membranosas (Gámez-Valero A. et al., 2015).

3

Figura 1: Dibujo que distingue las diferentes vesiculas extracelulares. Burger D.,

Schock S. Thompson CS., Montezano A., Hakim A., (2013).

Microparticles:biomarkers and beyond. Clinical Science. 124: 423-441.

Los exosomas como se ha comentado, tienen un diámetro de 30-150 nm y proceden

de la brotación hacia el interior por parte de las membranas endosomales, lo que

causa la acumulación progresiva de vesículas intraluminales que posteriormente

forman los grandes cuerpos multivesiculares (MVBs) (Mathivanan S. et al., 2010;

Kowal J. et al., 2014).

Originalmente se describieron como un mecanismo de eliminación, (Keller S. et al.,

2006) pero a partir de estudios recientes se ha descubierto que tienen gran

importancia en procesos de comunicación intercelular, patogénesis y como posible

fuente de biomarcadores para enfermedades renales [Mittelbrunn M. et al., 2011;

Borges FT. Et al 2013).

La orina es el fluido corporal ideal para diagnosticar y clasificar varias enfermedades

renales ya que estas vesículas secretadas en todos y cada uno de los segmentos de

la nefrona contienen liquido intracelular y proteínas que se pueden encontrar

alteradas si existe alguna enfermedad renal (Hua Zhou et al., 2006). Este trabajo

describe en particular este tipo de vesículas extracelulares (Urinarias) con un

enfoque especial sobre la importancia que pueden adquirir como fuente de

biomarcadores de distintas enfermedades renales.

2.1 Biosíntesis

Los exosomas son vesículas de membrana que se liberan al espacio extracelular

tras la fusión de la membrana plasmática con los cuerpos multivesiculares (MVBs)

(Schorey J. et al., 2008). Existen diferentes mecanismos por los que las células

liberan proteínas en el espacio extracelular. El proceso más común es la liberación

de grandes biomoleculas a través de la membrana plasmática por un proceso

denominado exocitosis (Keller S. et al., 2006). La exocitosis se define como el

proceso mediante el cual se dirigen las vesículas del interior ceular hacia el espacio

extracelular a través de la membrana plasmática. En el proceso de formación y

4

liberación de exosomas, además de la exocitosis clásica, existe una vía endocitica

que tiene un papel fundamental, esta función es la biosíntesis de los cuerpos

multivesiculares (MVBs) (Dimov I. et al 2009).

Así pues, el origen de los exosomas se ha asociado con la vía endocitica (Keller S.

et al., 2006) que es un sistema dinámico cuya función es ayudar a internalizar,

transportar, clasificar y degradar macromoléculas (Fader C. et al., 2009). De esta

forma, en el proceso de degradación de macromoléculas, los componentes de esta

via endocitica son endosomas tempranos, endosomas tardíos (Los llamados

cuerpos multivesiculares o MVBs) y lisosomas (Keller S. et al., 2006). En lo que

respecta a la ruta endocitica, los endosomas tempranos, que se encuentran cerca de

la membrana celular, actúan como el primer sitio de encuentro para las vesículas

primarias endocitadas. Estas vesículas se pueden reciclar devolviéndose a la

membrana plasmática o pueden evolucionar a cuerpos multivesiculares (MVBs) (Hill

A. et al., 2009). Los endosomas tempranos sufren una acidificación y se generan los

endosomas tardíos, que son clave en la formación de cuerpos multivesiculares

(MVBs), esto se produce porque la membrana endosomica se invagina dentro del

propio endosoma tardío formando mini-vesículas internas. Estas pueden seguir dos

vías: una directamente al lisosoma, donde se degradan, y otra donde se da la

liberación al espacio extracelular (Secreción de exosomas). Los factores de

regulación que determinan cual de las dos vías se producirá no está aún muy clara.

(Keller S. et al., 2006; Schorey J. et al., 2008; Buschow S. et al., 2005).

5

Figura 2: Grafica que escenifica la vía secreción proteica por exosomas. Keller S.,

Sanderson M., Stoeck A., and Altevogt P., (2006). Exosomes: from biogenesis and

secretion to biological function. Immunology letters. 107: 102-108.

Con respecto a la localización de los exosomas, los primeros estudios muestran la

liberación de exosomas derivados de células inmaduras del linaje linfoide, mieloide y

eritroide (reticulocitos), estos últimos liberan el receptor para la transferrina a través

de estas vesículas de membrana (Clayton A. et al., 2000; Clayton A. et al., 2005;

Mignot G. et al., 2006; Lamparski H. et al., 2002; Rapaso G. et al., 1996). Por tanto,

inicialmente se propuso que la secreción de exosomas era un mecanismo a través

del cual la célula se deshacía de proteínas. Posteriormente, se han identificado

estas vesículas en otros tipos celulares como células epiteliales (Lin X. et al., 2005),

neuronas (Cheruvanky A. et al., 2006), nefronas (Cheruvanky A. et al., 2006),

mastocitos (Shokos D. et al., 2003), plaquetas y células tumorales (Andre F. et al.,

2002), células epiteliales intestinales (Buning J. et al., 2008), células microgliales

primarias (Hill A. et al., 2009) y células dendríticas (Stoorvegel W. et al., 2002).

6

2.2 Composición de los exosomas

El análisis proteomico de exosomas se realizo a partir de líquidos corporales como

sangre y orina. Los análisis de estos fluidos muestran que los exosomas de

mamíferos comparten una serie de características comunes, tales como la estructura

(Bicapa lipidica), la densidad, la composición general de proteínas y el tamaño

(Keller S. et al., 2006).

Los exosomas básicamente son estructuras formadas por una bicapa lipidica y el

medio intracelular caracterizado por una composición proteica, la cual se puede

analizar tanto en la superficie (Membrana plasmática) como en el lumen. Existe una

gran cantidad de proteínas asociadas a estas estructuras. Asi pues, se han

identificado proteínas membranales tales como sintaxina 7, dinamina 2, Rab

1,2,4,5,6,7,10,11b,13,14,15, Snap 23, anexina y clatrina (Mignot G. et al., 2006).

También se encuentran chaperonas como Hsp 70, Hsp 90 y Hsp 72 (Keller S. et al.,

2006; Mignot G. et al., 2006). Asimismo hay moléculas transmembranales como

CD13, CD93, Lamp-1 y Lamp-2, además de proteínas como el receptor de

transferrina, moléculas de señalización como fosfolipasa C, proteínas G y Rho

(Segura E. et al., 2005), proteínas que componen el citoesqueleto entre las que se

encuentran actina, tubulina B5 y miosina (Keller S. et al., 2006). De igual forma se

identificaron moléculas proteicas relacionadas con la formación de los cuerpos

multivesiculares (MVB) como TSG 101(Mignot G. et al., 2006), Beclin-1(Fader C. et

al., 2009), Alix (Morita E. et al., 2007) y GAG (Segura E. et al., 2005). Otro tipo de

proteínas son las que poseen función de adhesión como ICAM-1 (Segura E. et al.,

2008). Cabe destacar, la familia de proteínas más comúnmente asociadas a los

exosomas, las tetraspaninas, incluyendo CD9, CD63, CD81 y CD82 (Escola JM. Et

al., 1996; Chaput N. et al., 2005).

Es de importancia resaltar que la composición proteica de estas vesículas de

membrana simboliza el origen celular, por ejemplo, el análisis de exosomas en orina,

muestra un enlace o conexión entre las mismas vesículas, las cuales contienen

acuoporina-2, que tiene su origen en el tracto urogenital (Pisitkun T. et al., 2004).

Esto también ocurre con el CMH (Complejo Mayor de Histocompatibilidad), es así

como tenemos proteínas especificas de células inmunológicas de la Clase I, II y

CD86 (Mignot G. et al., 2006) cuyas funciones se ven relacionadas con la activación

7

del sistema inmunologico. Cabe destacar que la función inmune de estos vesiculas

depende en gran parte del estado funcional de la célula que derivan. Por esta razón,

los exosomas de células dendríticas maduras presentan una mayor eficacia en la

inducción de la activación de linfocitos T, debido a la presencia superficial del

exosoma de una molécula de adhesión concreta “ICAM-1”, mientras que exosomas

que derivan de células dendríticas inmaduras se caracterizan inactivación de los

Linfocitos T (Segura E. et al., 2008). Todas estas proteínas pueden ser utilizadas

como marcadores específicos de los exosomas, y su presencia, ausencia, aumento

o disminución nos ayudan a conocer que tipo de patología posee el paciente.

Como conclusión al análisis proteico, es relevante añadir que todas las proteínas de

los exosomas son de origen endosomal, es decir, no existen proteínas propias del

núcleo, de las mitocondrias o del retículo endoplasmatico. Todas las proteínas de los

exosomas son típicas del citosol o de la membrana plasmática (Mears R. et al.,

2004).

2.3 Funciones biológicas de los exosomas

Los exosomas se describieron por primera vez en los años 80, y hasta hace

relativamente poco (Año 2000), la comunidad científica no había prestado mucha

atención a estos compuestos, ya que solamente se creía que su papel era el de

desechar componentes celulares no deseados (Mecanismo de eliminación) (Pan

BT. Et al., 1983; Trams EG. Et al., 1981). Debido a este hecho, a día de hoy se

están descubriendo nuevos papeles y funciones fisiológicas de los exosomas en el

organismo. Algunos de los roles importantes son la progresión del cáncer, la

comunicación intercelular, la secreción proteica (Vía no-clásica), la biología del

patógeno y su función como fuentes de biomarcadores de patologías (Doreen YPF.

Et al., 2013).

En un principio, se creía que los procesos de comunicación intercelular se basaban

en la secreción de señales como neurotransmisores, hormonas que son liberadas

por las células y que actúan mediante mecanismos autocrinos y paracrinos además

del mecanismo que corresponde al contacto célula a célula (Adhesión). Actualmente

8

se ha descubierto que los exosomas pueden participar en unos nuevos mecanismos

de comunicación intercelular. Estas vesículas pueden ser transportadas entre

células con una gran especificidad, así se adhieren a las células diana a través de

receptores específicos (En este proceso no es necesaria la fusión de membranas

plasmáticas de las células implicadas, es un proceso que tiene una alta

especificidad). Otro mecanismo a describir es en el cual se produce una fusión entre

la membrana plasmática de la célula diana y los exosomas, esta fusión se produce

mediante endocitosis (Skog J. et al., 2008; Fitzner D. et al., 2011). Otro factor

importante en la comunicación es que los exosomas pueden transferir proteínas,

ARNm y miARNs. Este hecho es importante ya que puede alterar la información

genética de la célula diana, con la consecuente modificación del proteoma y de las

funciones de esa célula concreta (Valadi H. et al., 2007; Mittelbrunn M. et al., 2009;

Sheldon H. et al., 2009). Otro sentido que se le ha proporcionado al transporte de

secuencias genéticas es el de la protección, los exosomas así protegen a esta

secuencias de la degradación que se produciría si estuvieran libres en el medio

extracelular, de esta forma, esta vía de comunicación intercelular es más fiable y

permite que se entregue una mayor concentración de las moléculas transportadas

(Proteínas, ARN, miARNs) (Doreen YPF. Et al., 2013).

Uno de los tipos celulares que produce exosomas son las células del sistema

inmunitario y particularmente estos exosomas poseen una amplia gama de

funciones en el sistema inmune (Chaput N. et al., 2010). Por ejemplo, la función mas

destacada es la de ser moléculas presentadoras de antígenos (Raposo G. et al.,

1996). Los exosomas son capaces de presentar antígenos derivados de varias

enfermedades (Walker JD. Et al., 2009), mostrar inmunosupresores o incluso

presentar sustancias de efecto citotoxico (Alonso R. et al., 2011). Otro efecto

funcional producido por los exosomas en las células inmunes es el ejercido por la

transferencia de miARNs, este se identifico en el mecanismo de respuesta a la

estimulación de antígenos en Linfocitos T (Mittelbrunn M. et al 2011).

El proceso de liberación de exosomas, implica una maduración de reticulocitos, así

pues en el momento de la secrecion de exosomas se pueden arrojar proteínas de

membrana sin utilidad al interior celular, proceso que conlleva la remodelación de la

membrana plasmática (Johnstone RM. Et al., 1991), de esta forma se consigue una

alternativa a la degradación de proteínas no deseadas realizada por el lisosoma.

9

Este mecanismo de secreción se explica porque las proteínas transmembrana

poseen también una forma soluble, de esta manera pueden separarse de la

membrana plasmática e introducirse en el interior de la célula.

Una vez dentro, comienza a formar parte de los endosomas (Como ya se ha visto en

la formación de los exosomas) hasta pertenecer a los cuerpos multivesiculares

(MVBs). Este hecho ha sido demostrado con un gran conjunto de moléculas que

incluyen moléculas de adhesión, factores de crecimiento, receptores (Dello Sbarba

P. et al., 2002).

Los organismos patógenos utilizan a los exosomas como medio de propagación

intercelular y como medio de comunicación. Esto se debe a una capacidad que

poseen los exosomas y es la de transportar proteínas virales entre células y asi

promover la enfermedad, se considera un mecanismo de escape frente al sistema

inmune del organismo (Lenassi M. et al., 2010). Algunas proteínas virales que se

transportan mediante exosomas son los priones, el miARNs (Pegtel DM. Et al.,

2010) y varias proteínas implicadas en la difusión del VIH-1 (Izquierdo-Useros N. et

al ., 2009; Fevrier B. et al., 2004).

Una vez las células tumorales han desarrollado el tumor, comienzan a interactuar

con el medio para estimular procesos de crecimiento, invasión y supervivencia

(Doreen YPF. Et al., 2013). Dentro de estos procesos entra el papel de los

exosomas tumorales que pueden actuar como mediadores importantes de estas

situaciones entre las que se incluyen metástasis (Jung t. et al., 2009; Hood JL. Et al.,

2011), inmunomodulacion (Iero M. et al., 2007), proliferación de células tumorales

(Keller S. et al., 2009 y la angiogenesis (Skog J. et al., 2008). Por ejemplo, estudios

realizados en cáncer renal, han descubierto que exosomas derivados de células

madre del cáncer son capaces de activar angiogenesis y promover la metástasis.

Otra función de estos exosomas tumorales es la de interrumpir las respuestas

inmunes especificas además de diferenciar células a células inmunosupresoras

(Grange C. et al., 2011).

Una de las funciones más importantes que se ha descubierto que tienen los

exosomas es la de ser fuente de biomarcadores de enfermedades renales, es decir,

su presencia en muestras biológicas puede ser indicadora de lesión en alguna parte

10

del sistema renal. Para ello la mejor muestra a analizar es la orina, debido

principalmente a su facilidad en la recogida, ya que es un proceso no invasivo.

Las células epiteliales renales liberan los exosomas urinarios que contienen factores

de transcripción, ARNm, miARNs y podocitos (Celulas propias de los tubulos renales

y células que recubren el sistema de drenaje urinario) (Dimov I. et al., 2009).

El análisis de la fracción exosomica de la orina proporciona información valiosa con

respecto a las enfermedades renales. Por ejemplo, enfermedades genéticas como la

“Enfermedad renal poliquistica autosomica dominante” (PQRAD), los tipos 1 y 2 son

las enfermedades renales más comunes que provocan insufuciencia renal. Las

proteínas Policisteina 1 y Policisteina 2 son el producto de dos mutaciones y se

encuentran en baja concentración en el tejido renal pero son fácilmente detectables

en los exosomas urinarios. Su análisis podría identificar si el paciente padece o no

enfermedad renal (Gonzalez PA. Et al., 2009; Hogan MC. Et al., 2009).

Gracias a análisis de inmunotransferencia también se han detectado mutaciones en

moléculas como el co-transportador Na-Cl sensible a la Tiazida en el tubulo

contorneado distal, que podría diagnosticar el sindroma de Gitelman (Dimov I. et al.,

2009). De la misma manera, por inmunotrasferencia se puede diagnosticar el

sindroma de Bartter Tipo 1 por la ausencia del co-transportador de Potasio-Sodio-

Calcio.

3. OBJETIVO

El objetivo general de esta revisión bibliográfica es hacer una actualización de lo

publicado hasta la fecha relativo a los exosomas y a sus aplicaciones en medicina y

clínica. Primero, hay que poner de manifiesto que los estudios sobre la función de

los exosomas como biomarcadores de enfermedad renal son muy recientes, por

tanto hay aun mucho que investigar ya que pueden servir eficazmente como ayuda

en el diagnostico clínico de diversas patologías renales. Se ha planteado esta

revisión con estructura de trabajo de investigación en el que además de plantear las

aplicaciones de los exosomas, también se han explicado los aspectos metodológicos

relativos a su aislamiento.

11

Así, este objetivo general puede dividirse en los siguientes objetivos específicos:

1) Describir las características, composición y funciones biológicas de los

exosomas presentes en diferentes fluidos corporales.

2) Analizar y comparar los distintos protocolos que se han utilizado para el

aislamiento y caracterización de los exosomas.

3) Investigar las aplicaciones de los exosomas como marcadores diagnósticos

de enfermedad y, más concretamente, de los exosomas presentes en la orina

y de las alteraciones en su composición como marcadores de enfermedad

renal.

4. AISLAMIENTO DE EXOSOMAS

4.1 Aspectos generales

Los métodos y protocolos de aislamiento de exosomas varían dependiendo del fluido

corporal de origen (Doreen YPF. Et al., 2013). Como se ha resaltado anteriormente

el mejor liquido corporal para el estudio de los exosomas es la orina. Esto se debe

principalmente a la consideración de dos factores importantes antes de proceder al

aislamiento y análisis de los exosomas, que son, la obtención y el tratamiento de la

muestra. Con respecto a este hecho, la obtención de la muestra, es más fácil de

realizar y es un método menos invasivo en orina que en comparación con sangre

(Hua Zhou et al., 2006).

En relación al tratamiento de la muestra antes de proceder con los métodos de

aislamiento, se recomienda el uso de inhibidores de proteasa dentro de los

contenedores de recogida para conservar la muestra y así preservar perfectamente

la composición proteica de la muestra de orina. Las muestras pueden ser

procesadas inmediatamente después de su recogida o se pueden almacenar a -

80ºC (Gámez-Valero A. et al., 2015). En resumen, si se ha realizado el

procedimiento normal de gestión de muestras de orina, la contaminación no debería

existir (Witwer KW. Et al., 2013; Jacquillet G. et al., 2013).

12

4.2 Métodos de aislamiento de exosomas

Para poder estudiar las funciones y aplicaciones particulares que poseen estas

vesículas extracelulares primero hay que recluirlas para su posterior análisis.

Básicamente lo que hay que hacer es separar la fracción celular, de la fracción

exosomal en la muestra de orina aunque este proceso es complejo debido a su

desconocimiento en la actualidad. En este apartado del estudio, se resumen los

diferentes métodos que se utilizan para aislar los exosomas en muestras de orina.

4.2.1 Pre-aislamiento

Una vez se va a iniciar el proceso de aislamiento de exosomas urinarios hay que

tener en cuenta la presencia de la proteína Tamm-Horsfall (THP) (Uromodulina) la

cual es un componente común de las muestras de orina en condiciones fisiológicas y

patológicas. La explicación de por qué hay que tener en consideración la presencia

de esta proteína es, que posee la capacidad de interferir en el estudio y aislamiento

de exosomas (Gámez-Valero A. et al., 2015).

En solución a esto, se recomienda realizar algunas de las técnicas de pre-

aislamiento para así poder eliminar o al menos poder reducir considerablemente la

presencia de la THP antes de comenzar con métodos propios de aislamiento y

determinación de exosomas (Witwer KW., et al. 2013; Rood IM., et al., 2010).

El tratamiento con mayor éxito escogido para evitar la acción de la proteína THP ha

sido el TDT (Fernández-Llama P., et al., 2010), aunque también existe una

alternativa, y es el uso de “3-[(3-colamidopropil(dimetilamonio]-1 sulfonico propano”

(CHAPS), el cual se trata de un leve detergente que es capaz de disolver el THP. Un

hecho a favor del método CHAPS es que preserva la conformación de la proteína y

sus actividades enzimáticas (Musante L. et al., 2012), sin embargo, una desventaja

de este método es que la duración de la técnica es mayor que en el tratamiento

TDT. (Salih M., et al., 2014).

Una vez utilizados alguno de estos métodos, la muestra de orina ya está preparada

para el aislamiento de los exosomas.

13

4.2.2 Ultracentrifugación

La primera vez que la ultracentrifugacion fue utilizada para realizar el aislamiento de

exosomas fue durante la década de los 80 (Harding C. et al., 1983; Jonhstone. Et al.,

1984) y desde entonces ha sido ampliamente utilizada, aun independientemente del

origen de la muestra.

Este método se basa en una ultracentrifugación diferencial de dos etapas (UC) para

así aislar correctamente los exosomas. La primera centrifugación es a baja velocidad

(10.000-17.000 g) para eliminar los cuerpos apoptoticos, los deshechos celulares y

en definitiva aquellas vesículas de gran tamaño que no nos interesan. La segunda

centrifugación, ahora si a gran velocidad (100.000-200.000 g) es capaz de retener la

fracción exosomal (Gámez-Valero A. 2006).

Figura 4: Esquema ilustrativo de los diferentes pasos a realizar en la

ultracentrifugacion. Zhou et al. Kidney Int. 2006 ; 69(8): 1471–1476.

Cabe destacar que en ciertas situaciones, la ultracentrifugacion se puede

complementar con una etapa de filtración para eliminar con más seguridad las

vesículas y proteínas de gran tamaño. Sin embargo, la inclusión de esta etapa de

filtración no está bien valorada por algunos autores, los cuales defienden que esta

filtración puede llegar a fracturar estas proteínas de gran tamaño y transformarlas en

compuestos más pequeños que pueden incluirse en la fracción exosomal e interferir

en el resultado del método de aislamiento (Witwer KW. Et al., 2013).

14

En condiciones patológicas, como por ejemplo puede ser la alteración de la filtración

glomerular (En el glomérulo se produce una “depuración” de la sangre que llega al

riñón para así eliminar las sustancias de desecho, si esta función está alterada,

cualquier compuesto puede llegar a la orina) existe una fuga masiva de proteínas

hacia la orina, estos compuestos, junto con THP puede aislarse con los exosomas y

aparecer en la fracción exosomal centrifugada. Las principales soluciones para evitar

este problema y obtener así una muestra más purificada es procesar los sedimentos

por gradientes de densidad de sacarosa (Raj DA. Et al., 2012) o gradientes de

densidad de potasio “Bromideoriodix-anol” (Optiprep) que son capaces de eliminar

los contaminantes (Yuana Y. et al., 2014; Van Deun J. et a., 2014).

Los principales problemas de este método se basan en la compleja aplicabilidad a la

práctica clínica que poseen, ya que los equipos necesarios son costosos y no existe

un protocolo universal (Cvjetkovic A. et a., 2014). A pesar de esto, es la técnica más

usada y la más importante actualmente para el aislamiento estas vesículas

extracelulares.

4.2.3 Filtración

El fundamento de esta técnica es hacer pasar la muestra de orina a través de una

nanomembrana, estas nanomembranas en general suelen ser de éter o PVDF. La

muestra sufre una pequeña centrifugación a velocidad muy lenta y así se consigue

evitar la ultracentrifugacion. Este método se analizo como una nueva opción para el

aislamiento de vesículas extracelulares urinarias ya que una de sus principales

ventajas es que se pueden usar volúmenes muy pequeños de muestras. Se detecto

que proteínas típicas de la composición de los exosomas eran retenidas en la

nanomembrana, aunque cabe mencionar que la obtención final requiere una etapa

de lavado adicional (Cheruvanky A. et al., 2007).

15

Figura 3: Esquema del proceso de aislamiento de exosomas mediante Filtracion.

Cheruvanky A., Zhou H., Pisitkun T., Kopp J., Knepper M., Yuen Peter., and Star R.,

(2006). Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane

ultrafiltration concentrator. Journal Physiology Renal. 292: 1657-1661

Se ha descubierto además, que existe una lenta recuperación de los marcadores de

exosomas, ya que se encuentran unidos a estas proteínas por el co-aislamiento que

se produce, por ejemplo, se suele encontrar a la albumina dentro del sedimento

urinario exosomal (Rood IM. et al., 2010). La retención y la adherencia de proteínas

a la nanomembrana son importantes desventajas que actualmente encuentra este

método para poder aislar eficientemente los exosomas de la orina de los pacientes

(Gámez-Valero A. et al., 2015).

Las soluciones para este método es el uso de la ultrafiltración, que se caracteriza

por el uso de una membrana de baja unión a proteínas o una filtración aplicando

vacio. Aplicando estas opciones se pueden purificar los exosomas urinarios a partir

muestras con poco volumen (Merchant ML. Et al., 2010).

4.2.4 Aislamiento basado en la Inmunoafinidad.

Como se ha comentado anteriormente, los exosomas poseen proteínas típicas de su

superficie (Tetraspanina). Empleando esta expresión proteica en la superficie de la

vesícula, se han desarrollado métodos para el aislamiento de exosomas basados en

la afinidad hacia estas proteínas.

Estos métodos se basan en utilizar anticuerpos (Soportes o péptidos magnéticos),

capaces de reconocer y unirse específicamente a estas proteínas superficiales de

16

los exosomas, por esta razón se les conoce como métodos de inmuno-afinidad

(Wang D. et al., 2014; Kalra H. et al., 2013). Es relevante mencionar que este

inmuno-aislamiento requiere también una etapa de centrifugación a baja velocidad

para concentrar las vesículas extracelulares y obtener la fracción exosomal (Salih M.

et al., 2014; Witwer KW. Et al., 2013).

Otra variable de este método es utilizar péptidos sintéticos que posean afinidad

especifica por proteínas de choque térmico (Chaperonas), que se tratan de

marcadores de exosomas (Kim DK. Et al., 2014). El péptido denominado Vn-96

puede ser el elegido, ya que es capaz de retener y capturar los exosomas a partir de

muestras de orina o sangre e incluso en el sobrenadante de cultivos celulares

(Ghosh. A., et al., 2014).

En definitiva, debido a la falta de marcadores específicos de vesículas

extracelulares, los exosomas obtenidos con estas técnicas podrían no estar

estructuralmente completos, es decir, estarían segados, dependiendo del órgano

utilizado o el péptido usado, por esta razón no es el método más fiable para el

aislamiento (Kowal J. et al., 2014).

4.2.5 Agentes de agregación

En los últimos años, se han introducido también como técnicas de aislamiento de

exosomas el uso de reactivos de precipitación comerciales como por ejemplo

“ExoQuick TC”, “Invitrogen”, “Exospin” y “miRCURY”. Estos kits de aislamiento de

exosomas se usan en muestras de orina además de otros líquidos corporales y

realizan también una centrifugación a baja velocidad para que se produzca la

agregación de la fracción exosomal (Gámez-Valero A. et al., 2015).

La ventaja de este método es su rápido rendimiento y su fácil aplicación. Además

posee una gran aplicabilidad en laboratorios de diagnostico (Schageman J. et al.,

2013; Musante L. et al., 2014).

Sin embargo, este método también posee desventajas. El principal inconveniente es

que el agregado de partículas que se obtiene se trata de una mezcla compleja de

exosomas mas proteínas que van a interferir en la determinación especifica de los

exosomas (Álvarez ML. Et al., 2012). Además de este factor, cabe resaltar que estos

métodos también requieren pre-tratamientos específicos de la muestra para eliminar

17

las vesículas y proteínas de gran tamaño (Wang D., et al., 2014; Witwer KW. Et al.,

2013; Salih M. et al., 2014; Van Deun J. et al., 2014).

4.2.6 Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)

La aplicación principal de esta técnica es la de fraccionar muestras biológicas

complejas como pueden ser orina y plasma, para así poder tener un mejor acceso

al aislamiento eficaz de exosomas. Esto es así porque en el proceso de exclusión

por tamaño se eliminan los principales contaminantes, tales como agregados de

proteínas, lipoproteínas y en general compuestos “co-aislados” por

ultracentrifugación (UC) que poseen gran tamaño.

En experimentos anteriores, en los cuales se utilizo la ultracentrifugacion y a

continuación la cromatografía por exclusión de tamaño se demostró que existen

contaminantes que pueden enmascarar la presencia de marcadores de exosomas

importantes, aumentando así la importancia que tiene eliminar la mayor cantidad de

contaminantes para obtener una fracción exosomal fiable ( Rood IM. Et a., 2010).

Cabe destacar que recientemente se han realizado estudios en los cuales se ha

podido aislar exosomas morfológicamente intactos mediante esta técnica tanto en

sangre (Muller L. et al., 2014; Boing AN. Et al., 2014) como en orina (Gamez-Valero

A. et al., 2015).

Por tanto, se puede emplear esta técnica para obtener resultados eficientes y asi

también poder valorar la opción de ser implantada en el entorno clínico.

4.2.7 Métodos basados en microfluidos

Recientemente se han desarrollado métodos basados en microfluidos. Por ejemplo,

ExoChip es una plataforma basada en esta técnica que consiste en una matriz de

“polidimetilsiloxano” cubierta de “Abs” específico contra un marcador exosomal típico

como es la proteína CD63. Básicamente estos kits se han desarrollado para aislar

exosomas mediante inmuno-afinidad. Un factor a favor de este método es que no

requiere una etapa de separación o fracción de la muestra para cuantificar los

exosomas, sino que estos son marcados con un tinte fluoresencente y después se

pueden leer en un lector de placas.

18

En la actualidad existe también una plataforma de microfluidos para el aislamiento

de exosomas basada en el diámetro y en el desplazamiento lateral. Los primeros

estudios han mostrado una separación eficiente entre los exosomas sin alterar la

morfología y la biología de la vesícula extracelular, pero al ser estudios tan recientes,

se debería analizar profundamente con experimentos adicionales. De hecho, no esta

tan claro que se pueda separar exosomas en muestras biológicas complejas en las

que las densidades son altamente variables (Santana SM. Et al., 2014).

4.2.8 Diálisis hidrostática

Esta novedosa técnica se basa en una diálisis hidrostática para aislar los exosomas

sin necesidad de realizar una ultracentrifugación y tiene su principal ventaja en que

es una posible solución para muestras muy diluidas. Una diálisis se define como un

proceso de separación de sustancias que están juntas o mezcladas en una misma

disolución, a través de una membrana que las filtra. Técnicamente este método

consiste en la separación de la fracción exosomal, de la fracción celular de la

muestra que pueda contener los contaminantes. Esta diálisis de membrana tiene

capacidad para separar sustancias de peso molecular 1.000 kDa, para así poder

eliminar todos los contaminantes posibles en muestras a analizar (Musante L. et al.,

2014).

En conclusión, aunque se ha comprobado que recientemente se han desarrollado

varios métodos de aislamiento de exosomas, todavía se está buscando el más

adecuado. Esto es debido a la gran variabilidad de resultados que se han obtenido al

comparar diferentes métodos (Álvarez ML. Et al., 2012), aun así, el método más

recomendado actualmente para obtener una fracción exosomal fiable es la ultra

centrifugación.

19

Tabla 1: Diferentes métodos de aislamiento y purificación, separación, identificación

y cuantificación de los métodos utilizados con exosomas urinarios relacionados con

los estudios de biomarcadores.

5. EXOSOMAS URINARIOS COMO BIOMARCADORES DE DISFUNCION

RENAL

5.1 Enfermedades renales

El riñón es el principal órgano implicado en el mantenimiento de la homeostasis del

medio interno, es decir, de la regulación del volumen y la composición química de

este. Mediante la formación de orina se eliminan del organismo gran cantidad de

20

residuos metabólicos procedentes del metabolismo endógeno (urea, acido úrico,

creatinina) y de productos administrados (Fármacos). La principal alteración en la

función del riñón es la enfermedad renal crónica (ERC). Este defecto es un problema

de salud pública que causa una importante mortalidad, de hecho, muchos estudios

concluyen sugiriendo que las enfermedades renales crónicas (ERC) predicen el

riesgo de mortalidad en la población general (Matsushita K. et al., 2010).

Existen diferentes terapias para los pacientes con enfermedad crónica renal y las

principales incluyen la hemodiálisis o diálisis peritoneal y el trasplante renal, siendo

este la mayor elección por parte de los pacientes (Wolfe RA. Et al., 1999) debido a

los notables avances que se han realizado en los últimos años, aunque hay que

poner de manifiesto que aun así, el rechazo inmunológico al injerto y los efectos de

los fármacos tienen importantes consecuencias negativas a largo plazo para el

paciente.

Nuestro trabajo trata de encontrar alguna relación entre los exosomas y la

enfermedad renal, para ello, es fundamental el estudio de la función renal, que

puede investigarse a través de biopsia renal (El cual es un método invasivo no muy

recomendable) o estudiarse mediante la medición de la tasa de filtración glomerular,

el aclaramiento de creatinina o la proteinuria.

En cualquier caso, como se ha comentado anteriormente el estudio de la orina se ha

convertido en la fuente perfecta de biomarcadores renales para el desarrollo de

nuevas herramientas de diagnostico. En primer lugar, se comenzó a estudiar la orina

total pero actualmente se le ha dado más interés a estudiar la fracción exosomal de

la orina. Esto es debido a que los exosomas pueden ser secretados por cualquier

parte del sistema renal como las estructuras glomerulares, células de los túbulos

renales y en general, las células que recubren todo el sistema renal (Figura 4), lo

que se traduce en que no solo se puede conocer la composición proteica

característica de la enfermedad renal (Hoorn EJ. Et al., 2005; Dear JW. Et al., 2013)

si no que también se puede llegar a saber la localización exacta, es decir, el tejido

concreto donde existe la alteración (Pisitkun T. et al., 2006; Miranda KC. Et al.,

2010).

21

Figura 6: Imagen que ilustra las diferentes zonas del sistema renal por las cuales

pueden liberarse exosomas y la composición proteica característica de cada zona.

5.2 Daño renal agudo

Por definición, el daño renal agudo, es un trastorno que se caracteriza por una

disminución veloz de la tasa de filtración glomerular y la consecuente retención de

productos de desecho (Lamiere N. et al., 2005).

Clásicamente el biomarcador usado para esta patología era el valor de

concentración de creatinina sérica (SCR) ya que se ha demostrado que la

concentración de creatinina serica (SCR) se eleva cuando existe una disminución de

la filtración renal de al menos el 30%. Sin embargo, en nuevos estudios se descubrió

que los altos niveles de SCR no están asociados al origen de la lesión renal

(Barrera-Chimal J. et al., 2011) además de que sus concentraciones varían

22

ampliamente, por tanto, estas razones reflejan la necesidad de encontrar nuevos

biomarcadores mas eficaces.

Inmediatamente después, como respuesta a estos descubrimientos, los

biomarcadores propuestos para el diagnostico precoz del daño agudo renal fueron

NGAL (Lipocalina gelatinasa asociada a los neutrofilos), la interleucina 18 (Wang D.

et al., 2014; Mishra J. et al., 2005), y algunas proteínas como las chaperonas (En

concreto la Hsp72) (Barrera-Chimal J. et al., 2011; Morales-Buenrrostro LE. Et al.,

2014). En estudios posteriores, se sabía que la Fenituina A formaba parte de la

composición de los exosomas urinarios, se detecto que este compuesto aparecía

después de la lesión renal pero, no solo aparecía aumentada después, sino también

aparecía aumentada antes de cualquier cambio estructural que se detectase en una

biopsia renal (Zhou H. et al., 2006). Además el mismo equipo de investigación

identifico el factor de transcripción 3 (ATF3) en la fracción exosomal de la orina.

Como se puede observar se han encontrado varios compuestos que pueden ser

biomarcadores pero cabe mencionar que todos estos biomarcadores se detectaron

en pacientes, es decir, no se encuentran en individuos sanos en las proporciones

que estamos analizando.

5.3 Trastornos glomerulares

La barrera de filtración glomerular está compuesta por la membrana glomerular

basal, las células endoteliales y las células epiteliales, en cuyo caso se denominan

“podocitos”. La lesión de esta estructura se traduce en una pérdida de proteínas y

células de la sangre ya que no existe filtración (Lennon R. et al., 2014). En general,

en los trastornos glomerulares, los podocitos son las principales células afectadas

por lo tanto el estudio de podocitos en la composición de exosomas puede ser una

fuente fiable de biomarcadores para trastornos glomerulares.

5.3.1 Nefropatía diabética

Esta patología se origina debido al daño que ejerce el exceso de glucosa en sangre

sobre las nefronas. Para detectar esta enfermedad se realizo un estudio para

describir la expresión de miARNs de exosomas procedentes de pacientes control y

otros con micro-albumina (Diabéticos). Los resultados fueron diferentes dependiendo

23

del miARN usado, por ejemplo los niveles de miARN-145 y miARN-130 aumentaron

en pacientes diabéticos en comparación con los control, mientras que con el estudio

de miARN-155 y miARN-424 los pacientes control mostraron niveles similares y en

los diabéticos disminuyeron (Barutta F., et al., 2013), por lo que los estudios de

miARNs pueden resultar eficaces aunque se necesitan más experimentos para

asegurarse.

Otro biomarcador relevante para este trastorno es la enzima dipeptidil-peptidasa. Se

sabe que la concentración de esta enzima se sobre expresa en situación de

diabetes, así pues, se realizo un experimento con pacientes diabéticos y control para

comprobar su relación. Los resultados fueron los esperados, se detecto una mayor

sobreexpresión para esta enzima en los exosomas de los pacientes diabéticos en

comparación con los pacientes control (Sun AL. Et al., 2012). Por tanto estos

biomarcadores son prometedores en investigación pero se recomienda seguir

haciendo más estudios para corroborar los datos.

5.3.2 Glomerulonefritis

La glomerulonefritis es una inflamación de los glomérulos renales debida a la

acumulación de un gran número de anticuerpos en el glomérulo. Dentro de esta

patología, la nefropatía causada por la Ig A es el trastorno más común.

Concretamente, la nefropatía por Ig A puede aparecer por varios factores como la

síntesis de anticuerpos dirigidos a la “galactosa deficiente de Ig A” o la unión de la

“galactosa deficiente de anticuerpos (Ig A)” con glicopeptidos para así formar

complejos que a su vez se acumulan en el glomérulo (Suzuki H. et al., 2011). Se

llevo a cabo el aislamiento de los exosomas de pacientes con este trastorno y se

identifico un biomarcador, la CeruloPlasmina (CP) ya que se encontró en mayor

concentración en pacientes afectados que en los individuos sanos (Moon PG. Et al.,

2011) aunque se necesitan estudios más profundos para confirmar los resultados.

Otra patología relacionada con la glomerulonefritis es la glomeruloesclerosis

producida por podocitos que puede ser autoinmune o secundaria a la obesidad. Los

experimentos identificaron como biomarcador la proteína 1 del tumor de Wilm, que

se trata de un factor de transcripción fundamental para el desarrollo normal de los

24

riñones. Este se encontraba aumentado en los exosomas de pacientes enfermos

(Zhou H. et al., 2008). Años más tarde se realizo el mismo experimento con una

cohorte más grande de pacientes y los resultados fueron idénticos (Zhou H. et al.,

2013). Este sería un buen biomarcador de enfermedad renal.

5.3.3 Nefropatía en la membrana basal (TBMN)

La nefropatía de la membrana basal delgada del glomérulo renal se caracteriza por

una proteinuria mínima, una hematuria no progresiva y una función normal debido a

que la membrana basal aun está presente, solamente que ha adelgazado. Se cree

que está causada por la mutación en genes del colágeno como COL4 y COL5

(Tryggvason K. et al., 2006).

Los biomarcadores detectados en la composición de los exosomas de pacientes de

TBMN son la amino peptidasa N y los precursores de vasorine. Estos se

incrementaron en pacientes con TBMN así pues se podrían utilizar como

biomarcadores para el diagnostico de este trastorno (Moon PG. Et al., 2011).

5.4 Fibrosis renal

La fibrosis renal causa la degeneración progresiva del riñón y está relacionada con

la enfermedad renal crónica (ERC) en que este trastorno conduce a la insuficiencia

de varios órganos en las etapas finales de la ERC. Por tanto el estudio de

biomarcadores para la fibrosis renal es de gran relevancia ya que como se ha

comentado anteriormente la ERC es una de las causas de mortalidad más

importantes en el mundo. Estudios realizados con los miARNs contenidos en

exosomas urinarios han demostrado que comparando individuos sanos con

pacientes de ERC, se han detectado niveles reducidos de miARN-29 y miARN-200

en los pacientes de ERC (Lv LL. et al., 2013). Además, se encontró que tanto

miARN-9a y miARN29c pueden discriminar entre la fibrosis leve y la fibrosis severa.

Otro descubrimiento con respecto al estudio de los ARNs fue evaluando ARNs

mensajeros, en concreto la sinaptodina y la CD2AP. Los estudios reflejaron un

aumento de sinaptodina en detrimento de CD2AP que disminuía su concentración

en pacientes de ERC. En definitiva estos resultados apoyan la idea de utilizar el

25

contenido de ARN de los exosomas urinarios como herramientas de diagnostico en

el estudio y evaluación de enfermedades renales (Lv LL. et al., 2014).

5.5 Trastorno poliquistico renal

Se define la enfermedad renal poliquistica (PKD) como un trastorno genético que se

caracteriza por una serie de dilataciones quísticas del riñon que pueden causar una

afectación multiorganica. El origen principal de esta patología es una alteración en la

regulación genética de los genes PKD1, PKD2 o PKHD1 (Gonzales PA. Et al., 2009;

Hartung EA. Et al., 2014). Los productos de estos genes se detectan fácilmente en

los estudios proteomicos de los exosomas urinarios de pacientes, por lo que, podría

ser considerado para el análisis de la enfermedad (Pisitkun T. et al., 2006; Hogan

MC. Et al., 2009).

5.6 Trasplante renal

El trasplante renal es la opción más recomendada para pacientes con enfermedad

renal en la etapa terminal, aunque como se ha identificado, aun existen problemas

con los injerto ya que se suele producir el rechazo inmunológico. Debido a esto, una

vez hecho el trasplante, se han realizado varios estudios para investigar sobre las

enfermedades renales después del trasplante de riñón.

Los primeros estudios que usaron exosomas urinarios identificaron que la presencia

de NGAL en pacientes con trasplante de riñón era considerablemente diferente a la

concentración de NGAL de individuos control, además de que no hubo diferencias

significativas de concentración de NGAL en las muestras proporcionadas por

pacientes vivos y pacientes fallecidos por lo que el análisis de la concentración de

NGAL podría ser un biomarcador de daño en el injerto (Álvarez. Et al., 2013).

Otro marcador estudiado en los últimos años es la proteína CD133 exosomal. Se

sabía que en donantes sanos la concentración de esta proteína era elevada

mientras que en pacientes con enfermedad renal crónica (ERC) era muy baja en su

etapa terminal. La cuestión está en que en pacientes trasplantados se detecto una

concentración menor que en los individuos sanos, pero más elevada que en los

26

pacientes con la enfermedad crónica. Por tanto, esta proteína CD133 de la fracción

exosomal podría servir como biomarcador para valorar la función tubular renal y la

regeneración tisular después del trasplante, de esta forma poder realizar un

seguimiento del paciente para detectar un rechazo al injerto o la regeneración tisular

completa (Dimuccio V. et al., 2014).

5.7 Implicaciones en el cáncer

Los exosomas también se han estudiado para conocer si están implicados en los

procesos tumorales, actuando a nivel de mensajeros llevando información de un

lugar a otro del organismo. Los principales trastornos en los que se han estudiado

los exosomas son el carcinoma renal celular (RCC), el cáncer de vejiga y el cáncer

de próstata.

5.7.1 Carcinoma renal celular

Con respecto al carcinoma renal, los primeros estudios realizaron comparaciónes

entre los perfiles proteicos de los exosomas de pacientes de RCC y de individuos

control esperando diferentes resultados en ambas muestras. Al finalizar el estudio,

las hipótesis se corrobororan y específicamente los compuestos MMP-9 y EMMPRIN

se encontraban sobre expresados en los pacientes de carcinoma renal. Es

interesante resaltar que no solo se detecto la presencia, si no que se identifico su

relación con la progresión de la enfermedad, es decir, como potenciadores de la

metástasis (Raimondo F. et al., 2013).

5.7.2 Cáncer de vejiga

Al estudiar el cáncer de vejiga, recientemente se ha descrito que los exosomas

urinarios de pacientes con cáncer de vejiga poseen compuestos que promueven la

migración celular para así facilitar la progresión del cáncer. Este diagnostico se

realizo estudiando la proteína TACSTD2 en una pequeña población de individuos

(Chen CL. et al., 2012). Cabe destacar los estudios realizados por Pérez et al, que

describen un perfil de expresión diferente para cuatro ARNs mensajeros

encontrados en exosomas. Estos ARNm codifican información para las proteínas

27

LASS2, GALNT1, ARHGEF39 y FOXO3 (Pérez A. et al., 2014). En resumen tanto

GALNT1 como LASS2 se identificaron solo y exclusivamente en los exosomas

urinarios de los pacientes con cáncer de vejiga mientras que ARHGEF39 y FOXO3

se detectaron en los pacientes control. En conclusión estos marcadores podrían

utilizarse para evaluar la presencia del cáncer aunque se necesitan aun mas

estudios para los biomarcadores en cáncer de vejiga.

5.7.3 Cáncer de Próstata

El cáncer de próstata o hiperplasia benigna de próstata es una de las patologías

más comunes en los varones aunque solo una pequeña proporción progresa a

enfermedad de tipo agresiva. Actualmente para su diagnostico se incluye la

determinación sérica del antígeno prostático especifico (PSA) mediante biopsias. El

problema de este método es que puede fallar al identificar correctamente si se trata

de cáncer agresivo o no agresivo, lo que implica un exceso de pacientes a tratar

(Nogueira L. et al., 2010).

A raíz de este problema, en principio la orina sería el mejor fluido biológico para

encontrar nuevos biomarcadores pero un estudio mostro que en este caso, se

identifican mas en plasma sanguíneo (Hessvik NP. Et al., 2013). En relación a los

estudios de orina, realizando una comparación entre pacientes afectados por este

cáncer e individuos sanos, se identificaron las proteínas PSA y PSMA en exosomas

de los pacientes enfermos con lo cual pueden servir de biomarcadores (Mitchell PJ.

Et al., 2009). Un factor importante es si los exosomas urinarios también realizan una

función de comunicación para promover la metástasis y recientemente se han

encontrado unas proteínas (ITGA3 e ITGB1) específicamente en pacientes con

cáncer de próstata y metástasis mientras que estas proteínas no aparecen en

pacientes con el cáncer y sin metástasis (Bijnsdorpl V. et al., 2013).

6. CONCLUSION

Nuestro objetivo era el de realizar una revisión bibliográfica de la implicación de los

exosomas en las enfermedades renales. Como se ha podido observar, poseen

ventajas e inconvenientes ya que dado su reciente descubrimiento existen muchos

28

métodos a seguir y muchos resultados dispares que abren un gran abanico de

posibilidades en la investigación para mejorar la capacidad de diagnostico.

Este hecho, provoca que no se puedan dar unas conclusiones concretas sobre este

tema pero se puede resumir en que debido a la naturaleza no invasiva del

procedimiento de toma de muestras y la gran cantidad de información disponible a

partir de todos estos estudios, será probable que el análisis de exosomas tenga un

rol importante en la investigación de enfermedades renales en el futuro.

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