OCURRENCIA NATURAL DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS …
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OCURRENCIA NATURAL DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS COMO ALTERNATIVA PARA EL MANEJO DE PLAGAS EN EL AGROECOSISTEMA CAFETERO DEL MUNICIPIO MANAURE, CESAR. MIGUEL ÁNGEL MOREU OCHOA FUNDACIÓN UNIVERSITARIA DE POPAYÁN FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES PROGRAMA DE ECOLOGÍA POPAYÁN 2019
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OCURRENCIA NATURAL DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS COMO
ALTERNATIVA PARA EL MANEJO DE PLAGAS EN EL AGROECOSISTEMA
CAFETERO DEL MUNICIPIO MANAURE, CESAR.
MIGUEL ÁNGEL MOREU OCHOA
FUNDACIÓN UNIVERSITARIA DE POPAYÁN
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
PROGRAMA DE ECOLOGÍA
POPAYÁN
2019
OCURRENCIA NATURAL DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS COMO
ALTERNATIVA PARA EL MANEJO DE PLAGAS EN EL AGROECOSISTEMA
CAFETERO DEL MUNICIPIO MANAURE, CESAR.
MIGUEL ÁNGEL MOREU OCHOA
Trabajo académico presentado como requisito para optar el título de Ecólogo
HERNANDO DARÍO, SUÁREZ GÓMEZ
Ingeniero Agrónomo, M. Sc. Entomólogo
Director
FUNDACIÓN UNIVERSITARIA DE POPAYÁN
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
PROGRAMA DE ECOLOGÍA
POPAYÁN
2019
Nota de aceptación
______________________
______________________
______________________
______________________
Presidente del jurado
______________________
Jurado
______________________
Jurado
Popayán, Mayo de 2019
Dedicatoria
A mis padres, Inés Yoliana Ochoa y José Andrés moreu.
A mis hijos Jade y Mattew.
AGRADECIMIENTOS
A Dios por su palabra para consumar las metas planteadas en este objetivo personal
y profesional.
A mis padres, a quienes les debo mi existencia, en especial a mi madre Inés Yoliana
Ochoa, José Andrés Moreu, por su apoyo incondicional.
A mis hijos, quienes me han dado fortaleza para seguir adelante.
Al Ingeniero Agrónomo, M.Sc. Entomólogo Hernando Darío Suárez Gómez, por
conceder valioso tiempo y aporte cuando más se requirió.
A los Profesores Jaime López y Guillermo Vélez por sus conocimientos.
A la Fundación Universitaria de Popayán y su Facultad de Ciencias Naturales en el
programa de Ecología, por ser conductores de este trabajo de investigación y permitirme
lograr este objetivo académico.
A los cafeteros del municipio de Manaure, Departamento del Cesar, por brindar su
tiempo, sus conocimientos y experiencias para suministrar la información sin contratiempo.
A la Universidad Popular del Cesar por permitirme hacer uso de sus recursos de
laboratorio para realizar los análisis necesarios.
CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 13
CAPÍTULO 1. ASPECTOS GENERALES ..................................................................... 15
1.1 Planteamiento del problema. .......................................................................................... 15
1.2 Objetivos ......................................................................................................................... 16
1.2.1 Objetivo General.......................................................................................................... 16
1.2.2 Objetivos Específicos .................................................................................................. 16
1.3 Justificación .................................................................................................................... 16
CAPÍTULO 2. MARCO REFERENCIAL ...................................................................... 18
2.1 Antecedentes ................................................................................................................... 18
2.2 Importancia del cultivo del Café .................................................................................... 21
2.3 Plagas del café ................................................................................................................ 22
2.4 Hongos Entomopatógenos .............................................................................................. 24
2.4.1 Caracterización de los HE ........................................................................................... 25
2.4.2 El hongo Beauveria bassiana ...................................................................................... 25
2.4.2.1 Clasificación taxonómica de Beauveria bassiana .................................................... 26
2.4.2.2 Modo de acción del hongo Beauveria bassiana ....................................................... 27
2.4.3 El hongo Metarhizium anisopliae ............................................................................... 27
2.4.3.1 Clasificación Taxonómica de Metarhizium anisopliae. ........................................... 28
2.4.3.2 Modo de acción de Metarhizium anisopliae............................................................. 28
2.4.4 El hongo Lecanicillium lecanii .................................................................................... 28
2.4.4.1 Clasificación Taxonómica de Lecanicillium lecanii. ............................................... 29
2.4.4.2 Modo de acción de Lecanicillium lecanii ................................................................. 29
2.5 Aplicación de HE para control de insectos ..................................................................... 30
CAPÍTULO 3. ASPECTOS METODOLÓGICOS ......................................................... 33
3.1 Delimitación del estudio ................................................................................................. 33
3.1.1 Localización................................................................................................................. 33
3.2 Línea de investigación. ................................................................................................... 34
3.3 Procedimiento ................................................................................................................. 34
3.4 Identificación Macro y Microscópica de los Entomopatógenos .................................... 36
3.5 Pruebas de Patogenicidad con hongos Entomopatógenos. ............................................. 36
CAPITULO 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................. 38
4.1 Ocurrencia de los HE ...................................................................................................... 38
4.2 Identificación macroscópica y microscópica de los HE ................................................. 39
4.2.1 Beauveria bassiana (Hypocreales: Clavicipitaceae) .................................................. 39
4.2.2 Metarhizium anisopliae (Hypocreales: Clavicipitaceae) ............................................ 40
4.2.4 Trichoderma sp (Hypocreales: Hypocreaceae) .......................................................... 43
4.3 Prueba de patogenicidad con B. bassiana y M. anisopliae ............................................. 44
4.4 Identificación macroscópica y microscópica de hongos contaminantes ........................ 46
4.4.1 Aspergillus sp (Eurotiales: Trichocomaceae) ............................................................. 47
4.4.2 Penicillium sp (Eurotiales: Trichocomaceae) ............................................................. 48
4.4.3 Mucor sp (Mucorales: Mucoraceae) ........................................................................... 49
4.4.4 Fusarium sp (Hypocreales: Nectriceae) ..................................................................... 49
CONCLUSIONES .............................................................................................................. 51
RECOMENDACIONES .................................................................................................... 53
GLOSARIO ......................................................................................................................... 53
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 57
ANEXOS ............................................................................................................................. 71
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Algunas características de las fincas objeto de estudio .......................................... 34
Tabla 2. Ocurrencia de cepas de HE en fincas ..................................................................... 38
Tabla 3. Número de individuos encontrados después de aplicar los tratamientos .............. 44
Tabla 4. Número promedio de adultos de H. Hampei muertos al aplicar B. bassiana y M.
anisopliae en laboratorio. ..................................................................................................... 45
Tabla 5. Ocurrencia de hongos fitopatógenos según finca ................................................... 47
LISTA DE IMÁGENES
Pág.
Imagen 1. Localización geográfica del Municipio de Manaure, Cesar ................................ 33
Imagen 2. Identificación macroscópica de B. bassiana........................................................ 39
Imagen 3. Identificación microscópica de B. bassiana ........................................................ 40
Imagen 4. Identificación macroscópica de M. anisopliae .................................................... 40
Imagen 5. Identificación microscópica de M. anisopliae ..................................................... 41
Imagen 6. Identificación macroscópica de Isaria sp ............................................................ 42
Imagen 7. Identificación microscópica de Isaria sp ............................................................. 42
Imagen 8. Identificación macroscópica de Trichoderma sp ................................................. 43
Imagen 9. Identificación microscópica de Trichoderma sp ................................................. 44
Imagen 10. Identificación macro y microscópica de Aspergillus sp .................................... 48
Imagen 11. Identificación macro y microscópica de Penicillium sp .................................... 48
Imagen 12. Identificación macro y microscópica de Mucor sp ............................................ 49
Imagen 13. Identificación microscópica y macroscópica de Fusarium sp ........................... 50
LISTA DE GRÁFICAS
Pág.
Gráfica 1. Tiempo letal medio (LT50) B. bassiana (72 x107con/ml) y M. anisopliae ...... 46
LISTA DE ANEXOS
Pág.
Anexo A. Agroecosistema cafetero de Manaure, Cesar ....................................................... 72
Anexo B. Árbol de cafeto en plena producción, Manaure, Cesar ........................................ 73
Anexo C. Granos de café afectados por H. Hampei ............................................................. 73
Anexo D. Análisis de varianza para Patogenicidad de hongos Entomopatógenos. ............. 74
Anexo E. Aislamientos de HE .............................................................................................. 74
Anexo F. Disposición de la broca y grano de cafeto en prueba de Patogenicidad ............... 74
Anexo G. Adultos de H. hampei afectado por B. bassiana en laboratorio ........................... 75
RESUMEN
Esta investigación tiene como propósito identificación la ocurrencia de hongos
entomopatógenos y su utilidad para el manejo de la broca del café (H. hampei) como agente
de control microbiológico. Se desarrolló en cuatro fincas de Manaure, Cesar y en el
laboratorio de Microbiología de la Universidad Popular del Cesar en el primer semestre de
2017. Se tomaron 60 muestras de suelos superficial, rizoplano y rizosférico y se obtuvieron
aislamientos de las especies entomopatógenos B. bassiana, Metarhizium sp y Trichoderma
sp. Luego se prepararon inóculos de los hongos de mayor presencia B. bassiana y
metarhizium sp suspendiéndolos en tubos de ensayo en 10 ml de agua destilada estéril y dos
gotas de Tween 80 al 0,1%, con concentraciones de B. bassiana ajustada a 72 X 107
,57 X
108
y 52 X 109
y de Metarhizium sp ajustada a 74 x 107
,69 X 108
y 67 X 109. Los resultados
muestran presencia que B. bassiana representaron el 42,80 %, M. anisopliae el 28,60% y
Trichoderma sp el 14,30% respectivamente. La prueba de Patogenicidad mostró que B.
bassiana, (72 x107con/ml) es la más efectiva y provocó una mortalidad del 57% sobre H.
hampei.
ABSTRACT
The purpose of this research is to identify the occurrence of entomopathogenic fungi
and their usefulness for the management of the coffee berry borer (H. hampei) as a
microbiological control agent. It was developed in four farms of Manaure, Cesar and in the
Microbiology laboratory of the Universidad Popular del Cesar in the first half of 2017.
Sixty samples of superficial, rhizoplane and rhizospheric soils were taken and isolations of
the entomopathogenic species B. bassiana were obtained, Metarhizium sp and Trichoderma
sp. Then, inocula were prepared for the fungi with a greater presence of B. bassiana and
metarhizium sp by suspending them in test tubes in 10 ml of sterile distilled water and two
drops of 0.1% Tween 80, with concentrations of B. bassiana adjusted to 72 X 107, 57 X
108 and 52 X 109 and of Metarhizium sp adjusted to 74 x 107, 69 X 108 and 67 X 109. The
results show presence that B. bassiana represented 42.80%, M. anisopliae 28.60% and
Trichoderma sp 14.30% respectively. The Pathogenicity test showed that B. bassiana, (72
x107 with / ml) is the most effective and caused a 57% mortality on H. hampei.
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INTRODUCCIÓN
Los Hongos Entomopatógenos, constituyen el grupo de mayor importancia en el
control biológico de insectos plaga, son únicos y sobresalientes entre los microorganismos,
porque infectan al huésped a través del tegumento, acción por contacto, lo que les confiere
ventaja para el control de varios grupos de insectos fitófagos de gran importancia en la
agricultura (Merchán, 2015).
El objetivo principal del presente trabajo, fue identificar organismos de control
microbiológico que sirvan como alternativa para el control de plagas en el agro ecosistema
cafetero de la región de Manaure, Cesar.
El empleo de estos agentes de control biológico presenta numerosas ventajas,
seguridad para la salud humana y para la fauna benéfica, reducción de la presencia de
residuos insecticidas en los alimentos e incremento de la biodiversidad del medio (Motta y
Murcia, 2011). La utilización de hongos Entomopatógenos para el control de insectos es
una alternativa viable desde el punto de vista económico, ya que, se pueden reproducir a
gran escala y en pequeñas cantidades, atacan a diferentes especies de insectos, y son
adecuados para su aplicación por introducción, manipulación ambiental o aumento
inoculativo (Merchán, 2015)
Los resultados mostraron que existe diversidad de microorganismos que pueden ser
utilizados para planes de manejo de insectos y enfermedades en el agroecosistema cafetero
de la región y que pueden ser aplicados como alternativos al uso de químicos.
De acuerdo a estos elementos destacados anteriormente, el documento presenta en
primera instancia una descripción de algunos elementos teóricos y conceptuales sobre los
14
HE y sobre algunos ejercicios realizados en materia de control de plagas mediante este tipo
de microorganismos.
Posteriormente se describen los aspectos metodológicos necesarios para la
realización del análisis de la ocurrencia de HE en la zona geográfica mencionada.
Como tercera instancia se evidencian los datos arrojados del análisis de laboratorio,
donde se destacan la identificación macroscópica y microscópica de los HE y de algunos
hongos contaminantes. En esta se muestra además los resultados de tratar al H. hampei con
B. bassiana y M. anisopliae.
Finalmente se establecen algunas conclusiones y recomendaciones con fines de
promover el uso de HE para el control y manejo integrado de plagas, especialmente H.
hampei.
15
CAPÍTULO 1. ASPECTOS GENERALES
1.1 Planteamiento del problema.
Colombia es uno de los países de mayor diversidad biológica en el mundo, pero a
pesar de su importancia (no sólo en términos económicos, sino científicos, estéticos y de
equilibrio), la velocidad como se está perdiendo preocupa muy poco a gobernantes,
científicos y a la población en general. En este sentido, Molano (2010), plantea la necesidad
de establecer requisitos y procedimientos en el manejo de agroquímicos para minimizar los
riesgos de los plaguicidas, los cuales, se han convertido en agentes causantes de
desequilibrio y deterioro ambiental en los ecosistemas, al punto que la destrucción de
plantas alimenticias y silvestres, la muerte de animales y graves problemas de salud son
frecuentes.
Además, de la ausencia de los lineamientos regulatorios, existe un desconocimiento
de los agricultores sobre el uso y la dosificación de insecticidas permitidos para el
tratamiento de los diferentes cultivos, lo que ha sumado al deterioro del ecosistema. No
obstante, de los beneficios de la utilización de sustancias químicas, es un hecho que el uso
descontrolado genera disminución de la biodiversidad y la contaminación del ecosistema
(Vázquez y Landeros, 2009).
Los estudios sobre el uso de las cepas entomopatógenas efectivas en el control
biológico de las plagas del café, a pesar de las bondades ambientales y del valor agregado
que puede representar sobre este producto, son todavía pocos y no evidencian de manera
significativa el alto impacto que se obtiene sobre los cultivos y sobre la economía del sector
cafetero, lo que sigue quizá ameritando el uso de plaguicidas químicos, generando la
resistencia de plagas, la eliminación de fauna benéfica y la intoxicación de humanos.
16
Dadas estas consideraciones, cabe preguntarse:
¿Hay ocurrencia natural de hongos entomopatógenos como alternativa para el manejo de
plagas en el agroecosistema cafetero del municipio de Manaure, Departamento del Cesar?
1.2 Objetivos
1.2.1 Objetivo General
Identificar la ocurrencia natural de hongos entomopatógenos en el agroecosistema
cafetero del municipio Manaure, Cesar, como alternativa para el manejo de plagas.
1.2.2 Objetivos Específicos
Identificar la presencia natural de hongos entomopatógenos en el agroecosistema
cafetero del municipio Manaure.
Establecer la efectividad del uso de este tipo de hongos como alternativa para el
manejo de plagas en la región objetivo.
1.3 Justificación
Los estudios orientados a la identificación de presencia de microorganismos como
los hongos entomopatógenos, son de gran importancia en la actualidad debido, a que estos
hongos “son considerados como controladores funcionales de las poblaciones de plagas.
Para ello, muchas de las cepas empleadas actúan como agentes de control biológico
generando una alternativa eficaz, libre de efectos adversos propias de los agroquímicos
comunes” (Carballo, 1998, p.2).
Dadas estas propiedades de los HE, el control biológico surge como alternativa
segura para el medio ambiente. Es por esto que se pretende aislar e identificar cepas de
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microorganismos benéficos especialmente hongos, en suelos del agroecosistema cafetero en
el mencionado municipio a partir de muestras de material de suelo y de insectos enfermos
(Maitre, 2003).
Por medio del estudio, es posible contribuir a difundir las bondades de los hongos
descritos y con ello quizá fomentar “el uso de bioinsecticidas naturales a partir de
microorganismos, el cual brinda ventajas frente al desarrollo sostenible del suelo” (Correa,
2007, p. 113).
El estudio puede contribuir a destacar la importancia del uso de insecticidas
microbiales que causan enfermedades a las plagas, convirtiéndose en una alternativa
novedosa de control biológico compatible con la fauna del entorno y con los humanos
mismos, pues según (Malarvannan et al, 2010, p. 128), se ha demostrado que las cepas de
los hongos, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, y Lecanicillium lecanii aisladas
de distintos huéspedes y regiones geográficas son altamente virulentas para muchas plagas.
Al lograr difundir estudios sobre las ventajas de implantar un control biológico
compatible con el medio ambiente, es posible que el café producido en esta región logre un
mayor valor agregado en el mercado, pues los productos que incorporan prácticas
agroecológicas obtienen un mayor precio, sobre todo en los mercados internacionales
especializados, lo que a garantiza una fuente de ingresos para los cafeteros de Manaure
sostenible en el tiempo.
Estas y otras posibles consideraciones ameritan que los estudios destinados a
identificar mecanismos de control de plagas en los cultivos se realicen con mayor
frecuencia, sobre todo si estos trabajos contribuyen a mejorar la producción agrícola
sostenible y compatible con el medio ambiente.
18
CAPÍTULO 2. MARCO REFERENCIAL
2.1 Antecedentes
Tradicionalmente, el control de plagas se ha realizado con el uso de plaguicidas
químicos sintéticos, sean clorados, organofosforados o piretroides; los cuales fueron
exitosos en sus inicios.
Sin embargo, como consecuencia del uso inadecuado e indiscriminado, los insectos
adquirieron resistencia a estos productos, trayendo como consecuencia un rápido
crecimiento de las poblaciones de plagas secundarias y alteraciones ecológicas, causando
efectos indeseables en el medio ambiente y en la salud del ser humano y la reducción de
las cosechas, tal como lo afirman González, Aguilar, y Herrera (2012).
Ahora, el uso de insecticidas para el control de la broca no es recomendable como
única alternativa. Según (Decazy, 1990), esta práctica ampliamente usada en otros países
cafeteros de América afectados por la broca tiene muchos inconvenientes: como es el
control del insecto una vez alcanza el interior de los frutos, cuando no es posible el uso de
insecticidas. Éstos entonces, deben usarse sólo cuando la broca está penetrando a nuevos
frutos como lo proponen Villalba, Bustillo y Chaves, (1995). Lo anterior, se agrava debido
a que en Colombia el café presenta múltiples floraciones que, según Camayo y Arcila,
(1997), es la respuesta a las condiciones climáticas, lo cual, es causa que, en zonas como el
eje cafetero colombiano, por ejemplo, se encuentren durante todo el año frutos susceptibles
de ser atacados, incrementándose considerablemente la frecuencia de las aspersiones de
insecticidas.
No obstante, del uso de agroquímicos, aun el suelo constituye un importante
reservorio para una gran diversidad de microorganismos benéficos para los cultivos, tal es
19
el caso, de los hongos entomopatógenos, que pueden contribuir significativamente a la
regulación de las poblaciones de insectos.
Según (Keller y Zimmermann, 1989, p. 240), algunas especies de hongos
pertenecientes al orden Hypocreales (Phyllum: Ascomycota) habitan en el suelo para
cumplir una parte de su ciclo de vida; entre ellos los géneros más comunes son Beauveria,
Metarhizium e Isaria.
En Bruck (2010) se resalta el papel que desempeña el suelo en cuanto a la riqueza
microbiótica, pues
La ecología de hongos entomopatógenos en la rizosfera, es el objeto de estudio de
la patología de insectos y la rizosfera es la región del suelo en el cual la liberación
de exudados de las raíces influencia la microbiótica del suelo y pueden proveer un
ambiente favorable a los hongos entomopatógenos. (p. 109)
A partir de estos hallazgos, se han realizado experimentos que buscan aislar a los
HE para lograr un mayor crecimiento y propagación. Entre estos el de Schapovaloff, et al.
(2015), que observaron que los aislamientos de HE obtenidos de una misma especie
presentaban diferencias en la tasa de crecimiento, la coloración del micelio, las dimensiones
de las estructuras reproductivas y el porcentaje de germinación de los conidios.
Otro experimento como el de St. Leger et al (1992), evidencia sobre un “alto nivel
de distancia genética entre aislados identificados como B. bassiana solamente por
morfología; lo que indica que B. bassiana probablemente es un agregado de especies. Sin
embargo, el hongo existe con una estructura de población clonal en muchas situaciones” (p.
90).
Luego, como estos hogos pueden ser agentes controladores eficaces de insectos ya
que en consideración de Loureiro, et al., (2006), los HE son responsables por
20
aproximadamente el 80% de las enfermedades presentes en insectos, lo que los convierte en
importantes reguladores de poblaciones de plagas.
En concordancia con estas propiedades de los HE, García, et al. (2011), Plantean
que, es necesario obtener cepas nativas para asegurar una mayor efectividad, si bien las
especies han evolucionado a las condiciones ambientales de la zona por lo cual no necesitan
una etapa de adaptabilidad como en el caso de cepas exportadas, que incluso con éstas se
corre el riesgo de no adaptabilidad y/o en su caso de no presentar eficiencia de
patogenicidad.
Los beneficios de los HE han motivado a la creación de bioinsecticidas que ya se
están utilizando en varios países. Tal como lo indican Mascarin, et al. (2010), estos
productos elaborados a base de HE son utilizados en diferentes países del mundo debido a
su especificidad y a su amplio rango de hospederos, dentro de los cuales Beauveria
bassiana (Vuillemim) en bálsamo es el más utilizado. El ingrediente activo de este hongo
son las esporas aéreas producidas a través de un sistema de fermentación bifásica (líquido-
sólido) que permite obtener concentraciones de esporas con toxicidad satisfactoria en un
menor tiempo.
La investigación de Romero et al, (2012), evidencian la utilización de diversas
fuentes de carbono y nitrógeno tales como licor de maíz, aminoácidos y peptona de
colágeno en el medio de cultivo, obteniendo abundante micelio y alta concentración de
blastosporas en menores tiempos de fermentación. Así mismo, Núñez et al, (2012),
consideran que B. bassiana, con mayores niveles de concentración de azucares es posible
aumentar la concentración de biomasa para así lograr mayores niveles de producción.
Así mismo, el estudio como el de Chong et al, (2011), muestran la efectividad sobre
larvas de Pluxtella xylostella (L). Para ello, compararon la actividad biológica de
21
blastosporas secas producidas en medio líquido (sacarosa y licor de maíz fermentado)
usando un fermentador con dos impulsores tipo Rushton y formuladas con tierra de
diatomeas a una concentración de 1x108 blastosporas/ml de B. bassiana sobre larvas del
tercer estadio de desarrollo, las cuales causaron un 90% de mortalidad de larvas en
comparación con otros dos medios de cultivo utilizados.
2.2 Importancia del cultivo del Café
El cultivo del café en Colombia representa el segundo renglón generador de divisas
para el país. En 1991 participaba en el PIB total con el 5,3% y en el PIB agropecuario con
el 23,4% (35). Por tanto, cualquier problema que lo afecte sigue siendo de especial
importancia para la economía colombiana. El ecosistema cafetero se ha caracterizado por el
buen manejo que ha recibido, lo cual ha permitido la preservación de los recursos
renovables, la protección de la biodiversidad y el mantenimiento del equilibrio biológico, al
no hacerse uso de insecticidas en forma irracional Bustillo, (2007; p. 6).
Ha sido de vital importancia para la economía, no sólo representa el principal
producto de exportación agrícola, sino que es el símbolo que la identifica y que realza su
imagen, representa el sistema de producción de más alto valor socioeconómico,
medioambiental y tecnológico, constituyéndose el principal sustento de muchos
campesinos, (Pérez et al., 2013). Existen seis variedades de café en Colombia de origen
arábigo: Típica, Pajarito, Borbón, Tabí, Caturra y Variedad Colombia. (Proexport
Colombia, 2013)
Según la Federación Nacional de Cafeteros –FEDECAFE-, en Colombia existen
más de 518 mil caficultores, de los cuales el 94% tienen menos de 5 hectáreas. El área total
22
en café es superior a las 881.000 hectáreas y el promedio nacional es de 1.7 hectáreas en
café. En el Departamento del Cesar existen 4.828 caficultores que cultivan 834 hectáreas.
De estos, 257 son caficultores ubicados desde los 800 hasta los 1700 metros sobre el nivel
del mar. Estos caficultores constituyen el capital social del subsector cafetero FEDECAFE,
(2013). Durante los años 2013 a 2016 el valor de la producción de café en miles de millones
fue de 75, 85, 94 y 78 mil millones de pesos (DANE, 2017)
2.3 Plagas del café
En Cárdenas, (1983) y (1985) lo mismo que en ICA, (1989), citados por (Bustillo, 2007)
puede destacarse que:
El cultivo del café en Colombia se había mantenido libre de problemas de insectos
a través de todo su desarrollo como explotación comercial. Solamente se habían
registrado ataques esporádicos de insectos como: Orthezia praelonga Douglas,
Coccus viridis (Green), Planococcus citri (Risso), Dismicoccus brevipes
(Cockerell); Leucoptera coffeellum (Guerin - Méneville); Oxydia spp. y el ácaro
Oligonychus yothersi McGregor. Estos insectos y ácaros nunca llegaron a
convertirse en plagas serias debido a la estabilidad del ecosistema cafetero, con su
rica biodiversidad, lo cual favorece el desarrollo de la fauna benéfica y mantiene el
equilibrio entre las especies (p.6).
Se destaca además que, en las zonas cafeteras no se habían usado
indiscriminadamente los insecticidas, hasta tal punto que Colombia era el único país en el
mundo en el que la caficultura se manejó hasta la llegada de la broca con muy poco uso o
casi ningún insecticida como lo afirma Bustillo, (1991). La aparición de este coleóptero
alteró el equilibrio, pues al encontrar “condiciones favorables desarrolló todo su potencial
biótico sin ninguna restricción, alcanzando niveles altos de población debido a la ausencia
de agentes benéficos con los cuales ha coevolucionado en su sitio de origen” (p.7).
23
Actualmente “las principales plagas del café que afectan los cafetos: siguen siendo
la broca del café (Hypothenemus hampei) y el minador de la hoja (Leucoptera coffella)”
(Bustillo, Orozco y Cháves, 2000, p. 120). “La primera de ellas, Hypothenemus hampei
(Ferrari) (Coleoptera: Scolytidae) se encuentra afectando cerca de 800.000 Has
disminuyendo el patrimonio de más de medio millón de familias cafeteras” (Bustillo y
Aristizábal, 2006, p.71). Según la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria
–CORPOICA- (2011), la broca al ser la más agresiva de las plagas, es la más estudiada.
Originaria de África Ecuatorial, llegó al continente americano a principios del siglo XX,
hallándose en la actualidad prácticamente en todos los países productores de café.
Dada la importancia del cultivo de café en Colombia, cualquier problema que lo
afecte puede ser de gran impacto para la economía del país. A pesar de ser un cultivo cuya
producción depende de las condiciones de temperatura, se desconoce cuáles podrían ser las
consecuencias del cambio climático sobre este cultivo, cómo se afectaría su distribución
geográfica, fenología, manejo de suelos, agua, plagas y enfermedades.
De acuerdo Corpoica (2011), los resultados del cambio climático proyectado para el
año 2020 indican que la producción de café podría no ser económicamente viable para los
productores ya que se predice una reducción del 34% de la producción actual.
Otra de las plagas que afectan el cultivo es la roya hemileia vastatrix que se logró
contrarrestar con la adopción de variedades mejoradas resistentes a este hongo, tal como la
variedad Colombia. Esta variedad en 1990 ya había logrado superar las fases de prueba y se
afianzaba en el país debido a su alto rendimiento, suavidad y resistencia al hongo y los
cafetales de variedad Caturra empezarían a sufrir disminuciones en las plantaciones
nacionales.
24
2.4 Hongos Entomopatógenos
Los HE tienen un gran potencial como agentes de control, ya que, constituyen un
grupo con más de 750 especies que al dispersarse en el ambiente provocan infecciones
fúngicas en las poblaciones de insectos. Estos hongos inician su proceso infectivo cuando
las esporas son retenidas en la superficie del integumento, donde se inicia la formación del
tubo germinativo, comenzando el hongo a excretar enzimas como las proteasas, quitinasas,
quitobiasas, lipasas y lipooxigenasas (Pucheta et al, 2006 p.12).
Los hongos Entomopatógenos son de gran importancia dentro de los
agroecosistemas por su capacidad natural para regular las poblaciones de insectos, la cual
depende de la susceptibilidad del hospedero o de la asociación patógeno-hospedero, en este
último caso, el insecto hospedero puede ejercer una presión de selección que favorezca a
pocos genotipos del patógeno; es decir, hay una selección natural de estos microorganismos
en términos de especialización con respecto al hospedero (Leger y Roberts, 1997, p.85).
Sosa, López y Humber (2010), dentro del Phyllum Entomophthoromycotina, orden
Entomophtorales,
se incluyen más de 200 especies patógenas, las cuales generan epizootias en
especies de los órdenes Hemiptera, Lepidoptera, Orthoptera y Diptera. Los
hongos de este orden se caracterizan por presentar hifas no septadas y son de
reproducción asexual y sexual. La reproducción sexual ocurre por la
formación de conidios primarios, los cuales germinan y penetran en el
insecto, pudiendo originar conidios secundarios y terciarios. Dentro del
insecto producen cuerpos hifales y, si las condiciones no son favorables,
forman esporas de resistencia. Además, tienen la característica de emitir
rizoides que fijan el insecto al sustrato vegetal. Los principales géneros de
Entomophtorales son: Conodiobulus, Zoophthora, Pandora, Entomophaga,
Entomophthora, Neozygites (p. 107)
25
2.4.1 Caracterización de los HE
Los HE se han usados con mayor frecuencia que otro tipo de patógenos para el
control biológico clásico” (Hajek y Delalibera, 2010, P.147). “Las especies del Phyllum
Ascomycota, orden Hypocreales, son las más utilizados, ya que tienen un amplio rango de
insectos hospedantes y su manipulación en cultivos in vitro y en fermentaciones sólidas es
relativamente fácil (Murrin, 1996, p.360).
Así mismo, “los hongos del Subphyllum Entomophthoromycotina, Orden
Entomophtorales, son buenos candidatos para generar epizootias y al desarrollo de esporas
de resistencia, sin embargo, su crecimiento es reducido en cultivos in vitro y no pueden ser
producidos a gran escala” (Papierok, 2007, p.71).
Unos pocos programas de control biológico están siendo empleados para controlar
las poblaciones de insectos del Orden Hemiptera, Coleoptera y Lepidoptera mediante la
introducción de hongos entomopatógenos. Estos programas se están desarrollando
mayoritariamente en áreas de América del Norte y las islas del Pacífico y en menor medida
en América Latina (Hajek y Delalibera, 2010, p.147).
2.4.2 El hongo Beauveria bassiana
Este es “un hongo anamórfico que produce conidios hialinos esféricos, que se ha
reportado como patógeno de artrópodos. Anteriormente se había clasificado dentro del
género Beauveria Vuill., junto con tres especies de importancia agrícola, B. bassiana, B.
brongniartii y B. alba” (Hoog, 1972, p.30).
De acuerdo a la Asociación Internacional Micológica –IMA- por sus siglas en
inglés, el hongo está clasificado como Beauveria bassiana (Bals,) Vuillemim, dentro de la
familia Verticilliaceae. Filogenéticamente se ha evidenciado que Beauveria está asociado
26
con la familia Cordycipitaceae del orden Hypocreales. Así mismo, se ha reportado que B.
bassiana y B. brongniartii están ligados en desarrollo y filogenéticamente a las especies
Cordyceps (Rehner et al., 2011, p.1060). Los frecuentes cambios en la clasificación
taxonómica de un gran número de HE, aún continúan causando cierta confusión entre los
investigadores del área. Con la ayuda de técnicas moleculares la posición filogenética de
algunos grupos de hongos ha sido determinada con mayor precisión.
Los HE fueron clasificados en el Filum Deuteromycota y Clase Hyphomycetes
(Hongos anamórfico/asexuados) tales como M. anisopliae, B. bassiana,
Lecanicillium spp; Hirsutella spp; Isaria spp (Paecilomyces spp) entre otros, la
identificación de la fase teleoformica (sexual) de esos hongos en la naturaleza,
(géneros: Cordyceps, Torrubiella, o Hypocrella), fueron clasificados en el Filum
Ascomycota (Humber, 2007, p.12).
2.4.2.1 Clasificación taxonómica de Beauveria bassiana
Según Alexopoulus y Mims (1979), la clasificación taxonómica de este hongo es de
la siguiente manera:
Reino. Myceteae.
División Amastigomycota.
Sub división Deuteromycotina.
Clase de forma Hyphomycetidae.
Orden de forma Moniliales.
Familia de forma Moniliaceae.
Género Beauveria Vuillemin
Especie Beauveria bassiana. (Bals) Vuillemin
27
2.4.2.2 Modo de acción del hongo Beauveria bassiana
Como otros hongos entomopatógenos B. bassiana, no necesitan ser ingerido por el
insecto para realizar su proceso de ataque, sino que lo infectan por contacto y adhesión de
las esporas a las partes de su cuerpo (bucales, membranas intersegmentales o espiráculos,
entre otros), más específicamente el ataque sobre el insecto huésped, se realiza en
diferentes etapas divididas en: adherencia, germinación, penetración, multiplicación del
hongo en el hemocele, producción de toxinas y muerte del insecto, como lo refiere
Jaramillo (2012),
2.4.3 El hongo Metarhizium anisopliae
Ha sufrido cambios de acuerdo a varios estudios que clasifican a las especies de este
género, con base a sus características morfológicas se reconocen dos especies: M.
anisopliae y M. flavovoride. Más recientemente se propuso la existencia de nueve especies:
M. anisopliae, M. guizhouense, M. pingshaense, M. acrium Stat. Nov., M. lepidiotae, M.
majus, M. globosum, M. robertsii y M. brunneum. También los estudios filogenéticos han
permitido reubicar a las especies de Metarhizium al grupo de los Ascomycetes
(Hypocreales; Clavicipitaceae) parásitos de insectos, al considerar, además, el origen e
implicaciones evolutivas como reproducción, hábitat, el uso de hospederos vivos y otros
invertebrados como fuente de alimento (Ojeda et al., 2010, p. 340). El hongo presenta la
habilidad de crecer en forma saprofita, facilidad de diseminación de los conidios, capacidad
de sobrevivencia en el suelo y reproducción asexual, requiere temperatura óptima de 25 a
30 °C y humedad relativa del 100%. Los límites térmicos para la germinación de los
conidios y de las hifas de M. anisopliae se encuentran alrededor de 37 a 40 °C
28
respectivamente. A una humedad por debajo de 53% se reduce la viabilidad de los conidios
(Ojeda et al., 2010, p. 350)
2.4.3.1 Clasificación Taxonómica de Metarhizium anisopliae.
Según (Metschnikoff 1879) y Sorokin 1883, este hongo se clasifica así:
Reino: Fungi
Phyllum: Ascomycota
Clase: Sordariomycetes
Orden: Hypocreales
Género: Metarhizium
Especie: anisopliae
2.4.3.2 Modo de acción de Metarhizium anisopliae.
El hongo produce metabolitos secundarios como destruxinas A, B, C, D, E y una
desmetildestruxina B, los cuales son tóxicos y actúan como micotoxinas. Su toxicidad se da
por la ingestión y a través del integumento y su efecto varía según la especie de insecto
atacado, pudiendo causar parálisis tetánica y flácida in vivo, despolarizando membranas
musculares al activar los canales de calcio; afecta varias organelas celulares (mitocondrias,
retículos endoplasma ticos y membranas nucleares), paraliza células y causa disfunción del
intestino medio, los túbulos de malpigio y los hemocitos (Gutiérrez y Saldarriaga, 2004, p.
152
2.4.4 El hongo Lecanicillium lecanii
Este hongo carece de una fase sexual y se reproduce por medio de esporas asexuales
no móviles llamadas conidios. La germinación de estos conidios produce hifas y después
un crecimiento posterior, estas hifas producen conidióforos que finalmente produce
29
conidios lecanicillium.lecanii puede crecer tanto en materiales vivos como muertos. Puede
crecer en todos medios micológicos convencionales probados hasta ahora, Extracto de
malta, y agares dextrosa de patata, incluyendo un medio que contiene quitina como única
fuente de carbono y nitrógeno. Tiene la capacidad de producir conidios en medios sólidos
(Hall, 1981, p.450).
Infecta a sus invertebrados anfitriones a través de la cutícula externa. Tres fases han
sido reconocidas en el desarrollo de micosis de insectos: adhesión y germinación de las
esporas de hongos en la cutícula del huésped, penetración de la cubierta del insecto por un
tubo germinal, y desarrollo del hongo dentro del cuerpo del insecto, generalmente lo que
resulta en la muerte del huésped infectado. Bajo buena humedad condiciones, el huésped
muerto está cubierto por las esporas de hongos e hifas (Zimmermann, 1984, p.406).
2.4.4.1 Clasificación Taxonómica de Lecanicillium lecanii.
La clasificación taxonómica que sugieren Zare y Gams (2001) es la que se describe
a continuación:
División: Deuteromycetes.
Clase: Hyphomycetes.
Orden: Moniliales.
Familia: Moniliacea.
Género: Lecanicillium
Especie: Lecanicillium lecanii
2.4.4.2 Modo de acción de Lecanicillium lecanii
Silva (2005), indica que este entomopatógenos tiene una distribución cosmopolita y
actualmente se han desarrollado algunas formulaciones comerciales. El proceso infectivo
del hongo se cumple en tres fases: La primera fase de germinación de conidios y
30
penetración de hifas al cuerpo del huésped dura de 3 a 4 días. La segunda fase es la
invasión de los tejidos por parte del micelio del hongo hasta causar la muerte del insecto,
dura de 2 a 3 días. Finalmente sigue la tercera fase, la cual es la esporulación y el inicio de
un nuevo ciclo.
2.5 Aplicación de HE para control de insectos
Alves (1998), nos indica que los hongos microscópicos fueron los primeros
patógenos de insectos en ser empleados como control microbiano. Aproximadamente 80%
de las enfermedades de insectos tienen como agentes etiológicos a los hongos, la ocurrencia
de estos hongos en condiciones naturales, tanto enzoótica como epizóoticamente es un
factor importante en la reducción de las poblaciones de plagas. La mayoría de los hongos
entomopatógenos presentan crecimiento macroscópico sobre la superficie de sus
hospederos, sin embargo, algunas especies no producen crecimiento superficial o producen
muy poco. Su crecimiento y desarrollo están limitados principalmente por las condiciones
ambientales externas, en particular, alta humedad relativa (óptima para germinación, por
encima de 95%) y temperatura (entre 20 y 30º C) adecuada para la esporulación y
germinación de esporas. Las enfermedades causadas por estos hongos son denominadas
“micosis” (Tanada and Kaya 1993, como se citó en Aleán, 2003).
Según Carruthers y Hural (1990); Haraprasad et al. (2001); Chamley y Collins
(2007), los HE, a diferencia de otros agentes entomopatógenos, tienen mecanismos de
invasión únicos. Esto lo reafirma Charnley (1997); Jeffs et al. (1997) y Kershaw y Talbot
(1998), que manifiestan que no necesitan ser ingeridos por el insecto para controlarlo, pues
lo infectan por contacto y adhesión de las esporas a partes de su cuerpo (sean bucales,
31
membranas intersegmentales, espiráculos, entre otros). A respecto, Hajek (1997);
Deshpande (1999); Milner (2000); Asaff et al. (2002) y Barranco Florido et al. (2002),
evidencian que inician su proceso infectivo y asociación patógeno-hospedero mediante la
formación de túbulos germinales y a veces el apresorio (que sirve para el anclaje de la
espora) con los cuales ejerce una presión hacia el interior del insecto facilitando la invasión
del hongo. En síntesis, y según Alean Carreño (2003), el mecanismo de acción se divide en
tres fases: (1) adhesión y germinación de la espora a la cutícula del insecto, (2) penetración
en el hemocele y (3) desarrollo del hongo. Lo cual generalmente resulta en la muerte del
insecto. Esta facilidad de infestación se debe a las características tanto físicas y químicas
que tienen los insectos como lo referencian Hegedus y Khachatourians (1995) y
Khachatourians (1996), que son los carbohidratos presentes en las proteínas cuticulares que
permiten que la germinación mediada por mensajeros se acelere, así como la cubierta
mucilaginosa que contribuye a la hidratación de la espora y que además funciona como
protector ante la presencia de polifenoles tóxicos y enzimas secretadas por el sistema
inmune del insecto. Cabe destacar que, durante la penetración del hongo desde la cutícula
del insecto hasta el haemocele, la hifa queda inmersa en proteínas, quitina, lípidos,
melanina, difenoles y carbohidratos; algunos de ellos son nutrimentos, pero otros pueden
inhibir su crecimiento, ya que, el insecto activa su sistema inmune a través de procesos
como la melanización, fagocitosis, nodulación y encapsulamiento (St. Leger y Roberts,
1997). Sin embargo, los hongos desarrollan una serie de actividades que les permiten evitar
este tipo de defensas, tales como cambios en la pared celular y producción de sustancias
inmunomodulatorias o toxinas fúngicas (Khachatourians, 1991). A partir de la penetración
cuticular, se proliferan dentro del insecto e inician el crecimiento miceliar a través de sus
cuerpos hifales que invaden diversas estructuras como tejidos musculares, cuerpos grasos,
32
tubos de Malpighi, mitocondrias, hemocitos, retículo endoplásmico y membrana nuclear
(Pucheta Diaz et al., 2006).
Finalmente, las hifas penetran la cutícula desde el interior del insecto y emergen a la
superficie iniciando la formación de esporas cuando presenta las condiciones adecuadas
como es la humedad relativa y temperatura (Gillespie y Claydon, 1989).
33
CAPÍTULO 3. ASPECTOS METODOLÓGICOS
3.1 Delimitación del estudio
3.1.1 Localización
El estudio se aplicó en la zona cafetera del Municipio de Manaure, en el
Departamento del Cesar, ubicados según se muestra en la imagen 1.
Fuente: Google Maps y Google Earth. 2017
Este municipio se encuentra localizado en el noreste del departamento, en la
vertiente occidental de la serranía del Perijá a 775 m.s.n.m. cuyas coordenadas geográficas
Imagen 1. Localización geográfica del Municipio de Manaure, Cesar
34
corresponden a 10°23' 21” N y 73° 01'45” W”. Las veredas que se consideran cafeteras son
Manaure, Sincelejo, Santa Fé, El Cielo, La Nueva Estrella y Villa Adelaida1. De esta última
se seleccionaron cuatro fincas cafeteras cuyas características se describen en la siguiente
tabla:
Tabla 1. Algunas características de las fincas objeto de estudio
Finca Superficie Has Altura (M.S.N.M.) Variedades de café cultivadas
La Carmencita 2,5 1300 Castilla, Caturra, Arábigo
La Dorada 1,5 1100 Castilla, Arábigo, Caturra
La Bella 3,0 1100 Colombia, Castilla, Caturra
La Esperanza 3,0 1000 Castilla, Arábigo
Fuente: PBOT de Manaure. 2017
3.2 Línea de investigación.
Este estudio se inscribe en la Línea de Investigación de Bioprospección, del
programa de Ecología de la Facultad de Ciencias Naturales de la Fundación Universitaria
de Popayán.
3.3 Procedimiento
El estudio se desarrolló en dos fases. La primera corresponde a un trabajo de campo
en las fincas mencionadas. Y la segunda al trabajo de análisis de laboratorio en la
Universidad Popular del Cesar. En la primera fase se hicieron las siguientes actividades:
Una vez identificadas las fincas, se tomaron muestras de suelo superficial,
rizoplano y rizosférico. Estas fincas en el momento de la recolección de las
muestras estaban sembradas de café.
1 La razón por la que se eligió esta vereda obedece a la voluntad de los productores cafeteros para permitir
realizar los muestreos, además de la condición de vecindad con el investigador. En las otras fincas se presentó
renuencia y baja disposición la realización de este estudio.
35
Luego, siguiendo las recomendaciones de Lacey, (2012), se seleccionaron cinco
puntos en forma de X en los cultivos. Con ello se tomarían 60 muestras en total.
A continuación se procedió a tomar una submuestra por cada tipo de suelo, en
una cantidad de 100g para un total de 500g de muestra compuesta.
Una vez se homogenizaron las muestras, fueron rotuladas e identificadas y se
almacenaron en bolsas de papel, se depositaron en cajas de icopor y se llevaron al
laboratorio de Microbiología.
Para la segunda fase prácticamente se agotaron dos subfases, una de determinación de
presencia de los hongos y la otra de aislamiento de los mismos. Para los análisis en el
laboratorio, las actividades fueron las siguientes:
Preparación de dilución de conidios estériles.
Preparación de agar en vaso de precipitación a (40°C)
Limpiar la superficie inferior de la lámina y colocarla en una placa Petri. La
placa debe tener un papel de filtro estéril en el fondo, humedecido con agua
destilada estéril. Es recomendable poner la lámina sobre una varilla de vidrio en
forma de V también estéril dentro de la placa.
Sembrar el hongo con un ansa en la porción de la lámina que tiene la película del
medio y estirarla cuidadosamente.
Incubar por dos o tres días.
Observar en cámara de flujo laminar las colonias que se han formado.
Luego se procedió a realizar los montajes para hacer las siembras en los agares a
utilizar para luego incubar y después observar al microscopio. Así mismo se
recolectaron granos brocados en diferentes estados de maduración caídos al suelo
y que puedan tener signos de estar atacados por hongos Entomopatógenos.
En cuanto al aislamiento de los hongos Entomopatógenos, en el laboratorio se
utilizó la técnica de diluciones seriadas para la muestra de suelo rizosférico tomando 11g
como muestra representativa en diluciones base 10 hasta 10 sembradas por duplicado en
agar OGY (Difco y BBL, 2003).
36
Para las muestras de rizoplano y superficie se usó la técnica de Warcup (1950)
citado por Arias y Piñeros (2008) o impronta empleando el mismo medio de cultivo. Se
incubaron las muestras a una temperatura ambiente (28º C aprox.) durante 48-72h
transcurrido el tiempo de incubación se realizaron las observaciones macro y microscópica
cada 24 horas por cinco días. Para facilitar la apreciación y evidenciar el crecimiento de las
colonias, se realizaron repiques en Agar PDA en las mismas condiciones de la siembra
inicial y se identificaran mediante claves taxonómicas, como el protoplasma, los
filamentos, extremos de los filamentos, talos y otros.
Los granos de café fueron lavados con hipoclorito de sodio al 0,5%, disectados,
examinados y los estados de la broca encontrados dentro del mismo se montaron sobre
medios de Agar PDA (Arias & Piñeros, 2008), para observar posible crecimiento de hongos
Entomopatógenos.
3.4 Identificación Macro y Microscópica de los Entomopatógenos
Los hongos aislados se cultivaron en placas de PDA, incubadas a 25ºC por un
periodo de 7 días. Después se realizó la caracterización morfológica por observación
macroscópica y microscópica realizando tinciones con azul de algodón utilizando las claves
taxonómicas de Barnet y Hunter (1972).
3.5 Pruebas de Patogenicidad con hongos Entomopatógenos.
Para la prueba de patogenicidad se utilizaron adultos de broca obtenidas del campo
los cuales fueron desinfectados superficialmente según el método usado por García et al.
(2008) e inoculadas mediante inmersión en las suspensiones de los aislamientos. Para el
testigo se usaron adultos tratados con agua destilada estéril. Los adultos tratados se
37
transfirieron a vasitos plásticos con granos de café para su alimentación (Anexo F). Las
observaciones de mortalidad de adultos se hicieron diariamente durante 12 días. Para
confirmar el agente causante, los insectos muertos se incubaron en placas Petri con papel
absorbente humedecido en agua destilada estéril.
Se usó un diseño completamente al azar, con cinco repeticiones por tratamiento. La
unidad experimental estuvo formada por 10 adultos por repetición para un total de 50
unidades experimentales por tratamiento. El número de adultos muertos se registró
mediante observaciones diarias expresadas como porcentajes de mortalidad en el tiempo.
También se determinó el LT50 que es el tiempo que transcurre desde que se hizo la
aplicación del entomopatógeno hasta que murió el 50% de la población experimental. Los
resultados se sometieron a análisis de varianza y comparación de medias mediante la
prueba LSD, Fisher 5%, usando Statgraphics Plus versión 5,1.
38
CAPITULO 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Ocurrencia de los HE
De acuerdo con los resultados globales promedios del análisis de laboratorio, existe
presencia de Beuveria bassiana en un 42,80%, de Metarrisium anisopliae en un 28,60%,
un 14,23% de Isaria sp y un 14,33% de Trichoderma sp. Estos resultados se asemejan a
los obtenidos por Sosa et. al. (2001) y Sun et al (2008) quienes sostienen que B. bassiana y
M. anisopliae son los hongos entomopatógenos más comúnmente encontrados en el suelo.
Factores como el clima, el tipo de suelo, el sistema agrícola utilizado y los hábitats afectan
la ocurrencia, distribución y diversidad de los HE, como lo evidencia Shin et al (2013). No
obstante, en el estudio no se revisó la relación entre tipos de suelo y presencia de HE. De
acuerdo con cada finca, la presencia de estos hongos se distribuye de la siguiente manera:
Tabla 2. Ocurrencia de cepas de HE en fincas
Finca B. bassiana (%) M. anisopliae Isaria sp Trichoderma sp
La Carmencita 41,4 29,1 15,95 13,55
La Dorada 42,54 29,2 14,46 13,8
La Bella 43,47 28,4 13,33 14,8
La Esperanza 43,8 27,8 13,2 15,2
Fuente: investigación propia
Si se observa la tabla, las fincas están distribuidas en orden descendente, desde la
que se encuentra a mayor altura (La Carmencita a 1300 m.s.n.m.) hasta la más baja (La
Esperanza a 1000 m.s.n.m.) y sigue siendo B. bassiana la que mayor presencia registra con
porcentajes superiores al 40%. Puede destacarse que existe una ligera tendencia a que B.
bassiana y Trichoderma sp aumentan su participación a medida que disminuye la altura
sobre la que se ubican las fincas.
39
4.2 Identificación macroscópica y microscópica de los HE
Las identificaciones que se muestran como resultado del estudio se discriminan de
acuerdo a cada HE.
4.2.1 Beauveria bassiana (Hypocreales: Clavicipitaceae)
Identificación macroscópica: La imagen 2, presenta la identificación macroscópica,
la colonia en PDA a los 14 días es algodonosa a polvorienta, blanca. A medida que va
pasando el tiempo se vuelve amarillento, cremoso. El revés es de color rojizo al centro y
amarillento alrededor, tal como lo evidencian por Cañedo y Ames (2004).
Fuente: investigación propia
Identificación Microscópica: La identificación microscópica (imagen 3) presenta
células conidiógenas (c.cs) agrupadas formando grupos compactos grandes y a veces
solitarias, en forma de botellitas de 3 a 6 x 3 a 5μ. En ciertos casos, las c.cs se ramifican
formando c.cs secundarias. Al final de las c.cs se forma un raquis que sostiene las conidias,
éstas son hialinas, globosas a subglobosas, de 2 a 3 x 2 a 2.3μ que se insertan
sucesivamente en el raquis en forma opuesta. Los resultados están de acuerdo a lo que
establece Alean (2003).
Imagen 2. Identificación macroscópica de B. bassiana
40
Fuente: investigación propia.
4.2.2 Metarhizium anisopliae (Hypocreales: Clavicipitaceae)
Identificación Macroscópica: M. anisopliae, presenta una colonia pegada al
medio, completamente redondeada, de colores oliváceo, amarillento, verdoso, marrón
oscuro, dependiendo del asilamiento, con un revés incoloro a marrón, a veces verdoso
citrino
Fuente: investigación propia
Imagen 3. Identificación microscópica de B. bassiana
Imagen 4. Identificación macroscópica de M. anisopliae
41
Identificación Microscópica: “El conidióforo es ramificado, el conidio inicial es
producido por el conidióforo en una abstricción simple en la parte distal. En cada
conidióforo se forma una cadena de conidios basipetal, las cuales crecen densas y adheridas
unas con otras formando masas prismáticas en columnas” (Tanada y Kaya, 1993 p. 380).
Sosa- Gómez y Alves, (1983), nos indica que los conidios de este género son blancos
cuando son jóvenes, pero conforme maduran el color se torna verde oscuro. Se mencionan
solamente a dos especies, M. anisopliae (Metschnikoff) Sorokin y M. flavoviride Gams y
Rozsypol. Las características de M. flavoviride son que sus conidios son ovoides con las
terminaciones redondeadas o una de ellas ligeramente truncada, colonias de color gris,
amarillo verde de 7-11µm de longitud; para el caso de M. anisopliae sus conidios son de
forma cilíndrica u ovales frecuentemente angosto en la parte media, usualmente truncado
en ambos lados, colonias verdes, M anisopliae tiene dos variedades: M. anisopliae var
anisopliae con conidios de 3.5 – 9.0mm de largo usualmente 5.0 -8.0mm y M. anisopliae
var mayor, cuyos conidios miden 9.0-18.0 mm de largo usualmente entre 10-14mm,)
(Humber 1997).
Fuente: investigación propia
Imagen 5. Identificación microscópica de M. anisopliae
42
4.2.3 Isaria sp
Este HE es uno de los más comunes, sobre todo en zonas de temperatura que oscilan
entre los 20°C y 30°C.
Presenta hifas hialinas a amarillosas, septadas, de paredes delgadas. La mayoría
presenta ramificaciones verticiladas o irregularmente ramificadas. Llevan en su
parte terminal en cada rama grupos de fiálides, las cuales pueden ser también
solitarias. Las fiálides constan de una porción basal cilíndrica o hinchada
adelgazándose abruptamente a menudo para formar un cuello muy notorio. Los
conidióforos llevan cadenas de conidias hialinas, unicelulares y ovoides. (Ek, 2012;
p. 16)
Fuente: investigación propia
Fuente: investigación propia.
Imagen 6. Identificación macroscópica de Isaria sp
Imagen 7. Identificación microscópica de Isaria sp
43
4.2.4 Trichoderma sp (Hypocreales: Hypocreaceae)
Identificación macroscópica: “Las colonias se reconocen fácilmente por su
crecimiento rápido y su coloración, blancas-verdes, amarillo–verdosas; las áreas con
conidias se presentan con anillos concéntricos. El revés de las colonias es usualmente no
coloreado, amarillo, ámbar o amarillo-verde, y muchas especies producen grandes
cantidades de clamidosporas en cultivos sumergido” (Arango et al, 1988 p.127; Barnett y
Hunter, 1972 p.241).
Fuente: investigación propia
Identificación Microscópica: Arango et al, (1988). Nos indica que Los conidióforos
son erectos, hialinos, en su mayoría ramificada, no verticilada, los cuales pueden ser
solitarios o en grupos. Las fiálides son en forma de botella, únicas o en grupos, hinchadas
en la región central pero delgada hacia el ápice; son hialinas y en ángulo recto con respecto
a los conidióforos. Las conidias son unicelulares subglobosas u oblongas, lisas o
equinuladas, hialinas o verdes y ocurren en masas en los ápices de las fiálides.
Imagen 8. Identificación macroscópica de Trichoderma sp
44
Fuente: investigación propia
De acuerdo con el estudio, la población de HE encontrada se describen en la tabla 3.
Tabla 3. Número de individuos encontrados después de aplicar los tratamientos
según DL 50, (2017). Entomopatógenos Tratamiento
/Dosis
N°
Lecturas
Bloques / repeticiones
L ll Lll Total
Beauveria
bassiana
1. (72 X 107 conidias/ml) 0 7 6 4 17
2. (57 X 108 conidias/ml)
0 6 5 4 15
3. (52 X 109 conidias/ml)
0 5 4 4 13
Metarhizium
anisopliae
4. (74 X 107 conidias/ml)
0 7 6 4 17
5. (69 X 108 conidias/ml
0 6 5 4 15
Testigo Absoluto
Sin aplicación 0 10 10 10 30
Fuente: propia del estudio
4.3 Prueba de patogenicidad con B. bassiana y M. anisopliae
El análisis de varianza mostró diferencia significativa (Gl=6) (F = 12,26) (P ≤0)
entre tratamientos, (Anexo F); la prueba de LSD Fisher señala que el Tratamiento T1. (B.
bassiana: 72 x107con/ml) provocó una mortalidad del 57% sobre H. hampei (Anexo G), las
dosis menores de B. bassiana provocaron mayor mortalidad que las dosis menores de M.
anisopliae, no obstante, no hubo diferencias significativas entre ellos.
Imagen 9. Identificación microscópica de Trichoderma sp
45
Suarez y Mejía (2012) en laboratorio encontraron que la concentración 1 x
109con/ml de B. bassiana contra H. hampei causo mortalidad del 70%. al evaluar cepas de
B. bassiana y M. anisopliae a nivel de laboratorio obtuvieron mortalidad entre el 91 y 94%
mientras que en campo redujeron la infestación en arboles entre el 18 y 47% al compararlo
con el testigo.
Tabla 4. Número promedio de adultos de H. Hampei muertos al aplicar B. bassiana y M.
anisopliae en laboratorio.
Tratamientos (N°) Promedios*
(N°)
T1. B. bassiana (72 x107con/ml) 5,666667 a
T2. B. bassiana (57 x 10 8con/ml) 5,00000 ab
T4. M. anisopliae (74 x 107con/ml) 5.00000 ab
T5. M. anisopliae (69 x 108con/ml) 4,66667 ab
T3. B. bassiana (52 x 109con/ml) 4,33333 ab
T6. M. anisopliae (67 x 109con/ml) 4,000000 b
Testigo 0,333333 c
* Promedios de tres repeticiones. ** Promedios seguidos por la misma letra no difieren significativamente
por LSD Fisher al 5%. Fuente: Investigación propia (2017)
“Asimismo, los entomopatógenos Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin y
Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin (Ascomycota: Hypocreales), son hongos
patógenos naturales de la broca, presentes en casi todas las regiones de Colombia donde se
ha dispersado y su uso es recomendado por Cenicafé” (Bustillo, 2004, p.4; Góngora, 2011
p.2).
La gráfica 1., muestra el LT50 de las concentraciones de B. bassiana (72
x107con/ml) y M anisopliae (74 x 10
7con/ml) sobre adultos de H. hampei, el primero lo
alcanzó a los siete días mientras que el segundo a los ocho respectivamente. Suarez (2009)
reportó que el menor tiempo para matar el 50% de una población de S. zeamais, un
46
coleóptero parecido a la broca, fue de seis días por una concentración 1x106 conidias/ml de
B. bassiana, lo cual indica una gran patogenicidad y un buen resultado para este tipo de
estudio.
Gráfica 1. Tiempo letal medio (LT50) B. bassiana (72 x107con/ml) y M. anisopliae
(74 x 107con/ml) en adultos de H. hampei en laboratorio
Fuente: propia del estudio
4.4 Identificación macroscópica y microscópica de hongos contaminantes
En los seis aislamientos de las especies entomopatógenos, se reportó la presencia de
hongos fitopatógenos –HF- como Fusarium sp y géneros considerados contaminantes como
Aspergillus, Mucor y Penicillium. Quizá la principal razón de su presencia estriba en la
abundancia de frutas como naranja, papaya, guayaba y otras que caen al suelo y que son
susceptibles de ataques de este tipo de hongos.
Los resultados muestran que al aislar estos HF la distribución es como sigue:
36,05% de presencia de Fusarium sp, 24,5% de Aspergillus, 12,1% de Mucor y un 28% de
Penicillium. En las fincas según los análisis de las muestras, estos HF se distribuyen de la
siguiente manera:
0 0 0
7
12
17
19 21
0 0 0
5
9
13 15
18
0
5
10
15
20
25
1 2 3 4 5 6 7 8
B. bassiana M. anisopliae
47
Tabla 5. Ocurrencia de hongos fitopatógenos según finca
Finca Fusarium sp Aspergillus Mucor Penicillium
La Carmencita 34,5 23,2 11,5 26,8
La Dorada 36,6 24,1 11,7 27,3
La Bella 36,4 25,1 12,4 28,3
La Esperanza 36,7 25,5 12,7 29,7
Fuente: investigación propia
Tal parece que en tanto menor es la altura de las fincas, mayor presencia de HF se
registra, pues sus porcentajes tienden a aumentar. De acuerdo con estos hallazgos, merece
describirse cada uno de estos hongos que generalmente son los culpables de enfermedades
de los cultivos.
4.4.1 Aspergillus sp (Eurotiales: Trichocomaceae)
Frente a este género de hongos contaminantes, Koneman y Roberts, (1987) afirman
que pertenecen a la familia Trichocomaceae, en el orden Eurotiales de la clase
Eurotiomycetes, del Phylum Ascomycota;. Descubiertos en 1729 por Antonio Micheli, este
género comprende unas doscientas especies con gran cantidad de variedades, tienen una
distribución amplia en la naturaleza y se encuentran en todo el mundo. Parece adaptarse a
un amplio espectro de condiciones ambientales y poseen conidios resistentes a la variación
de la temperatura, lo cual le proporcionan un buen mecanismo para su dispersión (Samson
y Varga, 2007). Microscópicamente el género se caracteriza por cadenas de conidios
pequeños u ovales a esféricas sostenidas en cadenas en las puntas de fiálides radialmente
ubicadas sobre la superficie del ápice dilatado del conidióforo, que se denominan vesículas.
Las especies de Aspergillus dentro de la sección nigris son importantes en procesos
biotecnológicos, así, como en el biodeterioro bajo condiciones de cultivo controladas.
48
Imagen 10. Identificación macro y microscópica de Aspergillus sp
Fuente: propia del estudio
4.4.2 Penicillium sp (Eurotiales: Trichocomaceae)
El género Penicillium se clasifica dentro del filo Ascomycota, representando uno de los
géneros más extensos del reino Fungi con más de 250 especies descritas. Se encuentra
ampliamente distribuido en las diferentes regiones del planeta. Sus especies son
mayoritariamente saprófitas, con una elevada actividad anabólica y catabólica. Los
miembros de este género son capaces de producir una amplia variedad de metabolitos
secundarios beneficiosos y perjudiciales para la especie humana, así como ácidos orgánicos
y enzimas que degradan una amplia variedad de biomoléculas complejas (Samson et al.,
2010.p)
Imagen 11. Identificación macro y microscópica de Penicillium sp
Fuente: investigación propia
49
4.4.3 Mucor sp (Mucorales: Mucoraceae)
Es un Zygomiceto, caracterizado por un crecimiento rápido, que se encuentra
ubicuo en la naturaleza, por lo que es muy común que contamine medios de cultivo en el
laboratorio, y que puede llegar a producir infecciones en seres humanos
inmunocomprometidos o inmunosuprimidos. Las cepas de Mucor spp. no crecen por lo
regular a 37°C, lo que nos habla de que las cepas que atacan al ser humano son termo
tolerantes (Arenas, 2008, p. 247).
Fuente: propia del estudio
4.4.4 Fusarium sp (Hypocreales: Nectriceae)
Los hongos del género Fusarium son ascomicetos filamentosos y cosmopolitas,
tienen un micelio bien desarrollado, septado y conidióforos característicos, aunque algunas
especies tienen un talo unicelular. Son considerados principalmente como hongos de
campo, ya que, causan un sinnúmero de enfermedades en cultivos. Sus daños desencadenan
en el hospedante una serie de afecciones generalmente de carácter irreversible, originando
pérdidas económicas considerables.
Imagen 12. Identificación macro y microscópica de Mucor sp
50
Desde hace años, el control de las enfermedades fúngicas ha dependido, en gran
medida, de los tratamientos con agroquímicos. Sin embargo, su uso representa un severo
riesgo para la salud humana y contribuye al aumento de la contaminación al medioambiente
(Abdel–Monahim et al., 2011. p186)
Imagen 13. Identificación microscópica y macroscópica de Fusarium sp
Fuente: investigación propia
51
CONCLUSIONES
La ocurrencia natural de cepas de hongos Entomopatógenos como Beauveria
bassiana, Metarhizium anisopliae y Trichoderma sp, es notoria en el agroecosistema
cafetero del Municipio de Manaure, Cesar, lo cual es importante para futuros trabajos de
control biológico tendientes a reducir la dependencia en el uso de agroquímicos en los
cultivos de interés agrícola.
El estudio ha permitido conocer los microrganismos nativos aislados y adaptados a
las condiciones edafoclimáticas locales lo cual permitirá incrementar el éxito en futuros
programas de manejo y control biológico con estos microorganismos.
La importancia de este estudio radica en que ha contribuido a indagar sobre la
ocurrencia natural, distribución y ecología de HE, en diferentes tipos de suelo y regiones
geográficas para conocer con una mayor amplitud, la dinámica insecto/patógeno en el
suelo; así podríamos tener, un indicador ideal acerca de posibles agentes biológico que se
puedan identificar, con fines de recomendación y de esta amanera contar con perspectivas
de control en un futuro.
Además, el estudio permite demostrar que es posible la producción in vitro de HE
para establecer mediante liberaciones masivas en campo, estos biológicos para disminuir el
daño económico producido por la broca del café en los cultivos establecidos en las fincas y
conocer la capacidad infectiva y la eficacia de estos hongos en condiciones de campo.
En el año 2012 se dio a conocer que, el hongo Beauveria. bassiana es un patógeno
de cientos de especies de insectos y actualmente se comercializa como un micoinsecticida
amigable con el ambiente. (Xiao et al, 2012).
52
De acuerdo con los datos obtenidos en el laboratorio y los resultados del análisis de
varianza en el desarrollo de esta investigación se encontró un 42,80 %; de cepas de
Beuveria bassiana; mientras que el 28,60% correspondieron a las cepas de Metarrisium
anisopliae, 14,23% para Isaria sp y 14,30% para Trichoderma sp; respectivamente.
De acuerdo con la información proveniente del Análisis de varianza (ANOVA) el
tratamiento.1 Beauveria bassiana en Dosis o población de (72 X 107 conidias/ml), fue el
más eficiente para disminuir la población de los adultos de broca; al reportar la mayor
diferencia significativa entre los 7 tratamientos; seguido por el tratamiento 2 Beauveria
bassiana en dosis o población de 57X 108 conidias/ml; lo cual nos permite concluir que, no
hubo diferencia significativa entre los tratamientos 1 y 2.
Puede concluirse además que, de los HE son el fusarium sp y penicillium los de
mayor presencia porcentual.
53
RECOMENDACIONES
Evaluar las cepas de los entomopatógenos encontrados a nivel de campo, para
conocer así la real eficacia de estos organismos en el control de las plagas que afectan los
cultivos del agroecosistema cafetero.
Como una alternativa promisoria en el control biológico, de patógenos con alta
versatilidad ecológica en condiciones de invernadero a futuro y con fines de
recomendación, podríamos pensar en la combinación de bacterias y hongos antagonistas.
El estudio se centró en fincas de sol una vereda (Villa Adelaida) productora de café,
por lo que se recomienda hacer estudios para el resto de fincas a fin de identificar la
ocurrencia de este tipo de hongos.
Se recomienda promover prácticas de manejo de plagas en los caficultores del
municipio con el fin de dar mayor intensidad al control biológico y disminuir gradualmente
la aplicación de insecticidas químicos clorados u organofosforados.
Enseñar a los caficultores como cultivar o propagar los HE dentro de sus cultivos de
café y otro tipo de producción agrícola.
Así mismo, el ejercicio permite plantear la posibilidad de estudiar la interacción de
los hongos Entomopatógenos con agroquímicos y con productos derivados de otras
especies de origen vegetal y determinar posibles sinergismos.
GLOSARIO
54
Dentro de los conceptos clave de este estudio pueden encontrarse desde aquellos de
tipo biológico hasta aquellos de tipo económico y social. Para ello, se ha acudido a
referentes como Cañedo y Ames (2004) y el Diccionario de la Lengua Española (2014).
Antibiosis: Fenómeno biológico en el que existe una detención o destrucción del
crecimiento microbiano debido a sustancias producidas por otro ser vivo.
Beauveria Bassiana: Hongo ascomiceto mitospórico que crece de forma natural en los
suelos de todo el mundo.
Cafetal: Sitio poblado de cafetos.
Cepas: Población de células de una sola especie descendientes de una única célula.
Conidios: una espora asexual inmóvil formada directamente a partir de una hifa o célula
conidiógena o esporógena
Condiciones edafoclimáticas: se refiere a las características de los suelos dependiendo del
clima.
Entomopatógenos: Se refiere al microorganismo que es capaz de causar una enfermedad al
insecto plaga, conduciéndolo a su muerte después de un corto período de incubación.
Fitopatógenos: son microorganismos que afectan a las plantas en sus hojas, raíces, flores o
frutos
Fusarium sp: es un extenso género de hongos filamentosos ampliamente distribuido en el
suelo y en asociación con plantas. La mayoría de las especies son saprófitas y son unos
miembros relativamente abundantes de la microbiota del suelo
Hongos: Microorganismos cuya nutrición es por ósmosis, se reproducen sexual y
asexualmente y viven como saprófitos, como parásitos o en asociación con otros
organismos formando micorrizas.
55
Isaria sp: que incluye fases asexuales de hongos ascomycetes (Ascomycota ). Las fases
sexuales de estos organismos pertenecen al género Cordyceps y otros géneros relacionados.
Metarhizium anisopliae: es una especie de hongo que ataca a los insectos hasta
eliminarlos
Microbicidas: Sustancias que matan las formas vegetativas, pero no necesariamente las
esporas de un microorganismo (bactericida, fungicida, etc.).
Microbiostáticos: Sustancias que inhiben el crecimiento de microorganismos
(bacteriostáticos, fungistáticos, etc.).
Microorganismo: Organismo vivo que vive en diferentes medios.
Micorrizas: Se refiere a la simbiosis entre un hongo (mycos) y las raíces (rhizos) de una
planta.
Penicillium: es un género de hongos, que se encuentra prácticamente en todo organismo y
superficie, es el género de hongos que más abunda en los suelos, principalmente como
producto de descomposición de frutas.
PIB cafetero: se refiere al Producto Interno Bruto que se obtiene al sumar la producción de
café durante un periodo de tiempo y valorada a precios de mercado.
Plaga: Aparición masiva y repentina de seres vivos de la misma especie que causan graves
daños a poblaciones animales o vegetales, como, respectivamente, la peste bubónica y la
filoxera.
Saprofito: Organismo que vive de materia orgánica muerta o en descomposición.
Teleomorfo: Estado sexual o perfecto de un hongo.
Trichoderma sp: es un hongo que ataca a aquellas plagas fitopatógenas y que, debido a su
eficaz control, capacidad reproductiva, plasticidad ecológica, efecto estimulante sobre los
56
cultivos y recientemente se detectó su acción como inductor de resistencia sistémica en la
planta a diferentes patógenos
57
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71
ANEXOS
72
Anexo A. Agroecosistema cafetero de Manaure, Cesar
Fuente: propia del estudio
73
Anexo B. Árbol de cafeto en plena producción, Manaure, Cesar
Anexo C. Granos de café afectados por H. Hampei
Fuente: investigación propia
74
Anexo D. Análisis de varianza para Patogenicidad de hongos Entomopatógenos.
Fuente
Variación
Grados
Libertad
Suma
Cuadrados
Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
Tratamientos 6 66,5714 11,0952 12,26 0,0001
Residuo 14 12,6667 0,904762
Total Corr. 20 79,2381
Fuente: investigación propia
Anexo E. Aislamientos de HE
Finca
*
Submuestra
(N°)
Aislamientos
( )
Identificación
F1 5 (1) B. bassiana (1) M. anisopliae (1) Trichoderma sp
F2 5 (1) B. bassiana (0) (0)
F3 5 (1) B. bassiana (1) M. anisopliae (0)
F4 5 (0) (0) (0)
Total 20 (3) (2) (1)
*F1 = La Dorada; F2= La Carmencita; F3= La Bella; F4= La Esperanza
Anexo F. Disposición de la broca y grano de cafeto en prueba de Patogenicidad
Fuente: investigación propia
75
Anexo G. Adultos de H. hampei afectado por B. bassiana en laboratorio
Fuente: investigación propia
