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Revista Bioprocesos, Vol.1, No.2, Junio, 2015 1/14

Obtención de un clon estable de una línea celular hibridoma para la producción de un anticuerpo anti-idiotípico Yadira Vicente Ariasa, Julio César Dustet Mendozab aDepartamento de Cultivo celular, ANTYTER. Centro de Inmunología Molecular, Cuba. bFacultad de Ingeniería Química. CUJAE, Cuba. e-mail: jcdm@quimica.cujae.edu.cu

Información del artículo

Recibido 16 de marzo de 2015

Aceptado 21 de abril de 2015

Publicado 30 de junio de 2015 Palabras clave anticuerpo monoclonal cultivo celular selección de clones

Keywords monoclonal antibody cellular culture clone selection

RESUMEN

Uno de los criterios más importantes para la fabricación exitosa de un anticuerpo monoclonal terapéutico es desarrollar una línea celular que mantenga estabilidad de la expresión en un gran número de generaciones. En este trabajo se investigó la estabilidad de una línea celular hibridoma que expresa el anticuerpo monoclonal murino anti-idiotípico usando como criterio que no exista una disminución de la concentración de anticuerpo mayor que un 40%. Los resultados mostraron que la línea celular presenta una inestabilidad gradual y que en 120 días no se pierde completamente la expresión. La reducción de los títulos de anticuerpos correlacionó con la aparición de una población secundaria menos productora (contenido de anticuerpo intracelular), detectada con el análisis por citometría de flujo. A partir de estas células cultivadas en un biorreactor se realizó un clonaje por dilución limitante para la generación y selección de un clon estable y productor. En el proceso de selección se chequeó la homogeneidad de la población celular y el desempeño de los parámetros de crecimiento y producción. El clon 2B9 mostró los mejores resultados en los estudios cinéticos en frascos agitados, alcanzando concentraciones de células vivas superiores a 2,5 x106cél/mL y títulos de AcM de 20 mg/L, siendo superior en 1,7 veces respecto al clon 2G9. Se obtuvieron evidencias de buen desempeño en cuanto a crecimiento y producción en un biorreactor de 30 L.

ABSTRACT

One of the most important criteria for the successful manufacture of a therapeutic monoclonal antibody is to develop a mammalian cell line that maintains the stability of expression in a large number of generations. Therefore in this study, the stability of a hybridoma cell line expressing the murine anti- idiotype monoclonal antibody was investigated. The selected criterion was that antibody concentration must not decrease more than 40%. The results have shown that the cell line exhibits a gradual instability and expression was not completely lost within 120 days. The reduction of antibody titles was correlated with the appearance of a secondary population less producer, detected by a flow cytometry analysis for the content of intracellular antibody. From these cells, cultured in a bioreactor, a cloning was performed by limiting dilution and selection for the generation of a stable producer clone. In the selection process the homogeneity of the cell population and performance of growth parameters and production were checked. The clone 2B9 showed the best results in kinetic studies in shake flasks, reaching living cells concentrations higher than 2.5 x106 cells / mL and mAb titles 20 mg/L, which is 1.7 times higher in comparison to 2G9. Evidence of good performance was obtained in growth and production at 30 L biorreactor.

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INTRODUCCIÓN

Uno de los aspectos más importantes para la obtención exitosa de una proteína terapéutica es lograr que la célula recombinante sea capaz de mantener los niveles de expresión de manera estable [1]. La estabilidad en la expresión tiene especial significado cuando se trata de producciones a gran escala y en sistemas continuos. Para procesos continuos, usualmente de extensa duración (más de un mes), es adicionalmente importante tener en cuenta la variación que la inestabilidad de la línea puede introducir en la producción, independientemente de que las propias condiciones del cultivo pueden incidir en el nivel de expresión de la proteína de interés a obtener [2, 3]. Es por eso que la determinación de la estabilidad de una línea celular que se vaya a utilizar en procesos industriales reviste gran importancia desde los puntos de vistas de la consistencia, la robustez y el impacto sobre los costos del proceso. En función del tipo de biorreactor a emplear o modo de cultivo, una línea será adecuada si produce establemente durante el tiempo que dicho proceso requiere [4].

En este trabajo se empleó un anticuerpo murino usado para la obtención de una vacuna recombinante con resultados muy favorables durante los ensayos clínicos realizados [5].

Los problemas con la estabilidad en la producción de proteínas pueden impactar en la productividad obtenida después de acumular numerosas poblaciones requeridas para la generación del banco de trabajo de células y para la expansión del cultivo hasta la escala de producción industrial [6]. La pérdida en la estabilidad de la producción de la proteína de interés puede comprometer la aprobación del uso clínico del producto desde el punto de vista regulatorio y en el peor de los casos podría resultar en el rechazo de una línea celular particular después de meses de trabajo [7].

Para conocer la estabilidad se ha usado ampliamente la medición de la concentración intracelular de inmunoglobulinas u otras proteínas a través de la citometría de flujo (FACS). [8-11]. En células de hibridomas generalmente se aplican repetidos clonajes periódicos durante la etapa de generación de la línea celular para evitar una posible inestabilidad en la expresión y obtener clones con estabilidad mejorada [12].

Entre los métodos tradicionales de selección de clones se puede encontrar el clonaje por dilución limitante (CDL). Una de sus desventajas es que se requiere mucho tiempo (meses) para finalmente obtener un número de clones con niveles de producción y estabilidad deseados. Entre las ventajas de este método está que no requiere un equipamiento complejo y por lo general este es de bajo costo y sus resultados son muy confiables, por lo que sigue teniendo gran uso en el campo de la ingeniería celular

[13, 14]. En la actualidad con el empleo de la citometría de flujo se aceleran los procesos de selección por CDL y estos pueden tener hasta cinco veces más velocidad de producción específica que cuando se seleccionan por clonaje por dilución limitante [15]. La citometría de flujo ofrece la posibilidad de definir físicamente subpoblaciones separadas [16].

El presente trabajo tiene como objetivo obtener una línea celular estable en la producción del AcM murino que permita la obtención del producto en un proceso reproducible. Para ello se determinaron los parámetros cinéticos y la distribución de poblaciones de la línea celular hibridoma en cultivos por lotes y continuos; se seleccionó un clon productor y estable para la producción del AcM murino. Además se demostró la estabilidad del clon seleccionado y la reproducibilidad de los resultados del proceso de fermentación en biorreactores a escala piloto.

MATERIALES Y MÉTODOS

La línea celular empleada fue un hibridoma murino, obtenido en el CIM para la producción de un anticuerpo monoclonal anti-idiotípico.

El medio de cultivo utilizado fue una mezcla de dos medios libres de suero y de componentes derivados de origen animal.

2.1 Estudio de estabilidad Se partió de un ámpula de células del Banco Celular

Maestro del hibridoma murino. Luego de la descongelación, las células crecieron y se mantuvieron en cultivo semicontinuo en frascos agitados durante 52 pases consecutivos (120 d). Se tomaron muestras para el conteo celular y para la posterior determinación de los parámetros del crecimiento y producción. Además se fijaron células para analizar las muestras por citometría de flujo. La temperatura de incubación para todos los casos fue 37 ºC. Todos los ensayos se realizaron por duplicado.

Para considerar a la cepa en estudio como estable se tomó como criterio el empleado por Lonza Biologics [12, 17], según los cuales el porcentaje de expresión con respecto al inicio no debe de ser inferior a 60 %, durante 40 generaciones, respectivamente.

% 𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸ó𝑛𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟 = 𝑟𝑟𝑟𝑟.𝑚á𝑥𝑥𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟.𝑚á𝑥𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟

× 100 (ec.1)

2.2 Condiciones de cultivo a escala de laboratorio El mantenimiento de las células en el cultivo

semicontinuo, así como en los cultivos por lote se realizó en frascos agitados de 250 mL. En todos los casos la concentración celular de siembra y el ajuste de la concentración células por pase fue 0,3×106 cél/mL. 2.3 Condiciones de cultivo a escala de banco

Para el estudio y caracterización de la estabilidad de la línea celular operando en modo continuo se utilizó

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un biorreactor de tipo tanque agitado (Infors) de 10 L de volumen de trabajo y agitado por propela marina. Está equipado con una unidad de control Infors HT para pH (7 ± 0,5), temperatura (37,0 ± 1,0) ºC y concentración de oxígeno (50% ± 30). La velocidad de agitación fue de 150 min-1 y la de aireación 0,02 vvm.

2.4 Clonaje por dilución limitante y selección de clones

Se realizaron dos experimentos para la obtención del clon estable y productor. Se utilizaron células de la línea hibridoma cultivadas en el biorreactor de 10 L durante 30 d. Se utilizó el método de CDL, realizado en placas de cultivo de 96 pozos.

Experimento 1: Selección de un medio para el clonaje libre de suero. Para elegir la composición del medio de clonaje se realizó un diseño experimental de cribado, factorial 24-1. Los factores y niveles estudiados fueron: glucosa: 30 – 50 mmol/L; insulina: 0,5-1 mg/L; suero: 0 – 1 % y medio metabolizado: 0 – 30 %. La variable respuesta en el experimento fue la eficiencia de clonaje (E) expresada en (%). Los resultados se procesaron utilizando el programa Statgraphics Centurión XV.

𝐸 = 𝑁𝑟 𝑟𝑟𝑝𝑟𝑟 𝑟𝑟𝑟 𝑢𝑟𝑟 𝑟é𝑟𝑢𝑟𝑟𝑁𝑟 𝑟𝑟𝑝𝑟𝑟 𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟 (96)

∙ 100 (ec.2)

Experimento 2: Obtención de un clon estable y productor en medio libre de suero. A partir de células cultivadas en el biorreactor y un medio libre de suero (determinada su composición en el experimento anterior) se procedió a la realización de un clonaje en cuatro placas de cultivo de 96 pozos. Se partió de la línea celular hibridoma, inestable, que tenía 45 d en cultivo y de ellas aproximadamente 30 d de fermentación. Los clones que tuvieron una concentración de anticuerpo mayor que 15µg/mL se expandieron en una placa de 24 pozos por duplicado. En esta placa, cuando los clones alcanzaron una concentración de células superior a 106cél/mL se les realizaron los ensayos de citometría de flujo y ELISA.

Los clones seleccionados por estos dos criterios se continuaron expandiendo en frascos de cultivo para la realización de estudios cinéticos.

2.5 Procesamiento de las muestras La concentración de células y la viabilidad celular se

determinaron por conteo celular utilizando una cámara de Neubauer y aplicando el método de exclusión con el colorante tripán azul.

La determinación de la concentración de anticuerpo se realizó por el método inmunoenzimático ELISA, según se describe en [31].

La determinación del contenido de IgG intracelular se realizó por citometría de flujo empleando un citómetro de flujo FACScan. El procesamiento de los datos se realizó empleando el programa FlowJo, versión 7.2.2. Se requirió de un pre-tratamiento a la muestra con el objetivo de permeabilizar la membrana de las células, obtenidas en las diferentes etapas del cultivo continuo y semicontinuo. En todos los casos la viabilidad celular fue superior al 90%. Para realizar la lectura de las muestras, estas se lavaron con PBS 1X y luego se les añadió un reactivo anti-IgG murino conjugado con un compuesto fluoróforo (FITC). Además en el ensayo se utilizó un control negativo, células que no secretan anticuerpos. Este procedimiento está descrito de forma más detallada [32].

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1 Caracterización de la línea celular 1E10/TA

3.1.1 Determinación de los parámetros cinéticos en cultivo por lote

Los parámetros se muestran en la Tabla 1. Los resultados de Xvmáx, µmáx y td son similares a los obtenidos por Víctores en el 2009, excepto para los valores relacionados con la producción de anticuerpo que son inferiores; esto puede estar relacionado con la variación de la calidad del medio de cultivo y el error que introduce la técnica ELISA.

Tabla 1. Parámetros obtenidos a partir del cultivo por lote en frascos agitados a 37oC, 100 min-1, pH 7,1. La concentración de anticuerpo es al final de la fase exponencial.

Xvmáx

(× 106cél/mL)

µmáx.

(h-1)

c (AcM)

(µg/mL)

qp

(× 10-7μg/cél h)

td

(h)

3,61± 0,28 0,035 ± 0,004 28,50 ± 0,90 2,45± 0,006 19,8 ± 0,8 Leyenda: Xvmáx: Concentración celular máxima. µmáx: Velocidad específica de crecimiento máxima. c(AcM): Concentración de anticuerpo. qp: Velocidad específica de producción. td: Tiempo de duplicación de las células.

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3.1.2 Estabilidad de la expresión del anticuerpo en cultivos semicontinuos. En la Figura 1 se muestran el comportamiento de la concentración de células vivas y la viabilidad celular con

respecto al número de pases en los cultivos semicontinuos.

Figura 1. Comportamiento del crecimiento y la viabilidad celular del cultivo durante el estudio de estabilidad de la línea celular hibridoma a 37oC, 100 min-1, pH 7,1.

Se observa en la Figura 1 que la concentración de la población celular es relativamente constante a lo largo de 52 pases. La población con dos y 52 pases alcanzó una concentración de células vivas máximas de 2,56×106 cél/mL y un tiempo de duplicación que está en el intervalo entre 24 y 32 h. Se aplicó la prueba estadística de Kruskal-Wallis la cual arrojó que no existen diferencias estadísticamente significativas entre las medianas de las concentraciones máximas de células vivas de todos los pases realizados al cultivo con un nivel de confianza del 95,0 %.

En el caso de la viabilidad correspondiente a cada pase se observó que para casi todos los casos es alta, superior a 90%. La sostenibilidad de este parámetro por encima de 80 % la mayor parte del tiempo de las cinéticas es un indicador de que la salud de la población celular no se afectó por el incremento del número de generaciones.

En la Figura 2 se muestra el comportamiento de la velocidad específica de crecimiento durante el estudio de estabilidad de la línea celular hibridoma.

Existe una variación de la μ durante el estudio. Se observa un valor inicial de μ inferior a 0,022 h-1, luego existe un incremento con valores de μ muy similares entre sí con un valor promedio de 0,036 h-1, parecidos a los valores típicos obtenidos para esta línea celular (0,035 ± 0,004 h-1, Tabla 3.1). Se aplicó la prueba estadística de Kruskal-Wallis para conocer si existen diferencias estadísticamente significativas entre las velocidades específicas de crecimiento. Se obtuvo como resultado que no existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medianas de las velocidades específicas máximas de crecimiento con un nivel de confianza del 95,0 %. La mediana de µ es 0,033 h-1.

Figura 2. Comportamiento de la velocidad específica de crecimiento durante el estudio de estabilidad de la línea celular hibridoma a 37oC, 100 min-1, pH 7,1.

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En la Figura 3 se presentan los resultados del comportamiento de la concentración de anticuerpo en el cultivo y de la velocidad específica de producción(qp) con respecto al número de pases realizados.

Figura 3. Comportamiento de la velocidad específica de producción (qp) y la concentración de anticuerpo monoclonal (c(AcM)) durante el estudio a largo término de la línea celular hibridoma a 37oC, 100 min-1, pH 7,1.

Se observa que existe una disminución tanto de la velocidad específica de producción (qp) como de la concentración de anticuerpo durante todo el estudio, presentando una pérdida de expresión de un 74% a los 52 pases respecto al inicio. Para ambas variables ocurre una disminución brusca al inicio del cultivo y se ven mayores diferencias entre los pases 2, 12, y 22. Sin embargo, existe poca variación de ambos parámetros entre los 22 y 52 pases. Por otra parte se tiene que la qp obtenida a los 52 pases es 3,8 veces inferior a la obtenida a los 2 pases del cultivo.

Heller-Harrison y colaboradores (2009) plantean que la inestabilidad gradual es aquella en la que se produce una lenta disminución de la expresión del producto durante los meses de cultivo de la línea celular. Según este criterio y los resultados obtenidos la línea celular hibridoma presenta una inestabilidad gradual. En este caso existe una pérdida de la expresión de producto de un 50% dentro de los primeros 22 pases (50 d en cultivo) y con el trascurso del tiempo continúa disminuyendo; a los 52 pases consecutivos (120 d) no se ha perdido por completo la capacidad de expresión del anticuerpo.

La pérdida de la producción de anticuerpos específicos en hibridomas a menudo se ha atribuido a la aparición de poblaciones no productoras que tienen una ligera ventaja en el crecimiento sobre el resto de la población. Sin embargo, en la mayoría de los casos, las poblaciones no productoras, después de un tiempo, dejan de aumentar y se logra un equilibrio entre las dos poblaciones existentes [20].

Para conocer cómo es el compotamiento de la población en la línea celular se realizó un seguimiento durante el cultivo a largo término (LTC) por FACS; los resultados se muestran en la Figura 4.

En estos histogramas se pueden distinguir dos poblaciones: células no productoras de AcM (NP), células productoras de AcM (PP). Dentro de la PP se encuentran aquellas células con bajo contenido de AcM intracelular (BP) y células de alto contenido de AcM intracelular (AP). Está descrito por Coco-Martin (1991) que para líneas inestables, estos histogramas se caracterizan por presentar heterogeneidad poblacional, lo que representa más de un pico en la distribución poblacional. El pico negro representa el control negativo del experimento.

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Figura 4. Histogramas de la distribución de células en cuanto a su intensidad de fluorescencia (FL1) medidas durante el estudio a largo término en cultivos semicontinuos en frascos agitados.

Al observar los histogramas se aprecia la existencia de una población heterogénea que con el aumento del número de pases experimentó tres cambios importantes: (1) la disminución del tamaño y la intensidad del pico principal, (2) la disminución del tamaño y la intensidad del pico secundario, (3) el pico secundario se hace más heterogéneo. En el caso de las células con dos pases, el 96,72% ± 1,24 es PP; presenta dos picos similares en cuanto a porcentaje de PP, uno que se corresponde con la población AP (a la derecha) debido a mayores valores de intensidad de fluorescencia (FL1-H) al que se llamará pico principal y otro pico que representa la población BP (a la izquierda) con menores valores de intensidad de fluorescencia, el cual se nombrará pico secundario. La intensidad de fluorescencia está relacionada proporcionalmente con la concentración de anticuerpo, esto quiere decir que mayores valores de intensidad media de fluorescencia (IMF) (determinada por la mediana del área bajo la curva) representan mayores valores de concentración de anticuerpo. A los 12 y 42 pases, se observan mayores diferencias entre los

tamaños de los dos picos; a los 42 pases la mayor cantidad de células se encuentra en la subpoblación BP que tiene pequeños valores de IMF.

Luego a los 52 pases solamente el 38,38% ± 3,83 de las células producen anticuerpo, el pico principal es muy pequeño y representa muy poco del total de PP. El tamaño de los picos está determinado por el número de células de esta población. En la Tabla 2 se muestra un resumen de los parámetros obtenidos por el programa de análisis de los datos de la citometría de flujo.

Se aprecia en la Tabla 2 que, ocurre una disminición de la población de células productoras durante los 52 pases de 2,52 veces. Las células con dos pases presentan una subpoblación BP con una IMF de 13,98 ± 3,60, que tiene 4,7 veces menos intensidad de fluorescencia que la subpoblación AP. A los 52 pases existen menores diferencias entre la IMF de las subpoblaciones. Mientras que las relaciones de qp y c(AcM) entre los 2 y 52 pases se comportan de forma similar, existiendo una disminución de 3,8 veces.

Tabla 2. Resumen de parámetros determinados por ELISA y FACS durante el estudio de estabilidad de la línea hibridoma en cultivos semicontinuos.

Muestra %PP IMF PP IMF BP c(AcM) (μg/mL) qp (μg/cél h)

2 pases 96,72±2,14 65,41±0,32 13,98±3,60 25,70±0,04 2,46E-07 12 pases 70,23±0,16 33,19±0,04 9,86±0,11 15,50±0,08 1,62E-07 42 pases 72,45±0,05 23,24±0,05 8,10±0,62 9,30±0,21 9,71E-08 52 pases 38,38±1,47 49,76±1,81 11,57±0,47 6,70±0,52 6,43E-08 2 pases/52 pases 2,52 1,31 1,20 3,83 3,84

Leyenda: %PP: Porcentaje de células productoras en la población. IMF PP: Intensidad media de fluorescencia de la población productora. IMF BP: Intensidad media de fluorescencia de la población bajo productora. c(AcM):Concentración de anticuerpo. qp: Velocidad específica de producción.

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La disminución de la producción por clones inestables como la observada en este estudio se debe a la aparición de una población con un nivel de secreción muy bajo (BP) la que aumenta su proporción en el cultivo a lo largo del tiempo. En la literatura se ha informado la ocurrencia de una o dos subpoblaciones que disminuyen su intensidad de fluorescencia progresivamente [21, 22]. Otros reportan que sin variar sustancialmente los valores de fluorescencia disminuye la proporción de PP/BP a lo largo del tiempo [23]. Esto va unido a un ligero decrecimiento de la intensidad de fluorescencia de ambas subpoblaciones, lo que es indicativo de que las células de mayor capacidad de secreción dentro de la población productora pasan a ser no productoras. La aparición de poblaciones no productoras se atribuye a la pérdida de cromosomas, mutación, o reordenamiento de genes asociados con la síntesis y regulación de la proteina de interés [24].

3.1.3 Determinación de parámetros cinéticos y la distribución de poblaciones en cultivos continuos

El modo de cultivo continuo permite establecer estados estacionarios y es una herramienta muy poderosa para la caracterización celular. No obstante, la concentración celular que se alcanza no es mucho mayor que 2×106 cél/mL, por lo que es de esperar que en este modo de operación la productividad sea baja.

Se estudió qué le ocurre a las células que están dentro del biorreactor en cultivo continuo en diferentes estados estacionarios. Además se utilizó la citometría de flujo para comprender el comportamiento de la población celular así como su distribución respecto a la intensidad media de fluorescencia. La Figura 5 ofrece una visión general del comportamiento del cultivo para una corrida realizada en modo de operación continuo. En esta figura se representan las curva de concentración de células y de la viabilidad.

Figura 5. Comportamiento de la concentración de células vivas y la viabilidad celular durante el cultivo continuo de la línea 1E10/TA en el biorreactor de 10 L. Las velocidades de dilución en d-1 se indican en el gráfico, y los cambios en la dilución se marcan con líneas discontinuas.

Se observa que el cultivo continuo comienza a partir de los 5 d y que la concentración de células viables alcanzó valores entre 1,5 - 2,5 × 106cél/mL. Se lograron diferentes estados estacionarios, a las velocidades de dilución de 0,25, 0,5, 0,6 y 0,7 d-1. Estos estados estacionarios se definieron a partir de

comprobar que la desviación estándar de Xv fuese menor que su promedio, al menos en un orden de magnitud. Durante todo el cultivo se obtienen valores de viabilidad celular por encima de 85%. El comportamiento de la concentración de anticuerpo se puede apreciar en la Figura 6.

Figura 6. Comportamiento de la concentración de anticuerpo monoclonal durante el cultivo continuo de la línea 1E10/TA en el biorreactor de 10 L. Las velocidades de dilución en d-1 se indica en el gráfico, y los cambios en la dilución se marcan con líneas discontinuas.

0

10

20

30

40

50

60

0 5 10 15 20 25 30

c(A

cM) (

ug/m

L)

Tiempo (días)

Cultivo por lote Cultivo continuo

0,70,25 0,5 0,6

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Se aprecia que al inicio del cultivo continuo continúa aumentando la concentración de anticuerpo hasta los 9 d donde alcanza su valor máximo (54,71 µg/mL) con una velocidad de dilución de 0,25 d-1. Luego comienza a disminuir. A partir de los 20 d de fermentación se

estabilizan los valores de concentración de anticuerpo alrededor de 5 µg/mL. Las flechas en azul en la Figura 6 indican los días que se tomó muestras para fijar células para analizar por citometría de flujo; los resultados se muestran en la Figura 7 y en la Tabla 3.

Tabla 3. Parámetros de la población intracelular de las células durante una fermentación medidos por la técnica de citometría de flujo y concentracion de AcM determinado por ELISA.

Muestra %PP IMF c(AcM) (µg/mL) Células para inóculo 91,80±0,26 56,09±0,20 35,16 Células del fermentador día 1 75,99±7,50 30,73±4,12 4,01 Células del fermentador día 15 50,00±1,11 17,72±0,12 21,97 Células del fermentador día 20 43,90±0,56 15,41±0,32 4,36

Leyenda: %PP: Porcentaje de células productoras en la población. IMF: Intensidad media de fluorescencia. c(AcM):Concentración de anticuerpo.

Los resultados de citometría describen el fenómeno observado en el fermentador en cuanto a la concentración de anticuerpo. Las células con que se realizó el inóculo, tienen una concentración de anticuerpo de 35 µg/mL. Con un día en el biorreactor es lógico que el valor de concentración de anticuerpo sea pequeño porque existe pequeña cantidad de células vivas; mientras, el porcentaje de PP es de 75,99 ± 7,50; esto reafirma la capacidad que tienen las células con ese tiempo en cultivo se continuar

sintetizando anticuerpo. Luego al final de la corrida (20 d), el valor de concentración de anticuerpo es de 4,36 µg/mL donde solamente el 43,90% ± 0,56 de la población es productora de anticuerpo y la IMF es 3,6 veces inferior a la que presentan las células del inóculo. Estos resultados confirman los obtenidos por otros autores [25], que plantean que la disminución de la producción de anticuerpo está directamente relacionada con el bajo contenido de anticuerpo intracelular.

Figura 7. Histogramas de la distribución de células de 1E10/TA con respecto a la intensidad de fluorescencia (FL1) medidas en diferentes tiempos del cultivo continuo en el biorreactor de 10 L.

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En los histogramas se pudo observar que la distribución de las poblaciones en cultivo continuo coincide con los resultados obtenidos en los estudios semicontinuo: la existencia de una población heterogérnea donde con el transcurso del tiempo en cultivo disminuye la PP. Las células utilizadas para inocular el fermentador tienen 6 pases; presentan una población bimodal en la cual el 91,80% ± 0,26 representa PP. El hecho de que las células tengan un día de residencia en el biorreactor hace que cambie el perfil y se observa en la Figura 7 que disminuye la intensidad de fluorescescia y aumenta la proporción de células en el pico secundario. A los 15 d de cultivo en el biorreactor cuando la velocidad de dilución es 0,6 d-1, la PP es aproximadamente la mitad respecto al valor de las células utilizadas para el inóculo y se observa una mayor heterogeneidad. A los 20 d de cultivo en el biorreactor donde la velocidad de dilución es 0,7 d-1 el perfil es muy similar al anterior, lo cual corrobora lo observado en la Figura 6 de la tendencia a estabilizar la concentración de anticuerpo durante el tiempo. La disminución de la producción en clones inestables como el 1E10/TA se debe a la aparición de poblaciones con un nivel de secreción muy bajo (NP),

las que aumentan su proporción en el cultivo a lo largo del tiempo.

La producción a gran escala de anticuerpo a partir del cultivo de células de hibridomas se realiza en modo continuo. Debido a los altos tiempos en cultivos de estos sistemas existe una gran probabilidad de modificaciones de las células. Estas variaciones dependen de condiciones ambientales, tales como el pH, temperatura, oxígeno disuelto (DO), o limitación de nutrientes, que pueden dar lugar a células con diferentes características fenotípicas. Las características pueden influir en la formación del anticuerpo, así como en la formación de variantes idiotípicas o la producción incompleta de las cadenas pesada o ligera [26].

3.2 Obtención de clones productores y estables

3.2.1 Clonaje a partir de células en el biorreactor y selección de clones

Para la formulación del medio se utilizó un diseño de experimentos 24-1 cuyas características se describen en Materiales y métodos. En la Figura 8 se pueden observar los efectos de los suplementos utilizados y sus combinaciones.

Figura 8. Diagrama de Pareto de los efectos individuales y sus interacciones sobre la variable respuesta Eficiencia de clonaje (E).

Se observa que la glucosa, el medio metabolizado, el suero y algunas de las interacciones tienen efectos significativos. En el caso de las interacciones existe una que incluye la insulina, aunque es la que menor efecto tiene y no resulta significativa en el diseño. Además en la figura se diferencian cuáles factores tienen efectos positivos y negativos para lograr mayor E. La glucosa y el medio metabolizado son los factores que más influyen en la eficiencia de clonaje. El estadístico de Durbin-Watson igual a 2,80 (valor-P = 0,86 > 0,05) prueba la aleatoriedad de los residuos con un 95,0% de nivel de confianza. La Tabla 4 muestra la combinación de los niveles de los factores, que maximiza E para un valor de 15,75%.

Tabla 4. Resultados de la optimización de la Eficiencia de clonaje.

Factor Bajo Alto Óptimo Suero 0,0 1,0 0,0 MM 0,0 30,0 30,0 Glucosa 30,0 50,0 50,0 Insulina 0,5 1,0 0,5

A partir del análisis del diseño experimental aplicado se concluye que es posible emplear un medio fortificado libre de suero para la selección de clones mediante clonaje por dilución limitante basado en: la utilización de glucosa, medio metabolizado, e insulina como componentes.

Diagrama de Pareto Estandarizada para E

0 20 40 60 80Efecto estandarizado

D:InsulinaAD+BCA:SueroAB+CDAC+BD

B:MMC:Glucosa +

-

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Estos resultados pueden ser comparados con los alcanzados por Dhulipala (2011), el cual en trabajos similares de selección de medios libres de suero obtuvo valores similares de eficiencia de clonaje para la línea CHO productora de eritropoyetina humana recombinante.

Es importante señalar que tradicionalmente estos procesos de clonajes se realizan en medios suplementados con suero y, luego del proceso de selección la línea se adapta a medio libre de suero, lo cual es una desventaja en el desarrollo de la línea. Por lo general, durante la adaptación ocurre una

disminución de la productividad. Por otra parte, los requisitos regulatorios cada vez más exigentes, debido a los riesgos del trabajo con sueros, aconsejan la utilización de medio libres de proteínas [14].

A partir de los resultados anteriores, se tomó la mejor condición del diseño experimental (P2) y se realizó una segunda etapa de clonaje utilizando células cultivadas en el biorreactor.

A continuación se muestra en la Figura 9 los resultados del clonaje en medio libre de suero realizado en cuatro placas de cultivo de 96 pozos.

Figura 9. Eficiencia de clonaje obtenida en la segunda etapa de clonaje por dilución limitante utilizando un medio fortificado libre de suero.

Se observa que la placa en la que se obtuvo mayor eficiencia de clonaje fue la dos (10,41 %). Estos valores son inferiores a los esperados según los resultados del experimento anterior. Los resultados obtenidos son comparables con los informados en la literatura para CDL en medios libres de suero los que se encuentran entre 5 y 35 % de eficiencia de clonaje [14].

El primer criterio para reducir el número de candidatos fue el resultado de la concentración de

anticuerpo a partir del sobrenadante de la placa de 96 pozos. De los 26 clones seleccionados se desecharon aquellos con una concentración inferior a 10 µg/mL (3 clones).

El segundo criterio fue la medición por FACS del contenido de IgG intracelular a los 23 clones seleccionados. En la Figura 10 se muestran los resultados.

Figura 10. Porcentaje de población productora (PP) de los clones obtenidos en la segunda ronda de clonaje a partir de células cultivadas en el biorreactor.

Como se observa, los clones que presentan un valor de población productora (PP) superior a 50% son 2B9, 2G9, 4C6. A pesar de que los clones 1E9, 1G12 y 4C5 tienen menores valores de PP se les continuó realizando análisis para tener más elementos al decidir

desecharlos. A través de la distribución de poblaciones por citometría de flujo se evaluó su grado de homogeneidad. Los resultados se muestran en la Figura 11.

,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

P1 P2 P3 P4

Efic

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)

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Figura 11. Distribución de la población relativa al contenido intracelular de anticuerpo monoclonal mostrado en forma de histogramas de los clones seleccionados.

El clon 2G9 presenta una población bimodal, por lo cual es de sospechar una posible inestabilidad relacionada con el aumento de la subpoblación no productora con el tiempo y las condiciones de cultivo. Pero si no existe un incremento en la proporción de esta subpoblación no productora, no se afectaría la productividad total del cultivo, ya que tiene bajos valores de intensidades de fluorescencia (FL1) por lo que su influencia en la velocidad específica de producción sería despreciable [27].

Como criterio de selección para reducir el número de clones a ser evaluados en frascos agitados se tomó la concentración máxima de anticuerpo acumulada durante 7 d y el porcentaje de población productora (PP) en placas de 24 pozos. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5. Parámetros de los clones obtenidos en placas de 24 pozos cultivados a 37 0C.

Clon c(AcM) (µg/mL) PP (%) 4C6 5,40 ± 1,19 54,32 ±0,24 2B9 25,70 ± 0,58 87,98 ±0,67 1E9 8,25 ± 0,94 47,87 ±1,48 2G9 18,13 ± 1,39 72,51 ±1,32 1G12 6,68 ± 0,49 37,71 ±0,56

Leyenda: c(AcM):Concentración de anticuerpo. PP (%): Porcentaje de células productoras en la población.

Los resultados de concentración de anticuerpo son similares a los obtenidos por citometría de flujo en cuanto a porcentaje de PP. Los clones 2B9 y 2G9 resultan tener mayor concentración de anticuerpo con valores de 25 µg/mL y 18 µg/mL respectivamente, mientras que los porcentajes de PP para dichos clones resultan ser los mayores valores, pero no los esperados (> 95%).

3.3 Desempeño del clon seleccionado en biorreactores de tanque agitado

Dado que los resultados obtenidos a escala de laboratorio en frascos agitados fueron satisfactorios, es importante para la elección de un clon particular su evaluación bajo condiciones lo más cercanas posible a las del proceso de producción, por lo que se procedió a cultivar este clon de células en biorreactores agitados de 30L. Se inició la operación con un cultivo por lote, una vez alcanzada la concentración celular de 3-4 × 106 cél/mL se inició el cultivo continuo con retención a partir de los 4 d con una velocidad de dilución de 0,25 d-1, alcanzándose concentraciones máximas de células vivas alrededor de 6×106 cél/mL. Luego a los 11 d se pasó a operar en cultivo continuo sin retención hasta el final de la fermentación. La Figura 12 ofrece una visión general del comportamiento del cultivo en cuanto a crecimiento y viabilidad en las dos corridas realizadas a escala piloto.

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Figura 12. Perfiles de concentración de células vivas y viabilidad celular del clon 2B9 obtenida en dos corridas de fermentación realizadas a escala piloto.

En el cultivo por lote se alcanza una concentración de células vivas de 3,4 ×106 cél/mL, luego en la perfusión se alcanzan valores de 6 ×106 cél/mL y en el cultivo continuo un valor promedio de 2,5 ×106 cél/mL.

La viabilidad se encuentra por encima de 80% hasta los 15 d.

En la Figura 13 se muestran los resultados de qp para el clon 2B9 en dos corridas de fermentación en el biorreactor de 41 L.

Figura 13. Comportamiento de la velocidad específica de producción (qp) del clon 2B9 en un biorreactor de 41 L. Las líneas discontinuas verticales rojas delimitan las etapas de cultivo: I Cultivo por lote, II Cultivo continuo con perfusión y III Cultivo continuo.

La figura anterior muestra que no existe una tendencia sostenida en la velocidad específica de producción durante las tres etapas de cultivo, por lo que no se manifiesta ningún fenómeno de inestabilidad. Este resultado es positivo y como informó Legman [30] es posible re-seleccionar líneas celulares, en este caso a partir de una línea celular inestable, sin que el nuevo clon muestre cambios fenotípicos durante el cultivo celular.

CONCLUSIONES

1. La concentración de células vivas, la velocidad específica de crecimiento y la viabilidad celular no se afectan por la inestabilidad a la secreción de anticuerpos por el hibridoma murino.

2. La línea celular hibridoma mostró una inestabilidad gradual en la secreción de anticuerpo monoclonal en cultivos semicontinuos y continuos. Esta inestabilidad es debido a la aparición de subpoblaciones no productoras que aumentan su proporción a 2,5 veces en un tiempo de 120 d. 3. Durante 52 pases del cultivo semicontinuo se pierde un 74% de la expresión de anticuerpo respecto al inicio. 4. Fue posible obtener clones en un medio fortificado, sin suero, con una eficiencia de clonaje de 10,41%. 5. Fueron seleccionados dos clones que tienen similar comportamiento en cuanto a crecimiento celular.

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6. Los dos clones caracterizados a escala de laboratorio muestran una producción estable de anticuerpo durante 120 d. 7. Se obtuvo buen desempeño del clon 2B9 a escala piloto lográndose una concentración celular máxima igual a 6 ×106 cél/mL, una productividad específica de 9,88 ×10-8 µg/cél h con una distribución homogénea de la población celular.

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