OBTENCIÓN DE HIDROGELES DE QUITOSANO A PARTIR DEL ...
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OBTENCIÓN DE HIDROGELES DE QUITOSANO A PARTIR DEL MICELIO DE Aspergillus níger Y SU ESTUDIO EN LA LIBERACIÓN CONTROLADA DE CEFALEXINA ELKIN LIBARDO ROMERO PEÑALOZA, 1988 UNIVERSIDAD DEL VALLE FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS PROGRAMA ACADEMICO DE QUIMICA SANTIAGO DE CALI 2011
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OBTENCIÓN DE HIDROGELES DE QUITOSANO A PARTIR DEL MICELIO DE
Aspergillus níger Y SU ESTUDIO EN LA LIBERACIÓN CONTROLADA DE
CEFALEXINA
ELKIN LIBARDO ROMERO PEÑALOZA, 1988
UNIVERSIDAD DEL VALLE
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS
PROGRAMA ACADEMICO DE QUIMICA
SANTIAGO DE CALI
2011
OBTENCIÓN DE HIDROGELES DE QUITOSANO A PARTIR DEL MICELIO DE
Aspergillus níger Y SU ESTUDIO EN LA LIBERACIÓN CONTROLADA DE
CEFALEXINA
ELKIN LIBARDO ROMERO PEÑALOZA
Proyecto de Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar
al título de Químico.
Director:
Héctor Fabio Zuluaga Corrales., Dr. Sci.
Codirector:
Gustavo Adolfo Muñoz Ruiz., Químico
UNIVERSIDAD DEL VALLE
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS
PROGRAMA ACADEMICO DE QUIMICA
SANTIAGO DE CALI
2011
UNIVERSIDAD DEL VALLE
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS
PROGRAMA ACADEMICO DE QUIMICA
SANTIAGO DE CALI
2011
ELKIN LIBARDO ROMERO PEÑALOZA
OBTENCIÓN DE HIDROGELES DE QUITOSANO A PARTIR DEL MICELIO DE
Aspergillus níger Y SU ESTUDIO EN LA LIBERACIÓN CONTROLADA DE
CEFALEXINA
Temas:
Quitina y Quitosano
Hidrogeles
Liberación Controlada
I
DEDICATORIA
A mis Padres y Hermanos
Que desde el comienzo me apoyaron
A la memoria de Juan Carlos Sánchez,
uno de los pocos familiares con los que pude compartir
A personas que ya no están en este mundo y no pude conocer en
Mi tour “Conociendo la Ascendencia 2010”
Con el esfuerzo que hacían mis padres, Gane diplomas en un plantel educativo
YO fui bien criado no deambulante, Les agradezco como buen hijo el servicio
Diomedes Díaz
II
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a Dios por darme la vida.
A Brígida Medina Orozco por salvarme la vida cuando ya los especialistas
no daban nada por mí.
A Francia Elena Peñaloza Quiroz, Libardo Romero Medina, Edwin y Erwin
Romero Peñaloza por el apoyo y esfuerzo que han realizado para sacarme
adelante.
Al Profesor Héctor Fabio Zuluaga Corrales por sus contribuciones en mi
formación académica y por haberme brindado la oportunidad de hacer parte
de su grupo de investigación y asesorías durante mi carrera aunque al
principio empezamos con el pie izquierdo.
A Alba Lucia Montoya Arias por su apoyo y por convencerme de no
retirarme de esta carrera, cuando pensaba que no podía y quería estudiar
Licenciatura en Historia.
A los profesores del departamento de Química, en especial a Junior
Sandoval y Germania Micolta por sus contribuciones en mi formación
académica.
A mis amigos Edward Ramírez, Paola Benítez, María Fernanda Aguilar,
Johan Zuñiga, Mauricio Cerón y Juan José Espejo por todos los momentos
compartidos desde las inducciones hasta ahora que estoy culminando una
etapa importante en mi vida.
A mis compañeros de carrera Daissy Gómez, Gilberto Zapata, John Gil,
Fabián Navarro por todos los gratos momentos compartidos durante las
clase y haberme colaborado en algún informe de laboratorio
III
A mis compañeros del grupo SIMERQO Fawzy Aly, David Quintero y
Gustavo Muñoz por haberme enseñado todo lo relacionado con las
técnicas empleadas en este trabajo y los momentos de recocha durante el
tiempo de investigación.
A los compañeros del cuarto piso (Victoria Imbachi, Karen Herrera,
Alejandro Guerrero, Diana Soto, Annie Arguello) por haber contribuido en el
desarrollo y culminación de este trabajo.
A los trabajadores de la universidad del valle en especial Mario Velasco,
Luis Hurtado y Carlos por haber contribuido en el desarrollo de este trabajo.
IV
V
ABREVIATURAS Y ACRONIMOS
ºC Grado Celsius
%DD Grado de deacetilación
%p/v Porcentaje peso – volumen
%v/v Porcentaje volumen-volumen
Constante alfa para el solvente de Mark-Houwink
Viscosidad
] Viscosidad intrínseca
sp Viscosidad especifica
Concentración en masa del polímero
cm Centímetro
cm-1 Centímetro a la menos uno
cm4/s2 Centímetro a la cuarta por segundo cuadrado
Cx Concentración
d Espesor del hidrogel
DSC Differential Scanning Calorimetry
FTIR Fourier Transform Infrared Spectroscopy
g Gramo
g/mL Gramo por mililitro
VI
g/mol Gramo por mol
h Hora
K Constante de velocidad de hinchamiento
k Constante de velocidad de liberación
K’ Constante de Mark-Houwink para el solvente
M Molaridad
mg Miligramo
min Minuto
min-1 Minuto a la menos uno
mL Mililitro
mL/g Mililitro por gramo
mm Milímetro
nm Nanómetro
ppm Partes por millón
r Coeficiente de correlación
RMN – H1 Resonancia magnética nuclear protónica
s Segundo
t Tiempo
Tg Temperatura de transición vítrea
VII
W∞ Grado de hinchamiento en el equilibrio termodinámico
Wt/Wα Fracción de fármaco liberado a determinado tiempo
VIII
INDICE DE ESQUEMAS
Esquema 1. Estructura química de la quitina.
Esquema 3. Estructura química del quitosano.
Esquema 3. Estructura química de la cefalexina.
Esquema 4. Diagrama de Bloques para la extracción de quitosano.
Esquema 5. Complejo quitino-glucano.
Esquema 6. Hidrólisis del complejo quitino-glucano.
Esquema 7. Deacetilación de la quitina.
Esquema 8. Adición nucleofílica del grupo hidroxilo.
Esquema 9. Eliminación del grupo amino.
Esquema 10. Equilibrio acido – base entre el acido carboxilico y la amina.
Esquema 11. Recuperación del quitosano mediante cambios en el pH de la
solución.
Esquema 12. Síntesis de los hidrogeles.
Esquema 13. Ataque Nucleofílico al dialdehido.
Esquema 14. Formación del hemianimal.
Esquema 15. Deshidratación del Hemianimal.
Esquema 16. Estructura general del hidrogel.
IX
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructura de la pared celular de algunos hongos.
Figura 2. Cambio en la estructura de los hidrogeles.
Figura 3. Perfiles de las curvas de pH de hidrogeles sensibles al pH.
Figura 4. Sistema de liberación a partir de un hidrogel.
Figura 5. Estructura de los tipos de hidrogeles entrecruzados covalentemente.
Figura 6. Espectro Infrarrojo de quitosano (pastilla KBr).
Figura 7. Espectro de resonancia magnética nuclear protónica del quitosano en
HCOOH/DMSOd6 a 80 ºC.
Figura 8. Espectro Infrarrojo de los hidrogeles obtenidos.
Figura 9. Termograma de calorimetría de barrido diferencial para el hidrogel al
20%.
X
INDICE DE GRAFICAS
Gráfica 1. Viscosidad reducida en función de la concentración de las soluciones.
Gráfica 2. Variación del pH en función del volumen de NaOH 0.1 M.
Gráfica 3. Primera derivada del pH versus la primera derivada del volumen.
Gráfica 4. Grado de hinchamiento en función del tiempo a temperatura ambiente
para el hidrogel al 10% a diferente pH.
Gráfica 5. Contenido de agua en función del tiempo a temperatura ambiente para
el hidrogel al 10% a diferente pH.
Gráfica 6. Grado de hinchamiento en función del tiempo a temperatura ambiente
para el hidrogel al 20% a diferente pH.
Gráfica 7. Contenido de agua en función del tiempo a temperatura ambiente para
el hidrogel al 20% a diferente pH.
Gráfica 8. Variación del hinchamiento en función del pH a temperatura ambiente,
para los hidrogeles obtenidos.
Gráfica 9. Cinética de hinchamiento de primer orden para el hidrogel al 10%.
Gráfica 10. Cinética de hinchamiento de primer orden para el hidrogel al 20%.
Gráfica 11. Cinética de hinchamiento de segundo orden para el hidrogel al 10%.
Gráfica 12. Cinética de hinchamiento de segundo orden para el hidrogel al 20%.
Gráfica 13. Curva de calibración.
XI
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Polímeros Naturales y Monómeros sintéticos más utilizados en la
obtención de hidrogeles.
Tabla 2. Grupos Sensibles a cambios de pH.
Tabla 3. Reactivos Empleados durante todo el proyecto.
Tabla 4. Proporciones utilizadas para la obtención de los hidrogeles.
Tabla 5. Constantes durante el proceso de optimización.
Tabla 6. Resultados del diseño experimental empleado.
Tabla 7. Porcentaje de Rendimiento en la extracción para ambos ácidos.
Tabla 8. Resultados del análisis elemental del quitosano extraído.
Tabla 9. Resultados obtenidos de y sp / B para cada solución.
Tabla 10. Resultados de la regresión lineal de la grafica 1.
Tabla 11. Resultados de la valoración potenciométrica para el quitosano.
Tabla 12. Características de los hidrogeles obtenidos.
Tabla 13. Resultados de la regresión lineal de la grafica 12.
Tabla 14. Resultados de la regresión lineal de la grafica 13.
Tabla 15. Constante de velocidad para los hidrogeles.
Tabla 16. Resultados de la regresión lineal de la grafica 14.
Tabla 17. Cantidad de Fármaco absorbido por hidrogel.
Tabla 18. Resultados de la regresión lineal de la grafica 15.
XII
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN
1. INTRODUCCIÓN 1
2. OBJETIVOS 2
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 3
4. MARCO TEÓRICO Y ANTECEDENTES 4
4.1. POLÍMEROS NATURALES 4
4.1.1. Quitina 4
4.1.2. Quitosano 5
4.1.2.1. Obtencion de quitosano a partir de hongos 6
4.1.2.2. Aplicaciones del quitosano 7
4.2. HIDROGELES 8
4.2.1. Definición 8
4.2.2. Características 10
4.2.2.1. Equilibrio de hinchamiento y transición de fase 10
4.2.2.2. Sensibilidad al medio 10
4.2.2.2.1. Sensibilidad al pH 11
4.2.2.2.2. Sensibilidad a la temperatura 12
4.2.2.2.3. Sensibilidad a otros estímulos 13
4.2.3. Aplicación de los Hidrogeles 13
4.3. HIDROGELES DE QUITOSANO 14
4.4. CARACTERÍSTICAS DE LA CEFALEXINA 15
XIII
5. METODOLOGIA Y PARTE EXPERIMENTAL 17
5.1. OBTENCIÓN DE QUITOSANO 17
5.1.1. Optimización de las Condiciones de Extracción 17
5.1.2. Extracción y Deacetilación de la quitina 18
5.1.3. Solubilización del Quitosano y Re-precipitación 18
5.1.4. Purificación del Quitosano 19
5.2. CARACTERIZACIÓN DEL QUITOSANO 19
5.2.1. Identificación del Polímero 19
5.2.2. Peso Molecular Promedio 19
5.2.3. Grado de Deacetilación 20
5.3. SÍNTESIS HIDROGELES 20
5.4. CARACTERIZACIÓN DE LOS HIDROGELES 21
5.4.1. Espectroscopia Infrarroja 21
5.4.2. Análisis Térmico 21
5.5. CINÉTICA DE HINCHAMEINTO DE LOS HIDROGELES 21
5.6. ESTUDIOS DE LIBERACIÓN IN VITRO 22
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 23
6.1. OBTENCION DE QUITOSANO 23
6.1.1. Optimización 23
6.1.2. Extracción de la quitina 25
6.1.3. Deacetilación de la quitina 26
6.1.4. Solubilización y precipitación de Quitosano 27
6.1.5. Purificación del Quitosano 28
6.2. CARACTERIZACION DEL QUITOSANO 29
6.2.1. Identificación de quitosano 29
6.2.1.1. Espectroscopia Infrarroja 29
6.2.1.2. Resonancia magnética nuclear protónica 30
XIV
6.2.1.3. Análisis Elemental 30
6.2.2. Peso Molecular promedio del quitosano 31
6.2.3. Grado de deacetilación del quitosano 33
6.3. OBTENCIÓN DE LOS HIDROGELES 35
6.4. CARACTERIZACION HIDROGELES 37
6.4.1. Espectroscopia Infrarroja 38
6.4.2. Calorimetría de Barrido Diferencial 38
6.5. CINETICA DE HINCHAMIENTO 39
6.6. ESTUDIOS DE LIBERACION IN VITRO 47
6.6.1. Modelo Matemático 47
6.6.2. Liberación de Cefalexina monohidratada 48
7. CONCLUSIONES 52
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 53
RESUMEN
Se llevó a cabo la extracción y deacetilación de la quitina presente en el micelio
del hongo Aspergillus Níger resultante de la producción de ácido cítrico de la
empresa Sucromiles S.A. Se utilizó un diseño experimental para establecer las
mejores condiciones de extracción obteniendo un porcentaje de rendimiento de
4.25%; el polímero se identificó mediante técnicas espectroscópicas presentando
un peso molecular promedio viscoso (Mv), grado de deacetilación y porcentaje de
nitrógeno de 1.15x105g/mol, 76.33%, 4,26% respectivamente.
Una vez obtenido el quitosano se realizó el proceso de entrecruzamiento con
glutaraldehido, obteniendo materiales poliméricos que se caracterizaron por
espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier (FTIR) y por calorimetría de
barrido diferencial (DSC). Así mismo se le realizaron estudios de hinchamiento
bajo diferentes condiciones de pH mediante el seguimiento gravimétrico en función
del tiempo para los xerogeles, estableciendo que los hidrogeles presentaban una
cinética de hinchamiento de segundo orden y respuesta selectiva al pH, ya que el
grado de hinchamiento aumentó con la disminución del pH.
Finalmente, se llevaron a cabo estudios de liberación de cefalexina monohidratada
a partir de los hidrogeles sintetizados, obteniendo que el hidrogel con menor
cantidad de agente entrecruzante absorbió una mayor cantidad del principio activo
y que el modo de transporte de estos materiales es anómalo.
1
1. INTRODUCCIÓN
En la actualidad, se busca que los polímeros naturales reemplacen en las
aplicaciones biomédicas a los materiales sintéticos empleados comúnmente
debido a las características que estos materiales presentan, es decir, su
biodegradabilidad, mayor biocompatibilidad; pero estos polímeros presentan bajas
propiedades mecánicas, lo que hace complicado su utilización directa en estas
aplicaciones, por lo que son sometidos a procesos de funcionalización,
copolimerización, entrecruzamiento químico o formación de compositos, que han
logrado el mejoramiento de estas propiedades, aumentando así su rango de
aplicabilidad.
Entre los biopolímeros con mayor proyección para ser investigados se encuentran
el alginato y el quitosano, este ultimo debido a que proviene del segundo
biopolímero mas abundante en la naturaleza después de la celulosa y puede ser
obtenido a partir de diversas fuentes, como los crustáceos y algunas familias de
hongos [1]. Por otra parte, una de las aplicaciones biomédicas más estudiadas es
la liberación controlada de fármacos a través de hidrogeles; debido a su eficiencia,
versatilidad, bajo costo y producción con equipamientos y técnicas convencionales
[2]. Esta liberación generalmente se produce por mecanismos de disolución,
difusión y/o erosión.
En trabajo de investigación se llevo a cabo la obtención de hidrogeles de
quitosano entrecruzado con glutaraldehído a partir del micelio de Aspergillus níger,
para ser estudiados como sistemas de la liberación de cefalexina, un antibiótico
que presenta un tiempo de vida media muy corto.
2
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GENERAL
Obtener hidrogeles de quitosano a partir del micelio de Aspergillus níger y estudiar
su aplicabilidad en la liberación contralada de un fármaco.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Optimizar las condiciones de extracción y deacetilación de la quitina a partir
del micelio de Aspergillus níger proveniente de Sucromiles S.A mediante
hidrólisis básica.
Sintetizar hidrogeles de quitosano entrecruzado covalentemente con
glutaraldehído a través de enlaces imina.
Estudiar in vitro la cinética de hinchamiento de los hidrogeles bajo
diferentes condiciones de pH y la liberación controlada de Cefalexina a pH
7.4 y 37°C.
3
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
A nivel industrial los objetivos principales son la producción de un material
apetecido en el mercado y el aprovechamiento al máximo de la materia prima
utilizada, pero en el esfuerzo por alcanzar estos objetivos surgen complicaciones
debido a que en la mayoría de procesos industriales se obtienen coproductos, los
cuales pueden generar una grave problemática si no se consigue darle una
utilidad.
Es el caso del micelio del hongo Aspergillus níger coproducto del proceso
industrial para la obtención de ácido cítrico a partir de azúcar de caña, el cual
debido a su naturaleza y a su alto contenido de humedad se descompone
fácilmente generando un impacto ambiental negativo. Actualmente se producen
13.500 ton/año de coproducto, de las cuales se aprovechan 350 ton como material
de exportación para productos nutracéuticos y 1150 ton como alimento para
ganado y enmienda de suelos [3].
Este gran volumen, unido a su rápida capacidad de descomposición, ha impulsado
una investigación centrada con el objetivo de eliminar este problema
medioambiental y buscar una explotación económica beneficiosa a este
coproducto mediante la extracción y deacetilación de la quitina presente en el
micelio (alrededor del 15%) [4], para la obtención de quitosano que a su vez puede
ser modificado químicamente por entrecruzamiento químico de sus cadenas para
sintetizar redes tridimensionales conocidas como hidrogeles, que pueden ser
utilizados para liberación controlada de fármacos que presente problemas
farmacocinéticos [5].
4
4. MARCO TEORICO Y ANTECEDENTES
4.1 POLÍMEROS NATURALES
Los polímeros naturales también llamados biopolímeros son macromoléculas de
origen natural caracterizadas por sus estructuras complejas, bajo índice de
polidispersidad y fácil degradación. Entre los biopolímeros mas destacados se
encuentran las proteínas, polinucleótidos y polisacáridos en donde la unidad
monómerica son los aminoácidos, nucleótidos y azucares respectivamente [6].
4.1.1 QUITINA
Es uno de los principales biopolímeros, el segundo más abundante después de la
celulosa y aislado por primera vez en 1811 por Frenchman Braconnot [1]. Este
polisacárido compuesto por unidades de 2-acetamida-2-deoxi-β-D-glucopiranosa
unidas a través de enlaces β (1→4) (Esquema 1) fue encontrado en 1823 por
Antoine Odier en la cutícula de algunos insectos [1]. Es insoluble en agua y
solventes orgánicos debido a los enlaces de hidrógenos presentes en la molécula
[2], se encuentra presente en los exoesqueletos de artrópodos y formando parte
de la pared celular de algunas familias de hongos y levaduras así como en las alas
y cutículas de algunas especies de insectos [1].
Esquema 1. Estructura química de la Quitina.
5
4.1.2 QUITOSANO
Es el principal derivado de la quitina conformado por unidades de β-(1→4)-2-
desoxi-2-amino-D-glucopiranosa (D-glucosamina) y β-(1→4)-2-desoxi-2-
acetamido-D-glucopiranosa (N-acetil-D-glucosamina) [7] (Esquema 2), presenta
una configuración helicoidal tridimensional estabilizada mediante enlaces de
hidrógeno entre los monómeros que lo forman [8, 9]. El descubrimiento del
quitosano se le atribuye a Rouget en 1859, quien encontró que calentando la
quitina en medio alcalino se volvía soluble en ácidos orgánicos. En 1894 Hoope-
Seyler llama a este material quitosano y solo hasta 1950 se logra dilucidar su
estructura química [10].
Esquema 2. Estructura química del Quitosano.
Adicionalmente el quitosano presenta características de ser un polímero no
tóxico, biocompatible, biodegradable, insoluble en agua y en soluciones alcalinas
así como en disolventes orgánicos [11]. El quitosano por presentar en la cadena
polimérica grupos amino libres, los cuales se protonan en medio ácido, es soluble
en la mayoría de los ácidos orgánicos acuosos como el ácido acético, fórmico,
entre otros [12].
4.1.3 OBTENCIÓN DE QUITOSANO A PARTIR DE HONGOS
La presencia de quitina en las paredes y membranas celulares de diversos hongos
(Figura 1) tales como Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans,
Saccharomyces cerevisiae, Mucor rouxii, Phycomyces blakesleeanus, Coprinus
6
cinereus, Neurospora crassa, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Rhizopus
spp., Absidia spp., Mucor spp., Mortierella isabelina y Lentinus edodes ha sido
objeto de estudio desde hace muchos años por la importancia que presenta este
biopolímero. [13-16].
Figura 1. Estructura de la pared celular de algunos hongos. Adaptado de: Mehdi
Aghdam, 2010. [17]
Actualmente existen dos métodos para la extracción y deacetilación de la quitina a
partir de estos hongos, el primero consiste en una hidrólisis básica del micelio,
para la ruptura celular y deacetilación de la quitina, seguido de una solubilización
del quitosano en medio ligeramente ácido, y una re-precipitación en medio básico.
Este proceso de obtención se ha realizado satisfactoriamente a partir de diferentes
tipos de hongos, es el caso de Synowiecki, que extrajo del micelio de Mucor Rouxil
con un rendimiento del 7% y grado de deacetilación del 72.7% empleando
condiciones suaves (NaOH al 2% durante 5 horas a 125ºC y ácido acético al 10%)
7
y precipitando el polímero a pH 9-10 [18]. También se ha extraído a partir del
micelio de Absidia Coerules con condiciones similares, obteniendo un grado de
deacetilación de 80.4% [15]. Por otra parte se obtuvo la quitina deacetilada a
escala piloto a partir del micelio de Aspergillus níger empleando NaOH al 40%
durante 6 horas a 120ºC y ácido acético al 10% con un rendimiento del 3.83%
[19]. En 2007, Wang obtuvo quitosano y otros componentes del micelio de
Penicillium chrysongenum mediante el pretratamiento del micelio con NaOH 0.1M
y reacciones de saponificación y deacetilación mediante la adición de NaOH 2M,
con un rendimiento del 5.7% y un porcentaje de deacetilación de 86% [20]. En
2009 Balanta extrajo este biopolímero a partir del micelio de Aspergillus níger con
un porcentaje de rendimiento del 1.07 %, grado de deacetilación de 70 – 81 % y
un peso molecular promedio viscoso de 6.0x105 g/mol [5]. Recientemente Tajdini y
colaboradores extrajeron a partir del micelio de Rhizomucor miehei y Mucor
racemosus utilizando condiciones de NaOH 10% a 121 ºC y acido acético 5% a 95
ºC y precipitando el polímero a pH 10, resultando un grado de deacetilación de
98.6% y 97.1% respectivamente [21].
El segundo método, no tan estudiado como el anterior, se basa en un tratamiento
enzimático, con la misma cantidad de etapas que el método tradicional, es decir,
ruptura celular, deacetilación de la quitina y solubilizacion de la quitina
deacetilada, pero en este caso utilizando enzimas; es el caso de Cai, et al., que
extrajeron por este método empleando el micelio de Aspergilus Niger con
Lisozima, Helicasa, Proteasa y Quitina desacetilasa, obteniendo un grado de
deacetilación, peso molecular y porcentaje de nitrógeno de 76.8%, 2.67x105
g/mol y 8.5%, respectivamente [22].
4.1.4 APLICACIONES DEL QUITOSANO
Dada las propiedades físicas del quitosano, este biopolímero puede modificarse
químicamente por procesos de funcionalización, copolimerización,
8
entrecruzamiento y formación de complejos aumentando su aplicabilidad entre las
cuales se encuentran [1]:
Agricultura: El quitosano presenta efectos beneficiosos sobre las plantas, por
inducir mecanismos de defensa en las mismas y presenta actividad antifúngica
contra muchos hongos fitopatógenos. El quitosano aplicado al tratamiento de
semillas da lugar a incremento en la germinación y mayor rendimiento en los
cultivos [23].
Bioadsorbente y tratamiento de efluentes y aguas: El quitosano es un buen
agente quelatante de iones metálicos, por lo que se ha utilizado para remover
trazas de metales como Cu(II), Pb(II), U(VI), Cr(II), Cr(VI), Ni(II), Cd(II), Zn(II),
Co(II), Fe(II), Pd(II) y Hg(II) presentes en aguas contaminadas debido a los grupos
–OH y –NH2 de los residuos de D-glucosamina como ligandos, en donde al
menos 2 grupos amino de una misma cadena pueden unirse a un mismo ión
metálico. Los grupos amino libres del quitosano resultan mucho más efectivos
para acomplejar los iones metálicos que los grupos acetilo de la quitina [24, 25].
Medicina: por su histocompatibilidad el quitosano forma parte de suturas
quirúrgicas reabsorbibles e implantes de piel artificial para regeneración de tejidos
[26]. También por su elasticidad e interacciones de la misma moléculas como
enlaces de hidrógeno e interacciones hidrófobas, las cuales se forman entre
unidades deacetiladas del quitosano le confieren características de hidrogel [26].
4.2 HIDROGELES
4.2.1 DEFINICIÓN
Los hidrogeles son materiales poliméricos entrecruzados en forma de red
tridimensional que pueden obtenerse mediante polímeros naturales o monómeros
sintéticos (Tabla 1) a través de varios métodos entre los que se encuentra:
9
Reacción química: En este proceso sucede una reacción de copolimerización
y/o entrecruzamiento entre uno o más monómeros y un agente entrecruzante
multifuncional de baja masa molecular y presente en muy pequeñas cantidades
formando un enlace covalente [5].
Formación de complejos: Este proceso provoca la formación de enlaces
iónicos entre las cargas de signos opuestos de un polímero que lleva
incorporado un grupo aniónico en el sustituyente lateral de la cadena principal
y un polímero que posee grupos potencialmente catiónicos o un catión
polivalente [5].
Entrecruzamiento por radiación: En este método utiliza la emisión de
electrones, rayos gamma, rayos X o luz ultravioleta para excitar el polímero y
producir la estructura entrecruzada [27].
Tabla 1. Polímeros Naturales y Monómeros sintéticos más utilizados en la obtención de
hidrogeles Fuente: Lin et al., 2006. [28]
Polímeros Naturales Monomeros Sintéticos
Quitosano Acido Acrílico (AA)
Alginato Acido Metacrilico (MAA)
Fibrina Polietilenglicolacrilato/metacrilato
Acido Hialurónico Polietilenglicol diacrilato / dimetacrilato
Estos materiales en estado seco se caracterizan por ser sólidos amorfos y en
algunos casos semicristalinos, que reciben el nombre de xerogeles, los cuales se
caracterizan por su extraordinaria capacidad para absorber agua y diferentes
fluidos, sin perder su forma original, la cual se debe a grupos como: -OH, -COOH,
-CONH2, -NH2 y -SO3H [29]; Los hidrogeles por presentar esta características son
de enorme interés, sobre todo en la medicina como dispositivos para diagnóstico,
substrato para el cultivo de células, geles para electroforesis, desintoxicantes
sanguíneos, membranas para hemodiálisis, sistemas terapéuticos biodegradables,
lentes de contacto, implantes y sistemas de liberación controlada y/o sostenida de
principios activos que presenten problemas farmacocinéticos [30].
10
4.2.2 CARACTERISTICAS
Para que un material se puede clasificar como hidrogel debe de presentar ciertas
características tales como: equilibrio de hinchamiento, transición de fase, y en
algunos casos pueden presentar sensibilidad al medio que lo abarca.
4.2.2.1 EQUILIBRIO DE HINCHAMIENTO Y TRANSICIÓN DE FASE
Una vez estos materiales poliméricos entran en contacto con el agua, comienza a
darse un proceso de absorción sin perder su forma original (Figura 2), el cual
puede depender de la temperatura, pH o variaciones de la concentración de los
electrolitos. Este proceso se da hasta alcanzar un equilibrio físico-químico, en
donde el material presenta propiedades tanto de sólidos como de líquidos y es el
resultado del balance entre las fuerzas dispersivas y las cohesivas
intermoleculares que actúan en las cadenas poliméricas hidratadas, es decir, este
equilibrio está directamente relacionado con la presencia de monómeros
hidrofílicos y con la densidad del entrecruzamiento de las cadenas [27].
Figura 2. Cambio en la estructura de los hidrogeles en la transición de fase.
4.2.2.2 SENSIBILIDAD AL MEDIO
Una de las características más notables y de gran interés en el campo de la
liberación de fármacos de estos materiales poliméricos está relacionada con la
habilidad que presentan cuando el hinchamiento puede ser activado por un
estimulo del medio [31]. A los hidrogeles que presentan esta característica se les
11
denomina hidrogeles inteligentes ya que presentan una respuesta selectiva al pH,
a la temperatura, entre otras condiciones.
4.2.2.2.1 SENSIBILIDAD AL pH
Esta sensibilidad es generada por la presencia de grupos ionizables (Tabla 2) en
la red tridimensional, los cuales pueden protonarse (grupos Catiónicos) o
desprotonarse (grupos Aniónicos) dependiendo del pH del medio, aumentando las
repulsiones electrostáticas entre las cadenas poliméricas y por ende incrementan
el hinchamiento del material (Figura 3).
Tabla 2. Grupos Sensibles a cambios de pH.
Grupos Aniónicos Grupos Catiónicos
-COO- -N+-
-OPO3- -NH+-
-OSO3- -NH2
+-
-SO3- -NH3
+-
-OCS2- -NRNH2
+-
-OPO32- -NR2H
+-
- PO32- -NR3
+-
- PO22- -P+-
Estos hidrogeles sensibles al pH se han estudiado en muchas aplicaciones
biomédicas, incluyendo en la liberación de péptidos vía oral [32] y válvulas para
dispositivos de microfluidos [33].
12
Figura 3. Perfiles de las curvas de hinchamiento en función del pH de hidrogeles
sensibles al pH. Adaptado de Lin et al., 2006.
4.2.2.2.2 SENSIBILIDAD A LA TEMPERATURA
Otro importante estímulo del medio, es la temperatura, en donde el cambio de
volumen está caracterizado por la temperatura de solución critica (LCST), la cual
depende del porcentaje de monómeros hidrófilos presente en la estructura; por la
cual a temperaturas menores el hidrogel tiende a hincharse y por encima se de
esta el material se colapsa. Esta respuesta selectiva de los hidrogeles está
relacionada con los diferentes tipos de interacción que existen en el sistema
polimérico, en especial las interacciones hidrófobas y los puentes de hidrógeno
[34].
Actualmente, se busca obtener hidrogeles capaces de presentar sensibilidad al pH
y a la temperatura, lo cual se logra por la copolimerización de un monómero
sensible a la temperatura, por lo general poli-N-Isopropilacrilamida (NIPA) y un
monómero sensible al pH como los derivados del ácido acrílico [28]; es el caso de
Yin, A. y colaboradores, que en el 2006 sintetizaron copolímeros a base de ácido
propilacrílico y NIPA capaces de detectar los cambios ambientales en el rango
fisiológico y ha encontrado utilidad en el suministro intracelular de los fármacos en
los que las diferencias sutiles de pH a través de la membrana endosomal
desencadena la entrega de proteínas o ADN [35].
13
4.2.2.2.3 SENSIBILIDAD A OTROS ESTIMULOS
Diversos estímulos además del pH y la temperatura pueden influenciar el
comportamiento de los hidrogeles; es el caso de la luz ultravioleta en donde por
irradiación a una temperatura adecuada algunos hidrogeles se hinchan
discontinuamente en respuesta a la irradiación de luz ultravioleta y colapsan
cuando dejan de iluminarse [27]. Algunos hidrogeles polielectrolitos se pueden
combinar con polímeros conjugados para producir movimientos de contracción y
relajación reversibles bajo estímulos eléctricos que pueden simular la acción de
músculos [27].
4.2.3 APLICACIÓN DE LOS HIDROGELES
Los hidrogeles por su gran contenido de agua y su capacidad de retener
moléculas de bajo peso molecular pueden ser utilizados como sistemas de
liberación contralada [33], en donde la liberación se produce por simple difusión a
través de la matriz polimérica hinchada y hacia un ambiente externo. Si el proceso
de liberación es continuo, la cantidad de fármaco dentro de la matriz polimérica
normalmente disminuye con el tiempo (Figura 4) [5].
Figura 4. Sistema de liberación controlada a partir de un hidrogel. Adaptado de Escobar
et al., 2002.
Así mismo, debido a sus propiedades físicas, los hidrogeles permiten su empleo
en prótesis de tejidos blando, tal es el caso del ácido poli(hidroximetilmetacrílico),
14
poli(HEMA), el cual ha sido utilizado en prótesis de senos presentando ventajas
sobre los tejidos grasos que tienden a reabsorberse, y otros materiales sintéticos
como las siliconas, ya que los hidrogeles son permeables a los fluidos corporales.
[5].
4.2.4 HIDROGELES DE QUITOSANO
Con el quitosano, se pueden formar hidrogeles inteligentes ya que poseen la
capacidad de realizar un hinchamiento selectivo frente al pH, debido a los grupos
amino en su cadena polimérica. En la mayoría de los casos presentan un
entrecruzamiento covalente aunque también se han reportado hidrogeles con
entrecruzamiento iónico [26].
HIDROGELES CON ENTRECRUZAMIENTO COVALENTE
Este tipo de hidrogeles se pueden dividir en tres tipos dependiendo de su
estructura en: quitosano entrecruzado consigo mismo, redes poliméricas híbridas
(HPN) y redes de polímeros interpenetrados (IPN) [26].
Figura 5. Estructura de los tipos de hidrogeles entrecruzados covalentemente.
Adaptado de Berger et al., 2004.
a) Quitosano Entrecruzado
consigo mismo
b) Redes Poliméricas Hibridas
c) Redes de Polímeros
Interpenetrados
15
En los hidrogeles covalentes los agentes entrecruzantes más empleados son los
dialdehídos ya que permiten que la reacción se produzca directamente en un
medio acuoso sin necesidad de moléculas auxiliares tales como reductores que
puedan disminuir su biocompatibilidad [36-39]. La reacción se da entre el grupo
aldehído que forma un enlace imina covalente con los grupos amino del quitosano
vía reacción de Schiff:
En el 2004 Sánchez y colaboradores sintetizaron hidrogeles de quitosano con
glutaraldehído y glioxal a partir de los desechos de la industrialización del
camarón langostino Pleuroncodes planipes. El hidrogel de quitosano entrecruzado
con glioxal al 20%, posee las mejores condiciones para ser empleado, en
investigaciones posteriores, como soporte para el crecimiento de fibroblastos
humanos [40]. Sokker H.H. y colaboradores sintetizaron hidrogeles sensibles a la
temperatura y pH basados en quitosano injertado con ácido poli acrílico (PAAC),
polimetacrilato de hidroxipropilo (PHPMA), Alcohol polivinílico (PVA) mediante
irradiación gamma para la liberación controlada de Oxitetraciclina a diferentes pH
y temperatura [41]. Zhong, C., y colaboradores sintetizaron hidrogeles a través de
foto-entrecruzamiento UV en solución acuosa utilizando quitosano modificado con
ácido maleico y diacrilato de polietilenglicol (PEGDA) obteniendo biomateriales
biodegradables a base de quitosano no tóxico para las células endoteliales de
aorta bovina en dosis bajas [42]. Por otra parte Muzzarelli R. ha reportado la
obtención de hidrogeles fluorescentes de quitosano con genipin, con potenciales
biomédicos y farmacéuticos debido a que estos hidrogeles no presentaron
citotoxicidad para las células animales y humanas estudiadas [43].
4.3 CARACTERISTICAS GENERALES DE LA CEFALEXINA
La Cefalexina monohidratada [44], es un antibiótico cefalosporínico de primera
generación administrado vía oral, con gran actividad contra la mayoría de las
bacterias gran-positivas. Este principio activo se utiliza principalmente en el
16
tratamiento de otitis media e infecciones del tracto respiratorio. Su mecanismo de
acción es mediante la inhibición de la tercera y última etapa de la síntesis de la
pared celular bacteriana preferiblemente por la unión a proteínas específicas de
unión a penicilina (PBP) que se encuentran dentro de la pared celular bacteriana.
Este medicamento presenta un tiempo de vida media de 0.9h y es eliminada
principalmente por vía renal y casi en su totalidad en forma terapéuticamente
activa.
Esquema 3. Estructura química de la Cefalexina.
17
5. METODOLOGÍA Y PARTE EXPERIMENTAL
Los reactivos usados se presentan en la Tabla 3 y se emplearon tal como se
recibieron.
Tabla 3. Reactivos Empleados durante todo el proyecto.
Reactivo Casa Comercial Pureza (%)
ácido Acético Glacial (CH3COOH) Sucromiles S.A. 99.5
ácido Clorhídrico Panreac Quimica S.A.U. 37
Alcohol Etílico Sucromiles S.A. 95.0
Cefalexina Monohidratada Tecnoquimicas --------
Glutaraldehído Sigma 25.0
Hidróxido de Sodio (NaOH) Agenquimicos 98.7
Micelio Sucromiles S.A. -----------
Los espectros de infrarrojo y resonancia magnética nuclear protónica (RMN-1H) se
realizaron en un espectrofotómetro marca Shimadzu FTIR-8400, preparando
muestras sólidas (pastilla de KBr) y el equipo de RMN Bruker Avance II 400 MHz
respectivamente.
5.1 OBTENCIÓN DEL QUITOSANO
5.1.1 Optimización de las Condiciones de Extracción
Las mejores condiciones de extracción se determinaron realizando un diseño
experimental factorial, el cual consistía de dieciséis experimentos, con sus
respectivas replicas, en donde las variables independientes eran la concentración
de hidróxido de sodio y el tiempo de reflujo y la variable dependiente era el
porcentaje de rendimiento de la extracción. Así mismo se estudió la influencia que
presentaba el ácido en la extracción, en donde se emplearon el ácido acético y
ácido clorhídrico.
18
5.1.2 Extracción y Deacetilación de la Quitina
El micelio proveniente de la empresa Sucromiles S.A. se lavó con agua y filtró
para eliminar cualquier impureza o ácido cítrico remanente; estos lavados fueron
suspendidos cuando el agua no presentaba coloración aproximadamente 6L de
agua, después el sólido se secó en el horno a una temperatura máxima de 50ºC
durante 24h. Una vez seco, el micelio fue hidrolizado con hidróxido de sodio al
40%p/v durante cuatro horas en una relación de 5mL de solución por cada gramo
de micelio, mediante un calentamiento a 100°C y agitación mecánica. Después
esta mezcla se dejó en reposo toda la noche. Al siguiente día, se filtró la masa y
lavó con abundante agua destilada (aproximadamente 7L) eliminando el exceso
de NaOH y obteniendo un pH cercano a la neutralidad. Seguido la masa de color
crema se lavó con etanol y se secó en el horno a una temperatura máxima de
50ºC.
5.1.3 Solubilización del Quitosano y Re-precipitación
Una vez seco, el micelio hidrolizado fue sometido a reflujo durante 4 horas con
ácido clorhídrico al 0.74%v/v (2mL ácido concentrado en 100mL solución) a una
temperatura de 100ºC y pH alrededor de 3.0, en una relación de 1:20 (p:v).
Inmediatamente se filtró la mezcla, almacenando el filtrado. Esta operación de
extracción se repitió, obteniendo un segundo filtrado. Los filtrados se reunieron y
basificaron hasta pH 10 con agitación constante durante una hora, después se
dejaron en reposo para una completa precipitación. El sólido se recuperó por
decantación y filtración, lavándolo con agua destilada y dejándolo secar a
temperatura ambiente, para luego ser purificado, pesado y caracterizado.
5.1.4 Purificación del Quitosano
Una vez seco, el sólido se disolvió en ácido acético al 2%v/v, posteriormente se
filtró al vacío y el filtrado se basificó con hidróxido de sodio con agitación constante
19
por una hora. El precipitado se filtró y lavó con agua hasta pH neutro. El sólido se
mezcló con alcohol etílico al 95%v/v, se colocó en agitación constante durante
dos horas y se dejó en reposo por una hora más. Finalmente, el quitosano se filtró
y se secó a temperatura ambiente por 24 horas.
5.2 CARACTERIZACIÓN DEL QUITOSANO
5.2.1 Identificación del Polímero
La identificación se realizó mediante espectroscopia Infrarroja con Transformada
de Fourier (FT-IR) mediante la presencia de las bandas de tensión, vibración de
los grupos carbonilo, amino, hidroxilo. También se identificó por RMN-1H
disolviendo el polímero en ácido trifluoroacético y utilizando DMSO-d6 como
solvente deuterado, así mismo se determinaron los porcentajes de carbono,
hidrogeno y nitrógeno mediante la técnica instrumental de análisis elemental.
5.2.2 Peso Molecular Promedio
El peso molecular se determinó por viscosimetría capilar utilizando un
viscosímetro de Ostwald de flujo inverso. El viscosímetro se calibró con 10 mL de
solución de ácido acético 0.1M y cloruro de sodio 0.2M sumergido en un baño
termostático a 25°C. Una vez calibrado, se preparó una solución de quitosano al
2%p/v (0.5 g en 25mL de ácido acético 0.1M y cloruro de sodio 0.2M), y de ella se
prepararon soluciones de 10mL de concentraciones 0.001, 0.003, 0.005, 0.007,
0.009, y 0.01 g/mL a las cuales se les midió el tiempo que tomaba la solución en
pasar desde el primer enrase hasta el siguiente enrase del viscosímetro cinco
veces.
5.2.3 Grado de Deacetilación
Este parámetro se determinó mediante valoración potenciométrica, disolviendo
0.5g de quitosano en 20mL de HCl 0.3M. Esta solución se tituló con NaOH 0.1M,
previamente estandarizado con ftalato ácido de potasio. Las mediciones de pH se
20
realizaron gradualmente tras la adición de cada mililitro de NaOH en un pH-metro
marca CG820 Schott Gerate, la valoración termino cuando el pH llegó a 12.
5.3 SÍNTESIS HIDROGELES
El entrecruzamiento del quitosano se realizo de la siguiente manera: una solución
al 2%p/v de quitosano en ácido acético al 2%v/v se vertió en tubos de ensayo 2
mL de esta solución, seguido de diferentes cantidades de una solución de
glutaraldehido al 5%v/v dependiendo del grado de entrecruzamiento que se
deseaba alcanzar (Tabla 4) y una agitación por dos minutos, dejándolo en reposo
de 2 – 5 horas. Los hidrogeles se sacaron del tubo de ensayo y se lavaron con
agua destilada por un periodo de una semana cambiando el agua cada día. Luego
se cortaron discos de 1mm de espesor y 1.5mm de diámetro. Las muestras se
dejaron secar a temperatura ambiente durante 7 días hasta alcanzar el estado
xerogel.
Tabla 4. Proporciones utilizadas para la obtención de los hidrogeles
Ensayo Cantidad de Quitosano
Cantidad de Glutaraldehído
(mL)
Porcentaje de Entrecruzamiento (%)
ERP–H01
2m
L S
olu
ció
n
0,15 5
ERP–H02 0,40 10
ERP–H03 0,55 15
ERP–H04 0,70 20
ERP–H05 0,85 25
ERP–H06 1,00 30
ERP–H07 1,20 35
ERP–H08 1,40 40
ERP–H09 1,90 50
5.4 CARACTERIZACIÓN DE LOS HIDROGELES
5.4.1 Espectroscopia Infrarroja
Los hidrogeles se caracterizaron en estado seco mediante espectroscopia IR.
21
5.4.2 Análisis térmico
Los hidrogeles en estado seco se analizaron mediante calorimetría de barrido
diferencial (DSC), para determinar sus temperaturas de transición vítrea (Tg),
empleando un equipo de calorimetría TA Instruments 2920 y realizando barridos
desde 25 hasta 300°C a una velocidad de 10°C/min.
5.5 CINÉTICA DE HINCHAMIENTO DE LOS HIDROGELES
Los estudios de hinchamiento, los cuales consisten en determinar el incremento
en peso de los materiales poliméricos en función del tiempo se realizaron
sumergiendo el xerogel en soluciones de diferente pH y determinando el peso del
material cada 5 minutos durante la primera hora de estudio, cada diez minutos
durante la segunda hora, cada 30 minutos durante las dos horas siguientes [45].
De ahí en adelante el peso se determinó cada hora; cabe aclarar que antes de
realizar las mediciones, cada hidrogel se secó con papel secante eliminando el
exceso de la solución en la superficie. El seguimiento se realizó hasta no
presentarse variaciones considerables en el peso de cada pastilla, es decir, hasta
alcanzar el equilibrio de hinchamiento. Todos los estudios se realizaron por
triplicado, en una balanza PioneerTM Analítica.
En este proceso de hinchamiento el contenido de agua (H) y grado de
hinchamiento (W) fue seguido gravimétricamente mediante las siguientes
ecuaciones
Ecuación 1.
Ecuación 2.
Donde: Wt es el peso del material en el tiempo t y Wo es el peso del material seco.
22
5.6 ESTUDIOS DE LIBERACIÓN IN VITRO
Para los estudios de liberación sólo se emplearon los hidrogeles entrecruzados al
10 y 20% (Tabla 4), debido a que estas muestras presentaron buena resistencia al
tacto y mejores resultados durante los estudios de hinchamiento realizados.
El principio activo se incorporó en el hidrogel mediante el hinchamiento de este
material polimérico en estado seco (xerogel) en una solución de cefalexina (1000
mg/L). El estudio de liberación del fármaco “in vitro” fue seguido por
espectroscopia ultravioleta-visible utilizando un espectrofotómetro Shimadzu UV-
Vis a 261.2nm, introduciendo el hidrogel en 50mL de una solución buffer de pH 7.4
y a una temperatura de 37 ºC.
Durante 3 días se determinó la concentración del fármaco liberado en la solución a
diferentes intervalos de tiempo, para lo cual se extrajeron alícuotas del volumen de
la siguiente manera: cada 15 minutos las tres primeras horas, cada 30 minutos las
cinco horas restantes del primer día y después cada 24 horas hasta el final del
estudio; una vez se realizaba la medición, la alícuota se devolvía al medio para
mantener el volumen constante. Los datos obtenidos se analizaron utilizando una
curva de calibración construida con diferentes concentraciones de fármaco patrón
y la ley de Beer-Lambert-Bougue.
23
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 OBTENCIÓN DE QUITOSANO
6.1.1 Optimización
En la búsqueda de las mejores condiciones (mayor rendimiento y menor costo) de
obtención de quitosano a partir del micelio del hongo Aspergillus níger mediante el
método tradicional (Esquema 4), se realizó un diseño experimental factorial en
donde se establecieron algunas constantes (Tabla 5) y los rangos de las variables
independientes (Tabla 6).
Esquema 4. Diagrama de Bloques para la extracción de quitosano.
Tabla 5. Constantes durante el proceso de optimización. Constante Valor Explicación
V. NaOH 300mL Volumen acorde al material empleado.
Micelio 50g Se obtuvieron los mejor resultados de agitación magnética al volumen ya establecido.
T. Reflujo 100ºC Temperatura optima de acuerdo a la literatura.
[Ac. Acético ] 2%v/v Presenta el mismo ion (Acetato), (2mL de ácido concentrado en 100mL de solución
pH HAc 3.5 – 4.0 A este rango de pH los grupos amino se encuentran protonados.
t. Reflujo ácido 3h Tiempo máximo para una prueba a esta escala.
pH Final 10 – 12 A este rango de pH se presenta una completa desprotonación de los grupos amino.
24
Tabla 6. Resultados del diseño experimental empleado. Experimento [NaOH] (%p/V) t Reacción (h) % Rendimiento
I
20
2 0.06
II 3 0.18
III 4 0.34
IV 5 0.46
V
30
2 0.26
VI 3 0.35
VII 4 0.59
VIII 5 0.75
IX
40
2 0.32
X 3 0.67
XI 4 1.23
XII 5 0.91
XIII
50
2
No se pudo establecer
XIV 3
XV 4
XVI 5
Para obtener buenos resultados en el proceso de extracción es necesario que la
concentración de hidróxido de sodio no supere el 40%p/v y que el tiempo de
reacción no sea mayor de 4 horas. Cuando se usan concentraciones del 50%p/v el
filtrado obtenido después de la solubilización ácida, presenta aglomerados del
micelio que no se pueden remover, y el calentamiento prolongado puede provocar
ruptura en las cadenas del polímero.
Una vez establecida las condiciones para el tratamiento básico, se procedió a
evaluar la influencia del ácido empleado en la extracción: se compararon acético
(CH3COOH) y ácido clorhídrico (HCl) con los mismos parámetros establecidos en
la Tabla 1, alcanzando rendimientos mayores con el ácido mineral (Tabla 7),
además al utilizar CH3COOH la cantidad de hidróxido de sodio para promover la
precipitación completa del polímero es mayor que la necesaria si se utilizara HCl
debido a que el CH3COOH es un ácido débil.
25
Tabla 7. Porcentaje de Rendimiento en la extracción para ambos ácidos empleando los parámetros de la tabla 5.
Acido % Rendimiento
Ac. Acético 1.23
Ac. Clorhídrico 4.25
6.1.2 Extracción de la quitina
En la pared celular de los hongos, se encuentran proteínas, azúcares y quitina,
este polisacárido se halla formando el complejo quitino-glucano por un enlace
glucosídico β(1-3) entre la N-acetilglucosamina y la glucosa (Esquema 5) [46], por
lo cual la primera etapa del proceso de extracción es la liberación de estos
componentes presentes en la pared celular, para ello se utiliza un medio
fuertemente alcalino que ocasiona la solubilización de la membrana por
saponificación de los lípidos presentes en ella. Una vez liberados, los azúcares y
proteínas sufren degradación y desnaturalización respectivamente por causa de la
temperatura y la concentración empleada de NaOH.
Esquema 5. Complejo quitino-glucano.
Así mismo, el enlace glucosídico del complejo sufre una hidrólisis básica
(Esquema 6), separando la quitina del complejo por filtración.
26
Esquema 6. Hidrólisis del complejo quitino-glucano.
6.1.3 Deacetilación de la Quitina
De la quitina extraída se obtiene quitosano mediante la hidrólisis del grupo
acetamido, por tratamiento con hidróxido de sodio (Esquema 7).
Esqu
ema 7. Deacetilación de la quitina.
El mecanismo de esta reacción de deacetilación transcurre en tres pasos; el
primer paso consiste en un ataque nucleofílico en la posición electrófila del grupo
carbonilo de la quitina por parte del grupo hidroxilo y formación del intermediario
tetraédrico.
27
Esquema 8. Adición nucleofílica del grupo hidroxilo.
En el segundo paso del mecanismo, el intermediario tetraédrico sufre la
eliminación del grupo amino (NHR), para la formación del ácido carboxílico
correspondiente.
Esquema 9. Eliminación del grupo amino.
En el tercer paso, la amina (glucosamina) actúa como base desprotonando el
ácido. Este equilibrio es muy favorable y desplaza los anteriores equilibrios hacia
el producto final.
Esquema 10. Equilibrio ácido – base entre el ácido carboxílico y la amina.
28
6.1.4 Solubilización y precipitación de Quitosano
Finalizada la reacción de deacetilación, el quitosano se encuentra mezclado con la
fracción insoluble en medio alcalino, los residuos de azúcares y las proteínas
desnaturalizadas, por tal razón se adiciona este sólido en un medio ligeramente
ácido para solubilizar el polímero debido a que en estas condiciones de pH el
grupo amino libre se encuentra protonado, es decir, el quitosano se convierte en
un polielectrolito (Esquema 11) y de esta manera es posible separarlo mediante
procesos físicos de estos residuos insolubles. Luego se precipita por
neutralización con NaOH.
Esquema 11. Recuperación del quitosano mediante cambios en el pH de la solución.
6.1.5 Purificación del Quitosano
El quitosano obtenido se purificó solubilizándolo en ácido acético al 2%p/v y
filtrando esta solución para así eliminar cualquier tipo de impureza presente en
este sólido; después se precipitó con NaOH, se filtró y lavó con agua y etanol. El
polímero se seco, obteniendo 4.25% de rendimiento. Este porcentaje presento un
aumento en comparación con trabajos previos que reportaban rendimientos de
reacción del 1.07% [4] debido a las mejoras en las condiciones de trabajo:
La utilización del diseño experimental que estableció la concentración de
hidróxido y el tiempo de reacción adecuados.
La agitación mecánica y relación entre la cantidad de micelio y el volumen de la
solución (NaOH o HCl) permitieron una mayor homogenización del calor y
concentración en todo el micelio.
29
Los procesos de lavado y secado después de realizada una etapa de la
extracción, con los que se estableció las cantidades requeridas de reactivo
para la siguiente etapa.
6.2 CARACTERIZACION DEL QUITOSANO
6.2.1 identificación de Quitosano
El polímero extraído se identificó y caracterizó por varias técnicas para determinar
algunas de sus propiedades fisicoquímicas.
6.2.1.1 Espectroscopia Infrarroja
Al analizar el espectro de infrarrojo del polímero extraido, se observa una
banda ancha que absorbe a 3473cm-1, atribuida al estiramiento del enlace
hidroxilo (-OH), la cual solapa la banda de estiramiento del enlace amino
(NH2); en el espectro también se insinúa una banda pequeña (hombro)
correspondiente al estiramiento de los enlaces carbono-hidrogeno (C-H) que
aparece a 2939cm-1, la elongación del grupo carbonilo (-C=O) aparece a
1650cm-1, la vibración de deformación del enlace N-H aparece a 1567cm-1;
también se observan las bandas de la torsión para el grupo metileno (CH2), a
1414 cm-1, la banda de vibración de C-N de aminas alifáticas primarias a
1210cm-1 y la vibración del enlace C-O-C aparece a 1050cm-1 [47].
30
Figura 6. Espectro Infrarrojo de Quitosano (pastilla KBr).
6.2.1.2 Resonancia Magnética Nuclear Protónica
Se observa un singulete localizado a 2.07ppm, correspondiente a los protones del
grupo acetamido (-CH3), a 2.91ppm aparece el protón H2 de la fracción
glucosamina (Esquema 2), entre 3.50 y 3.74ppm se observa multipletes,
correspondientes a los protones H3, H4, H5 y H6 para las fracciones de D-
glucosamina y N-Acetil-glucosamina y el H2 para la fracción acetilada; los
protones H1 para la unidades D-glucosamina y N-Acetil-glucosamina aparecen en
una misma señal a 4.81ppm. La señal correspondiente al solvente deurterado
aparece a 2.49 y 3.28ppm para el DMSO y el agua respectivamente.
31
8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0ppm
DMSO-d6
2.0
7
2.9
13.5
03
.68
3.7
13
.74
4.8
1
3.5 3.0ppm
2.9
1
3.5
0
3.6
83
.713.7
4
Figura 7. Espectro de resonancia magnética nuclear protónica del quitosano en
CF3COOH/DMSOd6 a 80 ºC.
6.2.1.3 Análisis Elemental
La composición elemental del quitosano se determinó mediante un analizador de
carbono, hidrógeno y nitrógeno, en donde los elementos son determinados como
dióxido de carbono, agua y óxidos de nitrógeno a través de celdas de infrarrojo
[48].
Tabla 8. Resultados del análisis elemental del quitosano extraído
Muestra %C %H %N
ERP-M06 35,93 6.51 4,68
ERP-M07 37,91 5.31 4,42
ERP-M12 31,23 6.00 4,21
Para el quitosano comercial el porcentaje de nitrógeno se encuentra en 7.17%
[49], el bajo valor de este porcentaje probablemente se debe a que todavía se
encuentren fracciones de glucanos en las muestras analizadas.
32
6.2.2 Peso Molecular Promedio del Quitosano
La determinación del peso molecular promedio para el polímero obtenido se
realizó aplicando las ecuaciones de Huggins y Mark – Houwink – Sakurada,
determinando primero la constante B del viscosímetro, para lo cual se calibró el
instrumento con una solución de ácido acético al 0.1M y NaCl al 0.2M, aplicando la
ecuación =B t, teniendo en cuenta las condiciones de trabajo (densidad de esta
solución, la temperatura 25ºC) y que el coeficiente de viscosidad de esta solución
es 1.056 x 10-5poise [50]. La constante B determinada para el viscosímetro fue de
1.52X10-8 cm4/s2.
Tabla 9. Resultados obtenidos de y sp / B para cada solución.
Cx (g/mL) (g/mL) t (s) (poise) sp/ (mL/g)
0 1,0063 690,0 1,056 -------
0,001 1,0057 748,5 1,145 93,877
0,003 1,0018 1111,7 1,694 114,778
0,005 0,9989 1367,5 2,078 128,280
0,007 0,9960 1548,7 2,346 137,632
0,009 0,9958 1650,9 2,500 151,973
0,010 0,9945 1773,5 2,683 154,031
Mediante la ecuación de la recta para la gráfica de viscosidad reducida en función
de la concentración en masa de las soluciones, se puede establecer la viscosidad
intrínseca ( ) del polímero a través de la comparación de esta ecuación con la
ecuación de Huggins (Ecuación 3), debido a que el intercepto de esta ecuación es
equivalente a la viscosidad intrínseca.
Ecuación 3.
33
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010
90
100
110
120
130
140
150
160
Vis
co
sid
ad
Re
du
cid
a (
mL
/g)
Concentracion (g/mL)
Gráfica 1. Viscosidad reducida en función de la concentración de las soluciones.
Tabla 10. Resultados de la regresión lineal de la grafica 1.
Ecuación
Parámetro Valor Error
Pendiente 6538.7 484.5
Intercepto 91.95 3.22
r 0.9731
El valor obtenido para , se reemplazó en la ecuación de Mark – Houwink –
Sakurada (Ecuación 4), para calcular el peso molecular del polímero teniendo en
donde la constante K’ y son 1.81 x 10-3 y 0.93 respectivamente [51], en las
condiciones empleadas.
Ecuación 4.
34
El quitosano se puede clasificar de acuerdo su peso molecular, en alto y bajo en
donde el rango para quitosano de alto peso molecular es superior a 106g/mol. De
acuerdo al valor obtenido para el peso molecular por esta técnica, se establece
que el polímero es de bajo peso molecular.
6.2.3 Grado de Deacetilación del Quitosano
El grado de deacetilación obtenido (Tabla 11) por la valoración potenciométrica se
calculó mediante la ecuación 6:
Ecuación 5.
En donde V2-V1 es la diferencia del volumen de NaOH obtenido de los puntos de
inflexión, w es el peso de la muestra, M es la molaridad del agente titulante y 6,1
es un valor relacionado con el peso equivalente del quitosano [52].
0 10 20 30 40 50 60
0
2
4
6
8
10
12
pH
Volumen NaOH (mL)
Gráfica 2. Variación del pH en función del volumen de NaOH 0.1 M.
35
0 10 20 30 40 50 60
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
dpH/
dV
Volumen NaOH (mL)
Gráfica 3. Primera derivada del pH versus en función del volumen.
Mediante la gráficas 3 se obtienen los puntos de inflexión (Tabla 11), equivalentes
al volumen de NaOH 0.105M requeridos para reaccionar con los grupos amino
protonados del quitosano.
Tabla 11. Resultados de la valoración potenciométrica para el quitosano.
[NaOH] (M) V2 (mL) V1 (mL) V2-V1 (mL) %DD
0.105 22 15 7 76.33
Cabe aclarar que el valor obtenido para el grado de deacetilación por medio de
esta técnica, puede presentar un cierto margen de error, debido a que valores
altos de pH, el electrodo utilizado presenta respuesta tanto a los iones H+ como a
los Na+ en solución, error conocido como error alcalino [53].
6.3 OBTENCIÓN DE LOS HIDROGELES
Los hidrogeles de quitosano entrecruzado con glutaraldehído se sintetizaron por
medio de la formación del enlace imina [26] entre los grupos carbonilo del
compuesto di-funcional y los grupos amino libres de las cadenas del polímero
(Esquema 11). En donde el mecanismo de esta reacción, comienza con el ataque
36
nucleofílico en cualquier posición electrófila del dialdehído por parte del grupo
amino, provocando la formación de un intermediario tetraédrico (Esquema 12).
Esquema 12. Síntesis de los hidrogeles.
Esquema 13. Ataque Nucleofílico al dialdehído.
Seguido de un re-arreglo interno para la formación del hemiaminal
correspondiente.
Esquema 14. Formación del hemiaminal.
37
Por último, este intermediario pierde una molécula de agua, dando lugar a la
formación del enlace imina.
Esquema 15. Formación del enlace imina
De igual manera sucede para la otra posición electrófila del glutaraldehído y otro
grupo amino libre del quitosano para así formar la red tridimensional entre el
polímero y el agente entrecruzante.
Esquema 16. Estructura general del hidrogel
6.4 CARACTERIZACION HIDROGELES
Los hidrogeles obtenidos presentaron una consistencia blanda, ligeramente
elástica con color vinotinto. A medida que se deshidrataban, se volvieron más
duros y su color más oscuro.
38
De acuerdo con las observaciones descritas en la Tabla 12, los hidrogeles al 10%
y 20% presentaron las mejores propiedades mecánicas; los estudios posteriores
sólo se realizaron para estos materiales.
Tabla 12. Características de los hidrogeles obtenidos. Hidrogel Entrecruzamiento Características
ERP–H01 5 El material no tiene buena resistencia al tacto, se rompe fácilmente.
ERP–H02 10 El material tiene buena resistencia al tacto y al hinchamiento.
ERP–H03 15 El material tiene buena resistencia al tacto pero perdió su forma después del lavado.
ERP–H04 20 El material tiene buena resistencia al tacto y al hinchamiento.
ERP–H05 25 El material tiene buena resistencia al tacto pero perdió su forma después del lavado.
ERP–H06 30 El material tiene buena resistencia al tacto pero se rompe fácilmente cuando se lavaron.
ERP–H07 35 El material tiene buena resistencia al tacto pero perdió su forma después del lavado.
ERP–H08 40 El material no tiene buena resistencia al tacto, se rompe fácilmente.
ERP–H09 50 El material no tiene buena resistencia al tacto, se rompe fácilmente.
6.4.1 Espectroscopia Infrarroja
Una vez secos, los hidrogeles se caracterizaron por espectroscopia FT-IR,
obteniendo espectros en los cuales se observa las bandas características del
quitosano expresadas en la sección 6.21.1 diferenciándolos en la intensidad de las
bandas correspondientes a la vibración del grupo imina (C=N) y al estiramiento de
los enlaces carbono-hidrogeno (C-H) localizadas alrededor 2930 y 1510 cm-1
respectivamente [51], en donde en el hidrogel al 20% estas bandas son más
intensa debido a la mayor cantidad de agente entrecruzante
39
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
60
70
80
90
100
Tran
smita
ncia
(%)
Numero de Onda (cm-1)
10%
20%
Figura 8. Espectro Infrarrojo de los hidrogeles obtenidos.
6.4.2 Calorimetrí
a de Barrido Diferencial
En el termograma representado en la Figura 9, se puede apreciar tres
fluctuaciones, la primera aproximadamente a 50 ºC correspondiente a la
temperatura de transición vítrea del hidrogel al 20%, es decir, que debajo de esta
temperatura el material se comporta como un sólido rígido, sin embargo por
encima de ésta, sus cadenas poliméricas adquieren movimientos locales y el
material gana elasticidad. También se observan dos fluctuaciones a 136.9 y 242 ºC
debida a una transición exotérmica y endotérmica respectivamente.
40
0 50 100 150 200 250 300 350
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
Fluj
o de
Cal
or (m
W)
Temperatura (ºC)
Figura 9. Termograma de calorimetría de barrido diferencial para el hidrogel 20%.
6.5 CINETICA
DE HINCHAMIENTO
En las gráficas 4–7, se muestra el grado de hinchamiento y el contenido de agua
a diferentes condiciones de pH en función del tiempo para los hidrogeles al 10 y
20% calculado mediante las Ecuaciones 1 y 2.
0 50 100 150 200 250 300
0
10
20
30
40
Gra
do
de
Hin
cha
mie
nto
(%
)
Tiempo (min)
pH 2
pH 4
pH 7
pH 9
41
Gráfica 4. Grado de hinchamiento en función del tiempo a temperatura ambiente para el
hidrogel al 10% a diferente pH.
0 50 100 150 200 250 300
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
Co
nte
nid
o d
e A
gu
a (
%)
Tiempo (min)
pH 2
pH 4
pH 7
pH 9
Gráfica 5. Contenido de agua en función del tiempo a temperatura ambiente para el
hidrogel al 10% a diferente pH.
0 50 100 150 200 250 300
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Gra
do
de
Hin
cha
mie
nto
(%
)
Tiempo (min)
pH 2
pH 4
pH 7
pH 9
Gráfica 6. Grado de hinchamiento en función del tiempo a temperatura ambiente para el
hidrogel al 20% a diferente pH.
42
0 50 100 150 200 250 300
0
10
20
30
40
50
60C
on
ten
ido
de
Agu
a (
%)
Tiempo (min)
pH 2
pH 4
pH 7
pH 9
Gráfica 7. Contenido de agua en función del tiempo a temperatura ambiente para el
hidrogel al 20% a diferente pH.
En la gráfica 8, se puede observar cómo los hidrogeles presentan un mayor grado
de hinchamiento a valores bajos de pH , lo cual era de esperarse, debido a que a
estas concentraciones de iones hidronio los grupos aminos libres se encontrarían
protonados provocando una repulsión entre las cadenas poliméricas, permitiendo
la absorción de una mayor cantidad de liquido; También se observa que el
hidrogel al 10% presenta un mayor grado de hinchamiento que el hidrogel al 20%,
debido a que el entrecruzamiento es menor (Tabla 4) lo que permite un tamaño de
poro mayor, facilitando así la absorción de liquido.
43
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
26
28
30
32
34
36
38
40
42
Gra
do d
e H
inch
amie
nto
(%)
pH
10%
20%
Gráfica 8. Variación del hinchamiento en función del pH a temperatura ambiente, para los
hidrogeles obtenidos.
Una vez obtenido el grado de hinchamiento de los hidrogeles, se determina el
orden en la cinética de hinchamiento de estos materiales para poder establecer
que fenómenos controlan este proceso. Por lo tanto, para una cinética de primer
orden, la velocidad de hinchamiento (dw/dt) es directamente proporcional a la
capacidad máxima de hinchamiento, es decir:
Ecuación 7.
Realizando la respectiva separación de variables y posterior integración de la
Ecuación 7 se obtiene una expresión (Ecuación 8) muy similar a la establecida por
la ley de Fick para el hinchamiento por difusión de películas unidimensionales
(Ecuación 10), en donde D es el coeficiente de difusión del solvente y h es el
espesor de la pastilla [54].
44
Ecuación
8.
Ecuación 9.
Comparando las dos ecuaciones (8 y 9), se puede establecer que la constante de
proporcionalidad de la ecuación 8 es igual a ; debido a que el espesor y el
coeficiente de difusión son constantes.
De acuerdo a lo anterior, mediante la gráfica de en función del
tiempo para cada hidrogel a diferentes valores de pH se puede establecer si la
cinética de hinchamiento de estos materiales es de primer orden.
0 20 40 60 80 100
0
1
2
3
4
5
6
ln(W
/(W-W
))
Tiempo (min)
pH 2
pH 4
pH 7
pH 9
Gráfica 9. Cinética de hinchamiento de primer orden para el hidrogel al 10%.
45
0 20 40 60 80 100 120
0
1
2
3
4
5
6
7ln
(W/(
W-W
))
Tiempo (min)
pH 2
pH 4
pH 7
pH 9
Gráfica 10. Cinética de hinchamiento de primer orden para el hidrogel al 20%.
De las graficas 9 y 10 se deduce que la cinética de hinchamiento de los materiales
no se ajusta a una de primer orden, debido a que la pendiente de estas curvas no
es constante, lo que quiere decir que el proceso de hinchamiento no se encuentra
controlado solamente por fenómenos de difusión.
De acuerdo a lo anterior, se determina si la cinética de hinchamiento es de
segundo orden, en donde en este caso, la velocidad de hinchamiento (dW/dt) es
directamente proporcional al cuadrado de la capacidad de hinchamiento del
material, es decir:
Ecuación 10.
Realizando la respectiva separación de variables, posterior integración y arreglo
de la Ecuación 10 se obtiene una expresión (Ecuación 11), la cual se puede dividir
por para obtener una ecuación lineal de la forma Y=mx +b (Ecuación 12).
46
Ecuación
11.
Ecuación 12.
De acuerdo a lo anterior, mediante la gráfica en función del tiempo para cada
hidrogel a diferentes concentraciones de hidronio se puede establecer si la
cinética de hinchamiento de las redes poliméricas es de segundo orden, ya que
se esperaría obtener una línea recta.
0 50 100 150 200 250 300
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
t / w
(m
in)
Tiempo (min)
pH 2
pH 4
pH 7
pH 9
Gráfica 11. Cinética de hinchamiento de segundo orden para el hidrogel al 10%.
Tabla 13. Resultados de la regresión lineal de la grafica 11.
pH Pendiente Intercepto (min) Coeficiente de
Correlación Valor Error Valor Error
2 0,02319 2,23E-04 0,357 0,0285 0,998 4 0,02591 3,28E-04 0,319 0,04184 0,996 7 0,02821 4,88E-04 0,469 0,06229 0,993 9 0,03193 5,51E-04 0,564 0,07043 0,993
47
En las gráficas 11 y 12 se observa claramente un comportamiento lineal para
todas las curvas, lo que establece que la cinética de estos materiales es de
segundo orden.
0 50 100 150 200 250 300
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
t / w
(m
in)
Tiempo (min)
pH 2
pH 4
pH 7
pH 9
Gráfica 12. Cinética de hinchamiento de segundo orden para el hidrogel al 20%.
Tabla 14. Resultados de la regresión lineal de la grafica 12.
pH Pendiente Intercepto Coeficiente de
Correlación Valor Error Valor Error
2 0,02400 5,44E-04 0,52745 0,06948 0,989 4 0,02644 6,98E-04 0,51762 0,08916 0,984 7 0,02921 7,30E-04 0,52247 0,09331 0,987 9 0,03273 9,04E-04 0,7197 0,11544 0,983
A partir del valor del intercepto y la pendiente de las curvas de las gráficas 11 y 12
se puede calcular la constante de velocidad reemplazando los valores obtenidos
en la Ecuación 12.
48
Tabla 15. Constante de velocidad de los hidrogeles.
pH K x10-3
(min-1
)
ERP-H02 ERP-H04
2 1.51 1.09 4 2.10 1.35 7 1.70 1.63 9 1.81 1.49
Al comparar los valores reportados en la Tabla 16, se observa que al aumentar el
porcentaje de entrecruzamiento de los materiales poliméricos disminuye la
constante de velocidad de hinchamiento, lo cual se debe a que al aumentar la
densidad de entrecruzamiento aumenta la resistencia de elongación del material y
disminuye el tamaño del poro, disminuyendo la velocidad con que el líquido
penetra a la red polimérica.
6.6 ESTUDIOS DE LIBERACION IN VITRO
6.6.1 Modelo Matemático
El proceso de liberación a partir de materiales poliméricos se encuentra controlado
a partir de fenómenos de difusión, para lo cual se estudia esta cinética mediante el
modelo matemático descrito por la ley de Fick (Ecuacion 13) Sin embargo esta
ecuación es válida sólo cuando las propiedades de la difusión son las mismas en
cualquier punto del sistema, es decir, cuando se trata de un sistema isotrópico
[55].
Ecuación
13.
49
Otra ecuación estudiada para sistemas de liberación en donde el periodo de
tiempo no es tan largo y la forma geométrica de los hidrogeles es pastilla o
cilindros, se puede deducir a partir de la segunda ley de Fick
Ecuación
14.
En donde k es una constante relacionada entre el material y la disolución y n es el
modo de transporte de la sustancia que se desee liberar, el cual determina el
mecanismo de difusión, debido a que si n presenta un valor de 0.5 el mecanismo
de difusión es Fickiano, si n es diferente de 0.5 el mecanismo de difusión es
anómalo o no Fickiano y si n es igual a 1, se considera que el mecanismo de
difusión es Schott [59].
Este modo de transporte se puede determinar aplicando logaritmo natural a ambos
lados de la Ecuación 14 y reordenando para obtener la Ecuación 15, la cual
presenta la forma Y = mx + b.
Ecuación
15
6.6.2 Liberación de Cefalexina monohidratada
Para obtener los perfiles de liberación de cefalexina monohidratada se determino
las absorbancias a una longitud de onde de 261nm en función del tiempo, y de
este modo obtener la concentración del principio activo liberado respecto al
tiempo, se construyó una curva de calibración con soluciones de concentración
conocida en un rango de 10 a 90 ppm.
50
0 20 40 60 80 100
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
Abs
orba
ncia
(U
A)
Concentracion (ppm)
Gráfica 13. Curva de calibración.
Tabla 16. Resultados de la regresión lineal de la grafica 13.
Ecuación
Parámetro Valor Error
Pendiente 0.02083 6.0x10-4
Intercepto 0.0223 0.03
r 0.9987
La cantidad de fármaco absorbido por el hidrogel se puede calcular mediante la
determinación del volumen y la concentración de la solución remanente del
proceso de incorporación del fármaco al hidrogel.
Tabla 17. Cantidad de Fármaco absorbido por hidrogel.
Hidrogel
Volumen Remanente (mL)
Concentración Remanente (g/mL)
Cantidad Fármaco (X10 mg)
10% 24.5 9,89 E-04 8,70
20% 24.7 9,92 E-04 5,97
51
Mediante los valores obtenidos de absorbancia y la ecuación de la curva de
calibración se determina la concentración de cefalexina durante el proceso de
liberación y con esto se calcula y grafica la fracción del fármaco liberado en
función del tiempo; En esta gráfica se observa que la cantidad de fármaco
liberado a tiempo corto es lineal, pero al transcurso de los minutos se pierde dicha
linealidad.
0 20 40 60 80
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Mt/M
Tiempo (h)
10%
20%
Gráfica 14. Cinética de liberación de cefalexina monohidratada desde los hidrogeles
obtenidos a pH 7.4 y 37°C.
52
2 3 4 5 6 7 8 9
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
lN(M
t/M
ln(t/t0)
10%
20%
Gráfica 15. Representación de ln{Wt/Wα} en función de ln t, para la liberación de
cefalexina monohidratada desde los hidrogeles obtenidos a pH 7.4 y 37°C.
Tabla 18. Resultados de la regresión lineal de la grafica 15.
Parámetro
Hidrogel
ERP-H02 ERP-H04
Valor Error Valor Error
Pendiente 0,1276 0,00901 0,12177 0,00723
Intercepto -0,88658 0,03283 -0,75526 0,02635 r 0.899 0.925
Con la gráfica 15 y los valores reportados en la tabla 18 se puede observar
claramente que el proceso de liberación a tiempos cortos adquiere una mayor
tendencia lineal lo cual indica que en los primeros estadíos el proceso está
controlado por el fenómeno de difusión a diferencia de los tiempos prolongados, y
para estos procesos de liberación el mecanismo de difusión es anómalo, de
acuerdo con los valores obtenidos para las pendientes de las curvas de la grafica
15, las cuales corresponden al modo de transporte.
53
7. CONCLUSIONES
La utilización de un diseño experimental para optimizar la de extracción y
deacetilación de la quitina presente en el micelio Aspergillus níger por medio de
hidrólisis básica, estableció que las mejores condiciones fueron tiempos de
reacción, concentración de hidróxido de sodio de 4 horas, 40%p/v
respectivamente; además se determinó que el ácido clorhídrico es más adecuado
para este proceso de extracción.
La extracción de quitosano exhibió un aumento en el porcentaje de rendimiento
(4.25%) a comparación con trabajos previos (1.07%), debido las mejoras
establecidas en este proceso: agitación mecánica, tiempos de reacción y etapas
de lavado y secado.
El polímero extraído se identificó mediante técnicas espectroscópicas presentando
un peso molecular promedio viscoso (Mv), grado de deacetilación y porcentaje de
nitrógeno de 1.15x105g/mol, 76.33%, 4,76% respectivamente.
Se sintetizaron y caracterizaron hidrogeles de quitosano entrecruzado
covalentemente con glutaraldehído por reacción de entrecruzamiento químico, los
cuales presentaron una respuesta selectiva al pH de la solución, ya que el grado
de hinchamiento aumento a medida que el pH disminuía.
Los sistemas poliméricos presentaron una cinética de hinchamiento de primer
orden a tiempos cortos y de segundo orden para tiempos prolongados. Además se
observo que el grado y la velocidad de hinchamiento y el porcentaje de absorción
del fármaco fueron mayores para el hidrogel ERP-H02 el cual presentaba el menor
porcentaje de agente entrecruzante, y por lo tanto mayor tamaño de poro.
El proceso de liberación de cefalexina a partir de los hidrogeles sintetizados
mediante las condiciones establecidas fue controlado por fenómenos de difusión
anómala para tiempos cortos.
54
8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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